İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için
Summary
İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.
Abstract
Konfokal görüntüleme ile bağırsağın intravital mikroskobu, canlı hayvanlarda epitel hücre dökülmesi ve bariyer kaçağının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, anestezik farelerin bağırsak mukozası topikal olarak spesifik olmayan boyama (acriflavine) ve floresan izleyici (rhodamine-B dextran), tuzlu çözelti-durulanmış plaka üzerine monte ve doğrudan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bu teknik, ağızdan uygulanan izleyicilerin transmukozal geçişi gibi bağırsak geçirgenliğinin sızıntısını belirlemek için diğer non-invaziv teknikleri tamamlayabilir. Bunun yanı sıra, burada sunulan yaklaşım gerçek zamanlı olarak hücre dökülme olayları doğrudan gözlem sağlar. Uygun floresan muhabir fareler ile birlikte, bu yaklaşım hücresel ve moleküler mekanizmalar bağırsak epitel hücre ekstrüzyon kontrol içine ışık dökülmesi için uygundur, yanı sıra diğer biyolojik süreçler. Son yıllarda, intravital mikroskopi kullanarak ilginç çalışmalar endotel geçirgenliği hakkında bilgi katkıda bulunmuştur, bağışıklık hücresi bağırsak homing, bağışıklık-epitel iletişim ve luminal bileşenlerin invazyonu, diğerleri arasında. Burada sunulan protokol, sadece epitel hücre ekstrüzyonunu kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer dokularda bile diğer son derece dinamik hücresel süreci görselleştirmek için araç olarak kullanılacak diğer yaklaşımların gelişimsel temelini de oluşturacaktır. Teknik sınırlamalar arasında, belirli dokunun optik özelliklerinin yanı sıra seçilen görüntüleme teknolojisi ve mikroskop yapılandırması da görüntüleme çalışma mesafesini ve edinilmiş görüntülerin çözünürlüğünü belirleyecektir.
Introduction
Bağırsak, çatışan süreçleri sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir işlevi olan son derece uzmanlaşmış bir organdır, yani beslenme ve zararlı luminal maddelere karşı koruma. Insan vücudu ve çevre arasında astar, bağırsak epitel fiziksel ve immünolojik bariyer olarak davranır ve bağırsakta mukozal homeostaz bakımına katkıda bulunur1,2. Epitel bütünlüğü kaybı ve artan sıkı kavşak geçirgenliği iyi Inflamatuar Barsak Hastalığı ile ilişkili olduğu bilinmektedir (IBD)3,4,5,6. Epitel değişiklikler daha sonra NEDEN ve İBH kronik bağırsak iltihabı için ikincil amplifikatör olarak kabul edilir. Böylece, IBD hastalarının bağırsaklarında erken epitel değişikliklerin geliştirilmiş bir anlayış güvenilir tahmin ve IBD relaps sonraki önlenmesi için epitel bütünlüğünü geri yüklemek için yeni stratejiler geliştirilmesi için büyük bir değer olacaktır.
Bağırsak epitelkarmaşık ve sıkı düzenlenmiş ciro süreci izler. Crypt alttan, ölümcül farklılaşmış bağırsak epitel hücreleri (IECs) pluripotent kök hücrelerden elde edilen villus ucu, yaşlı / hasarlı hücreler lümen içine dökülür yukarı doğru göç7. Bölünme ve hücre ekstrüzyonu arasındaki denge bağırsak epitel hücre sayılarının sürdürülmesini sağlar, boşluk ve sızıntı oluşumunu kaçınarak, yanı sıra potansiyel hücre kitleleri ve tümörigenez 8 yol açan epitel hücrelerinin birikimi8,9,10. Bağırsak epitelinin fizyolojik yenilenmesinde epitel hücrelerinin dökülmesinin kilit rolüne rağmen, villus ucundaki hücrelerin ekstrüzyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgi sınırlıdır. Bu nedenle, epitel hücre dökülme dahil moleküler olayların dizisinin kesin bir açıklamasını sağlayan temel araştırma için bir ihtiyaç vardır.
Bağırsak mukozası içinde farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler epitel ciro ve intestinal homeostaz düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak için anahtardır. Bu bağlamda in vivo çalışmaları in vitro ve ex vivo yaklaşımlara göre yüksek avantajlar sunmaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı görüntüleme teknikleri belirli olayları kontrol olayların dizisinin açıklamasını sağlar. Bu bağlamda, son derece dinamik süreçlerin incelenmesi, dokunun doğrudan gözlemlenmesi için optimize edilmiş yüksek çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını gerektirir. İntravital görüntüleme teknikleri bağırsakta epitel hücre dökülmesi çalışma için benzersiz uygun araçlar olarak görünür.
“İntravital mikroskopi” terimi, canlı bir hayvan ın içindeki hücre ve dokuları doğrudan görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden (multifoton veya konfokal mikroskopi) yararlanan deneysel yaklaşımları ifade eder11. In vivo bilgilerin in vivo çözünürlüğe kadar gerçek zamanlı olarak elde edilmesini sağlar ve statik veya düşük çözünürlüklü yöntemlere göre net avantajlar sağlar. İntravital mikroskopi tamamlayıcı bilgi sağlar ve klasik ve / veya high-end teknikleri bazı sınırlamalar aşmak, doku işleme nedeniyle eserler gibi. Buna karşılık, intravital mikroskopi nin ana sınırlama doku doğrudan mikroskopa maruz olması gerektiğini, hangi çoğu durumda cerrahi gerektirir. Sofistike yaklaşımlar canlılığı korumak ve görüntülenmiş doku etkisini en aza indirmek rağmen (skinfold odaları ve görüntüleme pencereleri)12,13, çoğu durumda basit bir deri kesi doku (deri flepleri) dışsallaştırma için yapılır14. Son on yılda, bu yaklaşımlar daha önce anlaşılmaz olan son derece dinamik süreçler hakkında önemli kanıtlar alabildi. Çeviri, gerçek zamanlı görüntüleme kök hücre ve lökositler homing yeni biyolojik anlayışlar sağlanan15, yanı sıra kanser yayma ve metastaz oluşumu13,16. Klinik bağlamda, endomikroskopi şu anda kanser tanı aracı olarak istismar17 ve gastrointestinal hastalıklar, IBD gibi18,19; konfokal mozaik mikroskopi cerrahi sırasında hızlı bir patoloji aracı haline geldiiken 20. Birlikte, intravital mikroskopi son zamanlarda klinikte biyomedikal araştırma ve gelecekteki uygulama için değerli ve çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır.
İntravital mikroskopi burada intestinal epitel kaçağının gerçek zamanlı görüntülenmesi ve epitel hücre dökülme olaylarının gözlemlenmesi için uygulanmaktadır. Bağırsak geçirgenliğinin kaçağı, serum21’dekifloresan izleyicilerin sözlü olarak uygulanması gibi diğer in vivo noninvaziv teknikler ile tespit edilebilir. Ancak, bu teknik dökülme performansı nın doğrudan gözlemine veya para-ve hücre içi geçirgenlik arasındaki ayrımına izin vermez. Standart izleyici deneyleri ve intravital mikroskopi kombinasyonu uygun bir yaklaşımı temsil eder: i) bağırsak geçirgenliği bozuklukları tanımlamak, ve ii) para arasında ayırmak- ve trans-hücre içi geçirgenlik. Hücre dökülmesinin yanı sıra, in vivo floresan etiketleme ile birlikte intravital mikroskopi diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların çalışmasını sağlar (örneğin, floresan muhabir fareler kullanarak hücre dökülmesi sırasında sıkı kavşak yeniden dağılımı22 veya bağırsak mukozası içindeki IEC’ler ve diğer hücreler arasındaki etkileşimler23).
Burada sunulan yöntem, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak bağırsak mukozasının gerçek zamanlı gözlemini sağlamak için intravital mikroskopinin bir adaptasyonunu temsil etmektedir. Bu nedenle, ggtase koşullu knock-out fareler kullanın (Geranylgeranyltransferaze) bağırsak epitel hücrelerinde(IECs)iΔIEC içinde, onlar ciddi bir bağırsak hastalığı muzdarip ve artmış epitel geçirgenliği muzdarip beri24. Farenin cerrahi olarak hazırlanması ve bağırsak mukozasının boyanışı, görüntüleme kazanımı ve kazanım sonrası analiziçin kullanılan uygun ayarlar anlatılmaktadır. Bu protokol, bağırsak epitel hücresi dökülmesinin dinamiği ve kinetikleri hakkında güncel bilgilere katkıda bulunan gelecekteki çalışmalara olanak sağlayabilir. Ayrıca, protokol bağırsak mukozası yüzeyinde meydana gelen diğer olayları incelemek için çeşitli adaptasyonlar için bir temel olarak hizmet verebilir, ve hatta diğer dokularda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknik olarak zorlu olsa da, intravital mikroskopi tabanlı metodoloji, hücre dökülme performansı gibi son derece dinamik hücresel süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için benzersiz bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Şimdiye kadar hücre ekstrüzyonunu in vivo görselleştirmek için alternatif bir deneysel yaklaşım yoktur. Bu protokolün bağırsak homeostazının korunmasında rol oynayan çeşitli hücresel süreçlerin tanımlanmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği’nin Yedinci Çerçeve Programı’nın (FP7/2007-2013) 302170 sayılı REA hibe anlaşması kapsamında İnsan Programı’ndan (Marie Curie Eylemleri) fon almıştır; Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (İZKF); Ortak Araştırma Merkezi TRR241 ve Alman Araştırma Konseyi’nin (DFG) KFO257 Klinik Araştırma Grubu; ve DFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation?. Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn’s disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn’s disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!. Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
