Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamineB-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Intravital mikroskopi af tarmen ved hjælp af konfokale billeddannelse giver realtid observation af epitelcelle udgydelse og barriere lækage i levende dyr. Derfor er tarmslimhinden af bedøvede mus topisk plettet med uspecifik farvning (acriflavine) og en fluorescerende sporstof (rhodamine-B dextran), monteret på en saltvandsopløsning-skyllet plade og direkte afbildet ved hjælp af et konfokal mikroskop. Denne teknik kan supplere andre ikke-invasive teknikker til at identificere lækage af intestinal permeabilitet, såsom transmucosal passage af oralt administrerede tracer… Ud over dette, den tilgang, der præsenteres her giver mulighed for direkte observation af celle kaste begivenheder i realtid. I kombination med passende fluorescerende reporter mus, denne fremgangsmåde er velegnet til at kaste lys i cellulære og molekylære mekanismer, der styrer intestinal epitelcelle ekstrudering, samt til andre biologiske processer. I de sidste årtier har interessante undersøgelser ved hjælp af intravital mikroskopi bidraget til viden om endotelperabilitet, immuncelle gut homing, immun-epitel kommunikation og invasion af luminal komponenter, blandt andre. Sammen vil den protokol, der præsenteres her, ikke blot bidrage til at øge forståelsen af mekanismer, der styrer epitelcelleudtrudering, men også kunne danne grundlag for udvikling af andre tilgange, der skal anvendes som instrumenter til at visualisere andre meget dynamiske cellulære proces, selv i andre væv. Blandt de tekniske begrænsninger, optiske egenskaber af det specifikke væv, samt den valgte billeddannelse teknologi og mikroskop konfiguration, ville igen, bestemme billeddannelse arbejdsafstand, og opløsning af erhvervede billeder.
Tarmen er et højt specialiseret organ med en stramt reguleret funktion, der muliggør modstridende processer, nemlig ernæring og beskyttelse mod skadelige luminalstoffer. Foring mellem den menneskelige krop og miljøet, tarmepitel fungerer som en fysisk og immunologisk barriere og bidrager til opretholdelsen af slimhinde homøostase itarmen 1,,2. Tab af epitelintegritet og øget tæt vejkrydspermeabilitet er velkendt for at være forbundet med inflammatorisk tarmsygdom (IBD)3,4,5,6. Epitelændringer betragtes derefter som årsager og sekundære forstærkere til kronisk tarmbetændelse i IBD. Således, en forbedret forståelse af tidlige epitelændringer i tarmen af IBD patienter ville være af enorm værdi for udviklingen af nye strategier til at genoprette epitelintegritet for pålidelig forudsigelse og efterfølgende forebyggelse af IBD tilbagefald.
Intestinal epitel følger en kompleks og stramt reguleret omsætningsproces. Fra kryptbunden, terminalt differentierede tarm epitelceller (IEC’ er) stammer fra pluripotente stamceller migrere opad til villus spids, hvor alderen / beskadigede celler er kastet i lumen7. Ligevægten mellem deling og celle ekstrudering gør det muligt at opretholde tarm epitelcelletal, undgå dannelsen af huller og lækage, samt ophobning af epitelceller potentielt fører til cellemasser og tumorigenesis8,9,10. På trods af den centrale rolle epitelcelleudsedeling i den fysiologiske fornyelse af tarmepitelet er kendskabet til de molekylære mekanismer, der driver ekstruderingen af celler på villus-spidsen, begrænset. Der er således behov for grundforskning, der giver en præcis beskrivelse af rækkefølgen af molekylære hændelser, der er involveret i epitelcelleudgydelse.
Komplekse interaktioner mellem forskellige celletyper i tarmslimhinden er nøglen til at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer epitelomsætning og tarmhomøostase. In vivo-undersøgelser giver således store fordele i forhold til in vitro- og ex vivo-tilgange i denne sammenhæng. Desuden giver realtidsbilleddannelsesteknikker mulighed for beskrivelse af rækkefølgen af begivenheder, der styrer specifikke fænomener. I denne sammenhæng kræver studiet af meget dynamiske processer brugen af optimerede højopløsningsteknikker til direkte observation af vævet. Intravital billeddannelse teknikker fremstå som unikke egnede værktøjer til undersøgelse af epitelcelle kaste i tarmen.
Udtrykket “intravital mikroskopi” henviser til eksperimentelle tilgange, der udnytter billedbehandlingsteknikker med høj opløsning (multiphoton eller konfokal mikroskopi) til direkte at visualisere celler og væv i deres oprindelige omgivelser i et levende dyr11. Det muliggør realtidserhvervelse af in vivo-oplysninger op til encelleløsning og medfører klare fordele i forhold til statiske eller lave opløsningsmetoder. Intravital mikroskopi giver supplerende oplysninger og overvinde nogle begrænsninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, såsom artefakter på grund af vævsbehandling. I modsætning hertil er den vigtigste begrænsning af intravital mikroskopi, at vævet skal være direkte udsat for mikroskopet, som i de fleste tilfælde kræver operation. Selv om sofistikerede tilgange bevare vitalitet og minimere virkningen af det afbildede væv (skinfold kamre og billeddannelse vinduer)12,13, i de fleste tilfælde en simpel hud snit udføres for eksternalisering af vævet (hud flapper)14. I det seneste årti har disse tilgange bidraget med nøglevidne om meget dynamiske processer, som tidligere var uudgrundelige. Translationelt, real-time billeddannelse forudsat nye biologiske indsigter på stamceller og leukocytter homing15, samt kræft formidling og metastasedannelse 13,16. I den kliniske sammenhæng udnyttes endomikroskopi i øjeblikket som et diagnostiskværktøj for kræft 17 og gastrointestinale sygdomme, såsom IBD18,19; mens konfokale mosaicking mikroskopi blev en hurtig patologi værktøj under kirurgi20. Sammen har intravital mikroskopi på det seneste vist sig som et værdifuldt og alsidigt værktøj til biomedicinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementeret for real-time visualisering af intestinal epitellækage og observation af epitelcelle kaste begivenheder. Udsivning af intestinal gennemtrængelighed kan identificeres ved hjælp af andre in vivo noninvasive teknikker, såsom kvantificering af mundtlig administration af fluorescerende stoffer i serum21. Denne teknik gør det imidlertid ikke muligt at foretage direkte observation af udskillelsen af ydeevnen eller adskillelsen mellem para- og transcellulær permeabilitet. Kombinationen af standardsporingsforsøg og intravital mikroskopi repræsenterer en passende tilgang til: i) identificere forstyrrelser i tarmpermeabilitet og ii) adskille mellem para- og transcellulære epitelperabilitet. Ud over celleudgydelse muliggør intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmærkning studiet af andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks. tæt krydsfordeling under celleudgydelse ved hjælp af fluorescerende reportermus22 eller interaktioner mellem IEC’er og andre celler i tarmslimhinden23).
Den metode, der præsenteres her, repræsenterer en tilpasning af intravital mikroskopi for at muliggøre real-time observation af tarmslimhinden ved hjælp af konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM). Derfor bruger vi betingede knock-out mus af GGTase (Geranylgeranyltransferase) i intestinal epitelceller (IEC’ er) i (Pggt1biΔIEC mus), da de lider af en alvorlig tarmsygdom og øget epitelperabilitet24. Kirurgisk forberedelse af musen og farvning af tarmslimhinden, samt passende indstillinger, der anvendes til billeddannelse erhvervelse og post-erhvervelse analyse er beskrevet. Denne protokol kan muliggøre fremtidige undersøgelser, der bidrager til den nuværende viden om dynamik og kinetik af intestinal epitelcelleudgydelse. Desuden kunne protokollen danne grundlag for forskellige tilpasninger for at undersøge andre fænomener, der forekommer på overfladen af tarmslimhinden, og selv på andre væv.
Selv om teknisk udfordrende, intravital mikroskopi-baseret metode repræsenterer en unik eksperimentel tilgang til at visualisere meget dynamisk cellulære proces i realtid, såsom celle kaste ydeevne. Hidtil er der ingen alternativ eksperimentel tilgang til visualisering celle ekstrudering in vivo. Vi mener, at denne protokol kan bidrage til beskrivelsen af forskellige cellulære processer, der spiller en rolle i vedligeholdelsen af tarmhomostase.
Drage fordel af intravital mikroskopi, den me…
The authors have nothing to disclose.
Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra People Program (Marie Curie-aktionerne) under REA-tilskudsaftalen nummer 302170 i Eu’s syvende rammeprogram (RP7/2007-2013); det tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Det Kollaborative Forskningscenter TRR241 og den kliniske forskningsgruppe KFO257 fra det tyske forskningsråd (DFG); og DFG.
Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
LAS X | Leica | – | – |
LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
PBS | Biochrom | L182 | |
Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
Xylazin | Bayer | 1320422 |