Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali
Summary
Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.
Abstract
La microscopia intravitale dell’intestino con imaging confocale consente l’osservazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali e la perdita di barriere negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale dei topi anestetizzati è macchiata localmente con colorazione non specifica (acriflavina) e un tracciante fluorescente (rodiammina-B dextran), montato su una piastra risciacquata a soluzione salina e direttamente immaginato utilizzando un microscopio confocale. Questa tecnica può integrare altre tecniche non invasive per identificare la perdita di permeabilità intestinale, come il passaggio transmucoso di traccianti somministrati per via orale. Oltre a questo, l’approccio qui presentato consente l’osservazione diretta degli eventi di spargimento di cellule in tempo reale. In combinazione con appropriati topi reporter fluorescenti, questo approccio è adatto per far luce nei meccanismi cellulari e molecolari che controllano l’estrusione delle cellule epiteliali intestinali, nonché in altri processi biologici. Negli ultimi decenni, studi interessanti che utilizzano la microscopia intravitale hanno contribuito alla conoscenza della permeabilità endoteliale, del homing intestinale delle cellule immunitarie, della comunicazione immuno-epiteliale e dell’invasione dei componenti luminali, tra gli altri. Insieme, il protocollo qui presentato non solo aiuterebbe ad aumentare la comprensione dei meccanismi che controllano l’estrusione cellulare epiteliale, ma potrebbe anche essere la base per lo sviluppo di altri approcci da utilizzare come strumenti per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici, anche in altri tessuti. Tra le limitazioni tecniche, le proprietà ottiche del tessuto specifico, così come la tecnologia di imaging selezionata e la configurazione del microscopio, determinerebbero a loro volta la distanza di lavoro dell’imaging e la risoluzione delle immagini acquisite.
Introduction
L’intestino è un organo altamente specializzato con una funzione strettamente regolata che consente processi contrastanti, vale a dire nutrizione e protezione contro le sostanze luminali nocive. Foderando tra il corpo umano e l’ambiente, l’epitelio intestinale agisce come barriera fisica e immunologica e contribuisce al mantenimento dell’omeostasi mucosanell’intestino 1,,2. La perdita di integrità epiteliale e l’aumento della permeabilità alla giunzione stretta sono ben noti per essere associati alla malattia infiammatoria intestinale (IBD)3,,4,,5,,6. Le alterazioni epiteliali sono quindi considerate cause e amplificatori secondari per l’infiammazione intestinale cronica nell’IBD. Pertanto, una migliore comprensione delle prime alterazioni epiteliali nell’intestino dei pazienti affetti da IBD sarebbe di immenso valore per lo sviluppo di nuove strategie per ripristinare l’integrità epiteliale per una previsione affidabile e la successiva prevenzione delle ricadute dell’IBD.
L’epitelio intestinale segue un processo di turnover complesso e strettamente regolato. Dal fondo della cripta, le cellule epiteliali intestinali differenziate terminale (IEC) derivate da cellule staminali pluripotenti migrano verso l’alto verso la punta del villus, dove le cellule invecchiate / danneggiate vengono versate nel lume7. L’equilibrio tra divisione ed estrusione cellulare consente il mantenimento del numero di cellule epiteliali intestinali, evitando la formazione di spazi vuoti e perdite, nonché l’accumulo di cellule epiteliali che potenzialmente portano a masse cellulari e tumorigenesi8,,9,,10. Nonostante il ruolo chiave dello spargimento di cellule epiteliali nel fisiologico rinnovamento dell’epitelio intestinale, la conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano l’estrusione delle cellule sulla punta del villus è limitata. Pertanto, è necessaria una ricerca di base che fornisca una descrizione precisa della sequenza di eventi molecolari coinvolti nello spargimento di cellule epiteliali.
Interazioni complesse tra diversi tipi di cellule all’interno della mucosa intestinale sono fondamentali per comprendere i meccanismi molecolari che regolano il turnover epiteliale e l’omeostasi intestinale. Pertanto, gli studi in vivo offrono alti vantaggi rispetto agli approcci in vitro ed ex vivo in questo contesto. Inoltre, le tecniche di imaging in tempo reale consentono la descrizione della sequenza di eventi che controllano fenomeni specifici. In questo contesto, lo studio di processi altamente dinamici richiede l’utilizzo di tecniche ottimizzate ad alta risoluzione per l’osservazione diretta del tessuto. Le tecniche di imaging intravitale appaiono come strumenti adatti unici per lo studio dello spargimento di cellule epiteliali nell’intestino.
Il termine “microscopia intravitale” si riferisce ad approcci sperimentali che sfruttano le tecniche di imaging ad alta risoluzione (microscopia multifotonale o confocale) per visualizzare direttamente cellule e tessuti nei loro dintorni nativi all’interno di un animalevivente 11. Consente l’acquisizione in tempo reale di informazioni in vivo fino alla risoluzione a cella singola e comporta chiari vantaggi rispetto ai metodi statici o a bassa risoluzione. La microscopia intravitale fornisce informazioni complementari e supera alcune limitazioni delle tecniche classiche e/o di fascia alta, come gli artefatti dovuti alla lavorazione dei tessuti. Al contrario, la principale limitazione della microscopia intravitale è che il tessuto deve essere direttamente esposto al microscopio, che nella maggior parte dei casi richiede un intervento chirurgico. Sebbene approcci sofisticati conservino la vitalità e minimizzino l’impatto del tessuto immaginato (camere scuoiate e finestre di imaging)12,,13, nella maggior parte dei casi viene eseguita una semplice incisione cutanea per l’esternalizzazione del tessuto (lembi della pelle)14. Nell’ultimo decennio, questi approcci hanno fornito prove chiave su processi altamente dinamici, che in precedenza erano imperscrutabili. Traslazione, l’imaging in tempo reale ha fornito nuove intuizioni biologiche su cellule staminali e leucociti che hannoaffinato 15, nonché la diffusione del cancro e la formazione di metastasi13,,16. Nel contesto clinico, l’endomicroscopia è attualmente sfruttata come strumento diagnostico delcancro 17 e delle malattie gastrointestinali, come l’IBD18,19; mentre la microscopia a mosaico confocale è diventata uno strumento di patologia rapida durante l’interventochirurgico 20. Insieme, la microscopia intravitale è recentemente emersa come uno strumento prezioso e versatile per la ricerca biomedica e l’applicazione futura in clinica.
La microscopia intravitale è qui implementata per la visualizzazione in tempo reale della perdita epiteliale intestinale e l’osservazione di eventi di spargimento di cellule epiteliali. La perdita di permeabilità intestinale può essere identificata da altre tecniche in vivo non invasive, come la quantificazione della somministrazione orale di traccianti fluorescenti nel siero21. Tuttavia, questa tecnica non consente l’osservazione diretta delle prestazioni di spargimento né la segregazione tra permeabilità para- e transcellulare. La combinazione di esperimenti di tracciante standard e microscopia intravitale rappresenta un approccio adeguato a: i) identificare i disturbi nella permeabilità intestinale e ii) separare tra permeabilità epiteliale para- e transcellulare. Oltre allo spargimento di cellule, la microscopia intravitale in combinazione con l’etichettatura a fluorescenza in vivo consente lo studio di altri meccanismi cellulari e molecolari (ad esempio, una stretta ridistribuzione della giunzione durante lo spargimento di cellule utilizzando topi reporter fluorescenti22 o interazioni tra IEC e altre cellule all’interno della mucosa intestinale23).
Il metodo qui presentato rappresenta un adattamento della microscopia intravitale per consentire l’osservazione in tempo reale della mucosa intestinale, utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Pertanto, usiamo topi knock-out condizionali di GGTasi (Geranylgeraniltransferasi) nelle cellule epiteliali intestinali (IEC) in(topi Pggt1biΔIEC), poiché soffrono di una grave malattia intestinale e di una maggiore permeabilità epiteliale24. Vengono descritti la preparazione chirurgica del topo e la colorazione della mucosa intestinale, nonché le impostazioni appropriate utilizzate per l’acquisizione dell’imaging e l’analisi post-acquisizione. Questo protocollo potrebbe consentire studi futuri che contribuiscono alle attuali conoscenze sulla dinamica e cinetica dello spargimento di cellule epiteliali intestinali. Inoltre, il protocollo potrebbe servire come base per vari adattamenti per studiare altri fenomeni che si verificano sulla superficie della mucosa intestinale e persino in altri tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene tecnicamente impegnativa, la metodologia basata sulla microscopia intravitale rappresenta un approccio sperimentale unico per visualizzare il processo cellulare altamente dinamico in tempo reale, come le prestazioni di spargimento di cellule. Finora, non esiste un approccio sperimentale alternativo per visualizzare l’estrusione cellulare in vivo. Crediamo che questo protocollo possa contribuire alla descrizione di diversi processi cellulari che svolgono un ruolo nel mantenimento dell’omeostasi intestinale.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Programma Persone (Azioni Marie Curie) nell’ambito della sovvenzione REA numero 302170 del Settimo Programma Quadro dell’Unione Europea (7PQ/2007-2013); il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) dell’Università Erlangen-Norimberga; il Centro di Ricerca Collaborativa TRR241 e il Gruppo di Ricerca Clinica KFO257 del German Research Council (DFG); e il DFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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