आंतों की पारगम्यता और एपिथेलियल सेल शेडिंग प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोण
Summary
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का लाभ उठाते हुए, यहां प्रस्तुत विधि जीवित जानवरों में आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग के वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों के सामयिक रूप से दाग वाली आंतों म्यूकोसा (एक्क्रिमेन और रोडामाइन-डेक्सट्रान) को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन तक इमेज किया जाता है।
Abstract
कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके आंत की इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी एपिथेलियल सेल शेडिंग और जीवित जानवरों में बाधा रिसाव के वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देती है। इसलिए, एनेस्थेटाइज्ड चूहों की आंतों के म्यूकोसा को एक खारा समाधान-कुल्ला प्लेट पर चढ़कर और सीधे कॉन्फोसल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर (रोडामाइन-बी डेक्सट्रॉन) के साथ सामयिक रूप से दाग दिया जाता है। यह तकनीक अन्य गैर-आक्रामक तकनीकों को पूरक कर सकती है ताकि आंतों की पारिम्यता के रिसाव की पहचान की जा सके, जैसे मौखिक रूप से प्रशासित ट्रेसर्स का ट्रांसमुकोसल मार्ग। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण वास्तविक समय पर सेल शेडिंग घटनाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति देता है। उपयुक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के संयोजन में, यह दृष्टिकोण आंतों के एपिथेलियल सेल एक्सट्रूज़न के साथ-साथ अन्य जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र में प्रकाश बहाने के लिए उपयुक्त है। पिछले दशकों में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिलचस्प अध्ययनों ने एंडोथेलियल पारगम्यता, प्रतिरक्षा कोशिका आंत होमिंग, प्रतिरक्षा-एपीथेलियल संचार और चमकदार घटकों के आक्रमण पर ज्ञान में योगदान दिया है। एक साथ, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल एपिथेलियल सेल एक्सट्रूज़न को नियंत्रित करने वाले तंत्र की समझ को बढ़ाने में मदद करेगा, बल्कि अन्य ऊतकों में भी अन्य अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए उपकरणों के रूप में उपयोग किए जाने वाले अन्य दृष्टिकोणों के विकास का आधार हो सकता है। तकनीकी सीमाओं में, विशिष्ट ऊतक के ऑप्टिकल गुण, साथ ही चयनित इमेजिंग तकनीक और माइक्रोस्कोप विन्यास, बदले में इमेजिंग कामकाजी दूरी और अधिग्रहीत छवियों के संकल्प का निर्धारण करेगा।
Introduction
आंत एक अत्यधिक विशेष अंग है जिसमें एक कसकर विनियमित कार्य होता है जो परस्पर विरोधी प्रक्रियाओं को सक्षम करता है, अर्थात् हानिकारक चमकदार पदार्थों के खिलाफ पोषण और सुरक्षा। मानव शरीर और पर्यावरण के बीच अस्तर, आंतों का एपिथेलियम एक भौतिक और प्रतिरक्षा बाधा के रूप में कार्य करता है और आंत1,,2में म्यूकोसल होमोस्टेसिस के रखरखाव में योगदान देता है। एपिथेलियल अखंडता और बढ़ी हुई तंग जंक्शन पारमेबिलिटी का नुकसान भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) 3 , 4,5, 6 से जुड़ा होने के लिए अच्छीतरह,से जाना,जाताहै।5 एपिथेलियल परिवर्तन को तब आईबीडी में पुरानी आंतों की सूजन के कारण और माध्यमिक एम्पलीफायर के रूप में माना जाता है। इस प्रकार, आईबीडी रोगियों के पेट में प्रारंभिक एपिथेलियल परिवर्तनों की बेहतर समझ विश्वसनीय भविष्यवाणी और बाद में आईबीडी रिलेप्स की रोकथाम के लिए एपिथेलियल अखंडता को बहाल करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए बहुत मूल्य होगी।
आंतों के एपिथेलियम एक जटिल और कसकर विनियमित कारोबार प्रक्रिया का पालन करता है। तहखाना नीचे से, पूर्णपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त मरणासन्न विभेदित आंतों के एपिथेलियल कोशिकाएं (आईईसी) ऊपर की ओर विल्लस टिप पर स्थानांतरित हो जाती हैं, जहां वृद्ध/क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को ल्यूमेन 7 में बहायाजाताहै । विभाजन और कोशिका निष्कासन के बीच संतुलन आंतों के एपिथेलियल सेल संख्याओं के रखरखाव, अंतराल और रिसाव के गठन से बचने के साथ-साथ एपिथेलियल कोशिकाओं के संचय को संभावित रूप से सेल जनता और ट्यूमरजनन8,,9,,10तक ले जाने में सक्षम बनाता है। आंत एपिथेलियम के शारीरिक नवीकरण में एपिथेलियल सेल शेडिंग की महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, मॉलस टिप पर कोशिकाओं के निष्कासन को चलाने वाले आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान सीमित है। इस प्रकार, एपिथेलियल सेल शेडिंग में शामिल आणविक घटनाओं के अनुक्रम का सटीक विवरण प्रदान करने वाले बुनियादी अनुसंधान की आवश्यकता है।
आंतों म्यूकोसा के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत एपिथेलियल टर्नओवर और आंतों के होमोस्टेसिस को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, वीवो अध्ययन में इस संदर्भ में इन विट्रो और पूर्व वीवो दृष्टिकोणों पर उच्च लाभ प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वास्तविक समय इमेजिंग तकनीक विशिष्ट घटनाओं को नियंत्रित करने वाली घटनाओं के अनुक्रम के विवरण की अनुमति देती है। इस संदर्भ में, अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन ऊतक के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुकूलित उच्च संकल्प तकनीकों के उपयोग की मांग करता है। इंट्राविटल इमेजिंग तकनीक आंत में एपिथेलियल सेल शेडिंग के अध्ययन के लिए अद्वितीय उपयुक्त उपकरण के रूप में दिखाई देती है।
“इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी” शब्द एक जीवित जानवर11के भीतर अपने मूल वातावरण में कोशिकाओं और ऊतकों की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों (मल्टीफोटोन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी) का लाभ उठाने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को संदर्भित करता है। यह वीवो जानकारी में एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन तक वास्तविक समय अधिग्रहण को सक्षम बनाता है, और स्थिर या कम रिज़ॉल्यूशन विधियों पर स्पष्ट लाभ पर जोर देता है। इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी पूरक जानकारी प्रदान करता है और शास्त्रीय और/या उच्च अंत तकनीकों से कुछ सीमाओं को दूर करता है, जैसे ऊतक प्रसंस्करण के कारण कलाकृतियों । इसके विपरीत, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी की मुख्य सीमा यह है कि ऊतक को सीधे माइक्रोस्कोप से अवगत कराया जाना चाहिए, जिसमें ज्यादातर मामलों में सर्जरी की आवश्यकता होती है। यद्यपि परिष्कृत दृष्टिकोण जीवन शक्ति को बनाए रखते हैं और चित्रित ऊतक (स्किनफोल्ड चैम्बर्स और इमेजिंग खिड़कियां)12, 13,13के प्रभाव को कम करते हैं, लेकिन ज्यादातर मामलों में ऊतक (त्वचा फ्लैप)14के बाह्यीकरण के लिए एक साधारण त्वचा चीरा किया जाता है। पिछले दशक में, इन दृष्टिकोणों ने अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण सबूत दिए हैं, जो पहले गूढ़ थे । अनुवादात्मक रूप से, वास्तविक समय इमेजिंग ने स्टेम सेल और ल्यूकोसाइट्सहोमिंग 15पर नई जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान की, साथ ही कैंसर प्रसार और मेटास्टेसिसगठन 13,,16। नैदानिक संदर्भ में, एंडोमिक्रोस्कोपी को वर्तमान में कैंसर 17 और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों जैसे आईबीडी,18, 19के नैदानिक उपकरण के रूप में शोषण कियाजाताहै।17 जबकि कॉन्फोकल मोज़ेकिंग माइक्रोस्कोपी सर्जरी20दौरान एक रैपिड पैथोलॉजी टूल बन गया . साथ में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी हाल ही में क्लिनिक में जैव चिकित्सा अनुसंधान और भविष्य के आवेदन के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी उपकरण के रूप में उभरा है।
इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी यहां आंतों के एपिथेलियल रिसाव और एपिथेलियल सेल शेडिंग घटनाओं के अवलोकन के वास्तविक समय के दृश्य के लिए लागू किया गया है। आंतों की पारिम्यता के रिसाव की पहचान वीवो नॉनइनवेसिव तकनीकों में अन्य द्वारा की जा सकती है, जैसे सीरम21में फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स के मौखिक प्रशासन का मात्राकरण। हालांकि, यह तकनीक प्रदर्शन को बहाने के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति नहीं देती है और न ही पैरा-और ट्रांस-सेलुलर पारमेबिलिटी के बीच अलगाव। मानक ट्रेसर प्रयोगों और इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी का संयोजन एक उपयुक्त दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है: i) आंतों की पारगम्यता में गड़बड़ी की पहचान करें, और ii) पैरा-और ट्रांस-सेलुलर एपिथेलियल पारगम्यता के बीच अलग होते हैं। सेल शेडिंग के अलावा, वीवो फ्लोरेसेंस लेबलिंग में संयोजन में इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी अन्य सेलुलर और आणविक तंत्र (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों 22 या आंतों के म्यूकोसा23 के भीतर आईईसी और अन्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का उपयोग करके सेल शेडिंग केदौरानतंग जंक्शन पुनर्वितरण) के अध्ययन में सक्षम बनाता है।
यहां प्रस्तुत विधि कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएएम) का उपयोग करके आंतों के म्यूकोसा के वास्तविक समय अवलोकन को सक्षम करने के लिए इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए, हम(Pggt1biCIEC चूहों) में आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं (आईईसी) में GGTase (Geranylgeranyltransferase) के सशर्त नॉक आउट चूहों का उपयोग करते हैं, क्योंकि वे एक गंभीर आंतों की बीमारी से पीड़ित हैं और एपिथेलियल पारमेबिलिटी24में वृद्धि हुई है। माउस की सर्जिकल तैयारी और आंतों के म्यूकोसा का धुंधला, साथ ही इमेजिंग अधिग्रहण और अधिग्रहण के बाद विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली उचित सेटिंग्स का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल भविष्य के अध्ययनों को आंतों के एपिथेलियल सेल शेडिंग की गतिशीलता और काइनेटिक्स के बारे में वर्तमान ज्ञान में योगदान देने में सक्षम बना सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल आंतों के म्यूकोसा की सतह पर होने वाली अन्य घटनाओं का अध्ययन करने के लिए विभिन्न अनुकूलनों के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है, और यहां तक कि अन्य ऊतकों पर भी।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी-आधारित पद्धति वास्तविक समय में अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए एक अद्वितीय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के REA अनुदान समझौते संख्या ३०२१७० के तहत लोगों के कार्यक्रम (मैरी क्यूरी कार्रवाई) से धन प्राप्त हुआ है; विश्वविद्यालय एर्लैंन-न्यूरेमबर्ग का इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लीनिकल रिसर्च (IZKF); सहयोगी अनुसंधान केंद्र TRR241 और जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के नैदानिक अनुसंधान समूह KFO257; और डीएफजी।
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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