En intravital mikroskopibasert tilnærming for å vurdere intestinal permeabilitet og epitelcellesheddingytelse

Summary

Ved å dra nytte av intravital mikroskopi, gjør metoden som presenteres her, sanntidsvisualisering av tarmepitelcelleshedding hos levende dyr. Derfor er lokalt farget tarmslimhinne (acriflavine og rhodamineB-dextran) av bedøvet mus avbildet opp til encelleoppløsning ved hjelp av konfokal mikroskopi.

Abstract

Intravital mikroskopi av tarmen ved hjelp av konfokal avbildning gjør det mulig å se på epitelcelleshedding og barrierelekkasje hos levende dyr. Derfor er tarmslimhinnen til bedøvede mus lokalt farget med uspesifikk farging (acriflavine) og en fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), montert på en saltløsningsskyllet plate og direkte avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Denne teknikken kan utfylle andre ikke-invasive teknikker for å identifisere lekkasje av intestinal permeabilitet, for eksempel transmukosal passasje av oralt administrerte tracers. Foruten dette, tilnærmingen presentert her tillater direkte observasjon av celle shedding hendelser i sanntid. I kombinasjon med passende fluorescerende reportermus er denne tilnærmingen egnet for å kaste lys inn i cellulære og molekylære mekanismer som kontrollerer tarmepitelcelleprofilering, samt til andre biologiske prosesser. I de siste tiårene har interessante studier ved hjelp av intravital mikroskopi bidratt til kunnskap om endotelpermeabilitet, immuncelleme gut homing, immunepitelkommunikasjon og invasjon av luminalkomponenter, blant andre. Sammen ville protokollen som presenteres her ikke bare bidra til å øke forståelsen av mekanismer som kontrollerer epitelcelleprofilering, men kan også være grunnlaget for utviklingen av andre tilnærminger som skal brukes som instrumenter for å visualisere andre svært dynamiske cellulære prosesser, selv i andre vev. Blant tekniske begrensninger ville optiske egenskaper av det spesifikke vevet, samt den valgte bildeteknologien og mikroskopkonfigurasjonen, i sin tur bestemme bildeavstanden og oppløsningen av oppkjøpte bilder.

Introduction

Tarmen er et høyt spesialisert organ med en tett regulert funksjon som muliggjør motstridende prosesser, nemlig ernæring og beskyttelse mot skadelige luminale stoffer. Fôr mellom menneskekroppen og miljøet, fungerer tarmepitelet som en fysisk og immunologisk barriere og bidrar til vedlikehold av slimhinnehjemostase i tarmen^1,2. Tap av epitelintegritet og økt tett knutepunktpermeabilitet er kjent for å være forbundet med inflammatorisk tarmsykdom (IBD)^3,,4,,5,,6. Epitelendringer anses da som årsaker og sekundære forsterkere for kronisk tarmbetennelse i IBD. Dermed vil en forbedret forståelse av tidlige epitelendringer i tarmen til IBD-pasienter være av enorm verdi for utviklingen av nye strategier for å gjenopprette epitelintegritet for pålitelig prediksjon og påfølgende forebygging av IBD-tilbakefall.

Tarmepitel følger en kompleks og tett regulert omsetningsprosess. Fra krypten bunnen, terminalt differensiert intestinal epitelceller (IECer) avledet fra pluripotente stamceller migrere oppover til villus spissen, hvor eldre / skadede celler er kastet inn i lumen⁷. Likevekten mellom deling og celleprofil gjør det mulig å opprettholde tarmepitelcellenumre, unngå dannelse av hull og lekkasje, samt akkumulering av epitelceller som potensielt fører til cellemasser og tumorgenese^8,9,10. Til tross for nøkkelrollen til epitelcelleshedding i den fysiologiske fornyelsen av tarmepitelet, er kunnskapen om molekylære mekanismer som driver ekstrudering av celler på villusspissen begrenset. Dermed er det behov for grunnleggende forskning som gir en nøyaktig beskrivelse av sekvensen av molekylære hendelser involvert i epitelcelleshedding.

Komplekse interaksjoner mellom ulike celletyper i tarmslimhinnen er nøkkelen til å forstå molekylære mekanismer som regulerer epitelomsetning og intestinal homeostase. Dermed gir in vivo-studier høye fordeler fremfor in vitro- og ex vivo-tilnærminger i denne sammenhengen. Videre tillater sanntidsbildeteknikker beskrivelsen av hendelsesforløpet som kontrollerer spesifikke fenomener. I denne sammenheng krever studien av svært dynamiske prosesser bruk av optimaliserte høyoppløselige teknikker for direkte observasjon av vevet. Intravital bildeteknikker vises som unike egnede verktøy for studiet av epitelcelleshedding i tarmen.

Begrepet “intravital mikroskopi” refererer til eksperimentelle tilnærminger som drar nytte av høyoppløselige bildeteknikker (multiphoton eller konfokal mikroskopi) for å visualisere celler og vev direkte i sine innfødte omgivelser i et levende dyr¹¹. Det muliggjør sanntidsinnhenting av in vivo-informasjon opp til encellede oppløsning, og medfører klare fordeler ved statiske eller lave oppløsningsmetoder. Intravital mikroskopi gir komplementær informasjon og overvinner noen begrensninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, for eksempel gjenstander på grunn av vevbehandling. I motsetning er den viktigste begrensningen av intravital mikroskopi at vevet skal være direkte utsatt for mikroskopet, som i de fleste tilfeller krever kirurgi. Selv om sofistikerte tilnærminger bevare vitalitet og minimere virkningen av avbildet vev (skinfold kamre og bildevinduer)^12,13, i de fleste tilfeller en enkel hud snitt utføres for eksternisering av vevet (hudklaffer)¹⁴. I det siste tiåret har disse tilnærmingene bidratt med viktige bevis om svært dynamiske prosesser, som tidligere var ugjennomtrengelige. Translasjonelt ga sanntidsavbildning ny biologisk innsikt om stamcelle og leukocytter homing¹⁵, samt kreftformidling og metastasedannelse^13,16. I klinisk sammenheng utnyttes endomikoskopi for tiden som et diagnostisk verktøy for kreft¹⁷ og gastrointestinale sykdommer, som IBD^18,19; mens konfokal mosaikkmikroskopi ble et raskt patologiverktøy under operasjonen²⁰. Sammen har intravital mikroskopi i det siste dukket opp som et verdifullt og allsidig verktøy for biomedisinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.

Intravital mikroskopi er her implementert for sanntidsvisualisering av tarmepitellekkasje og observasjon av epitelcellesheddinghendelser. Lekkasje av intestinal permeabilitet kan identifiseres ved andre in vivo ikke-invasive teknikker, for eksempel kvantifisering av muntlig administrering av fluorescerende sporstoffer i serum²¹. Denne teknikken tillater imidlertid ikke direkte observasjon av shedding ytelse eller segregering mellom para- og transcellulær permeabilitet. Kombinasjonen av standard tracer eksperimenter og intravital mikroskopi representerer en passende tilnærming til: i) identifisere forstyrrelser i intestinal permeabilitet, og ii) segregere mellom para- og transcellulær epitelpermeabilitet. Foruten celle shedding, intravital mikroskopi i kombinasjon med in vivo fluorescens merking muliggjør studiet av andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks tight junction omfordeling under celle shedding ved hjelp av fluorescerende reporter mus²² eller interaksjoner mellom IECer og andre celler i tarmslimhinnen²³).

Metoden som presenteres her representerer en tilpasning av intravital mikroskopi for å muliggjøre sanntidsobservasjon av tarmslimhinnen, ved hjelp av konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM). Derfor bruker vi betingede knock-out mus av GGTase (Geranylgeranyltransferase) i tarm epitelceller (IECer) i (Pggt1b^iΔIEC mus), siden de lider av en alvorlig tarmsykdom og økt epitelpermeabilitet²⁴. Kirurgisk fremstilling av musen og farging av tarmslimhinnen, samt passende innstillinger som brukes til bildeanskaffelse og analyse etter oppkjøp, er beskrevet. Denne protokollen kan muliggjøre fremtidige studier som bidrar til dagens kunnskap om dynamikk og kinetikk av intestinal epitelcelleshedding. Videre kan protokollen tjene som grunnlag for ulike tilpasninger for å studere andre fenomener som forekommer på overflaten av tarmslimhinnen, og til og med ved andre vev.

Protocol

Følgende protokoll er godkjent av relevante lokale myndigheter i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold. MERK: Hemming av GGTase-mediert prenylation i IECer forårsaker en alvorlig endring av intestinal permeabilitet hos Pggt1biΔIEC-mus 24. Derfor ble denne musemodellen brukt til å demonstrere hvordan protokollen kan være nyttig for å studere tarmbarrieredefekter. Denne p…

Representative Results

Protokollen som presenteres her beskriver en intravital mikroskopibasert tilnærming for å visualisere tarmepitellekkasje og observere cellesheddingytelse i tarmen i sanntid. Kort sagt blir mus bedøvet og sendt til kirurgisk forberedelse for å avsløre overflaten av tynntarmenslimhinnen. IECer blir deretter farget via aktuell anvendelse av acriflavine; mens luminal rhodamine B-dextran brukes som tracers for å oppdage transmukosal passasje fra lumen til sub-epitelrommet. Dermed er det …

Discussion

Selv om teknisk utfordrende, intravital mikroskopibasert metodikk representerer en unik eksperimentell tilnærming for å visualisere svært dynamisk cellulær prosess i sanntid, for eksempel cellesheddingytelse. Så langt er det ingen alternativ eksperimentell tilnærming for å visualisere celleprofil in vivo. Vi tror at denne protokollen kan bidra til beskrivelsen av ulike cellulære prosesser som spiller en rolle i vedlikehold av intestinal homeostase.

Ved å dra nytte av intravital mikros…

Materials

Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	–
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	–
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	–	–
LSM microscope SP8	Leica	–	–
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	–
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	–
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422