גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל
Summary
תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.
Abstract
מיקרוסקופ תוך-ויטאל של המעיים באמצעות הדמיה קונפוקלית מאפשרת תצפית בזמן אמת על שפיכת תאים אפיתל ודליפת מחסום בבעלי חיים חיים. לכן, רירית המעיים של עכברים מרדימים מוכתמת באופן מקומי בכתמים לא ספציפיים (acriflavine) ומעקב פלורסנט (rhodamine-B dextran), המותקן על צלחת שטופת תמיסת מלח ותמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ confocal. טכניקה זו יכולה להשלים טכניקות לא פולשניות אחרות כדי לזהות דליפה של חמלה מעיים, כגון מעבר transmucosal של מעקבים דרך הדם. חוץ מזה, הגישה המוצגת כאן מאפשרת התבוננות ישירה של אירועים שפיכת תאים בזמן אמת. בשילוב עם עכברים כתב פלורסנט מתאים, גישה זו מתאימה שפיכת אור לתוך מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים בהבלטת תאי אפיתל מעיים, כמו גם תהליכים ביולוגיים אחרים. בעשורים האחרונים, מחקרים מעניינים באמצעות מיקרוסקופ תוך ויטלי תרמו לידע על חמלה אנדותל, תאי מערכת החיסון המעיים ביות, תקשורת חיסונית-אפיתל ופלישה של רכיבים זוהרים, בין היתר. יחד, הפרוטוקול המוצג כאן לא רק יעזור להגביר את ההבנה של מנגנונים השולטים בהבלטת תאים אפיתל, אלא גם יכול להיות הבסיס להתפתחות של גישות אחרות לשמש ככלים כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד אחרים, אפילו ברקמות אחרות. בין מגבלות טכניות, מאפיינים אופטיים של הרקמה הספציפית, כמו גם טכנולוגיית ההדמיה שנבחרה ותצורת מיקרוסקופ, בתורו, לקבוע את מרחק העבודה הדמיה, ורזולוציה של תמונות שנרכשו.
Introduction
המעי הוא איבר מיוחד מאוד עם פונקציה מוסדרת היטב המאפשרת תהליכים סותרים, כלומר תזונה והגנה מפני חומרים זוהרים מזיקים. רירית בין גוף האדם לסביבה, אפיתל המעי פועל כמחסום פיזי ואימונולוגי ותורם לתחזוקה של הומאוסטאזיס רירית בבטן1,,2. אובדן שלמות אפיתל וחחלת צומת הדוקה מוגברת ידוע להיות קשור עם מחלות מעי דלקתיות (IBD)3,,4,,5,,6. שינויים אפיתל נחשבים לאחר מכן כגורמים ומדלקים משניים לדלקת מעיים כרונית בIBD. לכן, הבנה משופרת של שינויים אפיתל מוקדם בבטן של חולי IBD יהיה בעל ערך עצום לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי לשחזר את שלמות האפיתל לחיזוי אמין ומניעה שלאחר מכן של נסיגה IBD.
אפיתל מעיים עוקב אחר תהליך תחלופה מורכב ומוסדר היטב. מתחתית הקריפטה, תאי אפיתל מעיים מובחן סופני (IECs) המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים נודדים כלפי מעלה אל קצה הווילוס, שם נשפכים תאיםבגילאים/פגומים לתוךהלומן 7 . שיווי המשקל בין החלוקה לבין שברי התא מאפשר תחזוקה של מספרי תאי אפיתל מעיים, הימנעות היווצרות של פערים ודליפה, כמוגם הצטברותשל תאי אפיתל שעלולים להוביל להסימת תאיםותאי גידולים 8,9,10 . למרות התפקיד המרכזי של שפיכת תאי אפיתל בחידוש הפיזיולוגי של אפיתל הבטן, הידע על המנגנונים המולקולריים המניעים את ההבלטה של תאים בקצה villus מוגבל. לכן, יש צורך במחקר בסיסי המספק תיאור מדויק של רצף האירועים המולקולריים המעורבים בהזלת תאים אפיתל.
אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים שונים בתוך ררית המעיים הם המפתח כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ויסות תחלופת אפיתל והונוסטרזיס מעיים. כך, במחקרי vivo מציעים יתרונות גבוהים על פני גישות vio ex ו-ex בהקשר זה. יתר על כן, טכניקות הדמיה בזמן אמת מאפשרות את התיאור של רצף האירועים השולטים בתופעות ספציפיות. בהקשר זה, המחקר של תהליכים דינמיים מאוד דורש את השימוש בטכניקות ברזולוציה גבוהה אופטימיזציה להתבוננות ישירה של הרקמה. טכניקות הדמיה תוך-ויטאליות מופיעות ככלים מתאימים ייחודיים לחקר שפיכת תאי האפיתל בבטן.
המונח “מיקרוסקופ תוך ויטאל” מתייחס גישות ניסיוניות ניצול של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה (multiphoton או מיקרוסקופית confocal) כדי לדמיין ישירות תאים ורקמות בסביבה המקומית שלהם בתוך בעל חייםחי 11. הוא מאפשר רכישה בזמן אמת של מידע vivo עד רזולוציה של תא יחיד, וכרוך יתרונות ברורים על פני שיטות סטטיות או ברזולוציה נמוכה. מיקרוסקופ תוך-ויטאל מספק מידע משלים ומתגבר על כמה מגבלות מטכניקות קלאסיות ו/או מתקדמות, כגון חפצים עקב עיבוד רקמות. לעומת זאת, המגבלה העיקרית של מיקרוסקופ תוך וינטלי היא כי הרקמה צריכה להיות חשופה ישירות למיקרוסקופ, אשר ברוב המקרים דורש ניתוח. למרות גישות מתוחכמות לשמר את החיוניות ולמזער את ההשפעה של הרקמה הדמיית (תאי skinfold וחלונות הדמיה)12,,13, ברוב המקרים חתך עור פשוט מבוצע עבור החיצוניזציה של הרקמה (מגני העור)14. בעשור האחרון, גישות אלה תרמו ראיות מפתח על תהליכים דינמיים מאוד, שהיו בעבר בלתי מובנים. תרגום, הדמיה בזמן אמת סיפקה תובנות ביולוגיות חדשות על תאי גזע וleukocytesביות 15, כמו גםסרטן הפצת גרורות היווצרות 13,16. בהקשר הקליני, אנדומיקרוסקופיה מנוצלת כיום ככלי אבחוןשל סרטן 17 ומחלות במערכת העיכול, כגון IBD18,19; בעוד מיקרוסקופים confocal הפך כלי פתולוגי מהיר במהלך ניתוח20. יחד, מיקרוסקופ תוך ויטאל התגלה לאחרונה ככלי רב ערך ורב-תכליתי למחקר ביו-רפואי ויישום עתידי במרפאה.
מיקרוסקופ תוך ויטאל מיושם כאן להדמיה בזמן אמת של דליפת אפיתל מעיים והתבוננות של אירועי שפיכת תאים אפיתל. דליפה של חרנטיות מעיים ניתן לזהות על ידי אחרים בטכניקות vivo פולשניות, כגון כימות של ניהול דרך האלי של מעקבי פלורסנט בסרום21. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת תצפית ישירה של ביצועים שפיכה או את ההפרדה בין חירנות para-ו trans-תאי. השילוב של ניסויי מעקב סטנדרטיים ומיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצג גישה מתאימה: i) לזהות הפרעות חחלל מעיים, ו- ii) לבודד בין חירנות אפיתל para-ו טרנס-תאי. מלבד שפיכת תאים, מיקרוסקופ תוך-וייטל בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי vivo מאפשר מחקר של מנגנונים תאיים ומולקולריים אחרים (למשל, צומת הדוק הפצה מחדש במהלך שפיכת תאיםבאמצעות עכברים כתב פלורסנט 22 או אינטראקציות בין IECs ותאים אחרים בתוך רירית העיכול23).
השיטה המוצגת כאן מייצגת התאמה של מיקרוסקופ תוך-ויטאלי כדי לאפשר תצפית בזמן אמת על רירית מעיים, באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודלי (CLSM). לכן, אנו משתמשים בעכברים מותנה נוק-אאוט של GGTase (Geranylgeranyltransferase) בתאי אפיתל מעיים (IECs) ב (Pggt1bi大IEC עכברים), מאז הם סובלים ממחלת מעיים חמורה וחדירות אפיתלמוגברת 24. הכנה כירורגית של העכבר והכתמים של ררית המעיים, כמו גם הגדרות מתאימות המשמשות לרכישת הדמיה וניתוח לאחר הרכישה מתוארים. פרוטוקול זה יכול לאפשר מחקרים עתידיים התורמים לידע הנוכחי על דינמיקה וקינטיים של שפיכת תאי אפיתל מעיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לתאמות שונות כדי ללמוד תופעות אחרות המתרחשות על פני השטח של ררית המעיים, ואפילו ברקמות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שמבחינה טכנית מאתגרת, מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצגת גישה ניסיונית ייחודית כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד בזמן אמת, כגון ביצועי שפיכת תאים. עד כה, אין גישה ניסיונית חלופית כדי לדמיין את הבלטת התא ב vivo. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לתרום לתיאור של תהליכים סלולרי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מהתוכנית “פעולות מארי קירי” במסגרת הסכם מענק REA מספר 302170 של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013); המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג; מרכז המחקר השיתופי TRR241 ו-KFO257 של מועצת המחקר הגרמנית (DFG); וה-די.אף.ג’י.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation?. Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn’s disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn’s disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!. Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
