Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

doi: 10.3791/60806 Published: March 30, 2020

Summary

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

Abstract

הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית על formalin-קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמות מאפשר זיהוי של סמנים מרובים מדגם רקמה אחת שיכולה לספק מידע על אנטיגן הביטוי והפצה מרחבית של סמנים. עם זאת, חוסר נוגדנים מתאים עבור הרקמות הקבועות של formalin עשוי להגביל את האופי של סמנים כי ניתן לזהות. בנוסף, שיטת הצביעת היא גוזלת זמן. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לבצע הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטרלי על רקמות קפואות. השיטה כוללת את שילובי fluorophore בשימוש, צעדים מפורטים עבור כתמים של העכבר ורקמות קפואות האדם, ואת הסריקה, רכישה, וניתוח הליכים. לניתוח מכתים, מערכת הדמיה פלואורסצנטית מסחרית ומרובת כלים למחצה. באמצעות שיטה זו, עד שישה סמנים שונים היו ויטראז וזוהו בסעיף אחד הרקמה הקפואה. תוכנת ניתוח למידה של מחשב יכול להתאים את התאים שניתן להשתמש בהם עבור ניתוח כמותי. השיטה המתוארת כאן עבור הרקמות הקפואות היא שימושית לאיתור סמנים שלא ניתן לאתרם ברקמות FFPE או באילו נוגדנים אינם זמינים עבור רקמות FFPE.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההתפתחויות האחרונות בטכניקות דימות מיקרוסקופיים שיפרו באופן משמעותי את הידע שלנו וההבנה של תהליכים ביולוגיים ומצבי מחלה. באיתור באתרו של חלבונים ברקמות באמצעות כרומוגניים אימונוהיסטוכימיה (IHC) מבוצעת באופן שגרתי בפתולוגיה. עם זאת, זיהוי של סמנים מרובים באמצעות כיפוגניים IHC כתמים הוא מאתגר1 ושיטות חדשות יותר להשתמש מערכות משנה החיסונית (mif) צביעת גישות, שבו סמנים ביולוגיים מרובים מתויגים על דגימת רקמה אחת, מפותחים. הזיהוי של סמנים ביולוגיים מרובים הוא שימושי, כי מידע הקשור לארכיטקטורת רקמות, התפלגות מרחבית של תאים, ו אנטיגן שיתוף ביטוי כולם נלכדים בדגימת רקמה אחת2. השימוש בטכנולוגיית הדמיה של קרינה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית הפכה את הגילוי של סמנים ביולוגיים מרובים אפשריים. בטכנולוגיה זו, באמצעות אופטיקה ספציפית ספקטרום הקרינה הפלואורסצנטית של כל fluorophore הפרט יכול להיות מופרדים או "unmixed עורב", המאפשר זיהוי של סמנים מרובים ללא כל הצלבות ספקטרלית3. הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית הופכת לגישה קריטית בביולוגיה של התא, פיתוח תרופות טרום-קלינית, פתולוגיה קלינית, והגידול בפרופיל החיסוני4,5,6. חשוב מכך, התפלגות מרחבי של תאים חיסוניים (במיוחד CD8 T תאים) יכול לשמש גורם התחזיות עבור חולים עם גידולים קיימים7.

הגישות השונות לצביעת מולטיפלקס פותחו וניתן לבצעו בו או ברצף. בשיטת הצביעה הסימולטנית, כל הנוגדנים מתווספים יחד כקוקטייל בשלב אחד כדי לתייג את הרקמה. טכנולוגיית UltraPlex משתמשת בקוקטייל של נוגדנים ראשוניים הצוכעשר מעלה ואחריו קוקטייל של fluorophore מעלה נגד הפגוטן נוגדנים משניים. טכנולוגיית Inממקם ב8 משתמש בקוקטייל ייחודי DNA-מצוסד נוגדנים ראשוניים אשר מתווספים בו לרקמות ואחריו צעד הגברה ולבסוף fluorophore-מעלה בדיקות כי הם משלימים כל רצף DNA ייחודי על הנוגדן העיקרי. שתי הטכנולוגיות הללו מאפשרות זיהוי של ארבעה סמנים פלוס 4, 6-diamino-2-פניינידול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים. שתי גישות נוספות לצביעת בתים בו מבוססות על מאסה משנית בספקטרומטר היונים9. מערכת הדמיה Hyperion משתמשת הדמיה המסה cy, לנסות10 כדי לזהות עד 37 סמנים. טכנולוגיה זו משתמשת בקוקטייל של נוגדנים מצוחים מתכת כדי להכתים את הרקמות, ואזורים ספציפיים של הרקמות הם מהונן על ידי לייזר והועבר cytometer המוני היכן יוני מתכת מזוהים. טכנולוגיה דומה נוספת היא IONPath, המשתמשת בטכנולוגיית הדמיה של קרן יון ממותגת11. טכנולוגיה זו משתמשת בכלי משתמש בספקטרומטר מסה ובמקור של מקור חמצן במקום לייזר כדי להשתמש בנוגדנים בעלי מתכת. בעוד כל הגישות הללו בו מכתים במקביל לאפשר זיהוי של סמנים מרובים, העלויות הכרוכות ב-DNA, הפעשרות, או מתכות לנוגדנים, אובדן רקמות בשל אבלציה, ואת עיבוד תמונה נרחבת עבור חוסר ערבוב לא ניתן להמעיט. יתר על כן, ערכות ופרוטוקולים כתמים זמינים כרגע רק עבור רקמות FFPE ופיתוח פאנלים מותאמים אישית כרוך בזמן נוסף והוצאות.

לעומת זאת, השיטה הרציפה מכתימה את הרקמה עם נוגדן לסמן אחד, בנוכחות להסיר את הנוגדן, ואחריה רצף חוזר של תהליך זה כדי לתייג סמנים מרובים12. הגברה של האות (ת א) היא השיטה הרציפה ביותר לשימוש הרציף. שתי טכנולוגיות ריבוב אחרות משתמשות בשילוב של שיטות מכתים בו ורציפות. בפלטפורמת הקודקס13 מועסקים קוקטייל של נוגדנים מצוהרים לרצפי דנ א ייחודי של ה-DNA שנוצרו בסופו של דבר עם פלואורוופפור באמצעות צעד הפלמור באינדקס ואחריו הדמיה, להתפשט, וחוזר על התהליך כדי לזהות עד 50 סמנים. מולטימיקו Multix מכתים את הגישה14 הוא איטרציה של כתמים עם קוקטייל של שלושה עד ארבעה fluorophore נוגדנים מצוהרים, הדמיה, מקוצ'ינג את fluorophores, וחוזר על מחזור זה כדי לזהות עד 60 סמנים על מקטע אחד. בדומה לשיטת הצביעה הסימולטנית, בעוד שניתן לזהות מגוון רחב של סמנים, הזמן המעורב בצביעת, רכישת תמונות, עיבוד וניתוח הוא נרחב. הצעד להתפשט/מקוצ'ינג כרוך חימום ו/או הלבנת דגימת הרקמה ולכן, הגישה הרציפה מכתים מתאים בדרך כלל על רקמות FFPE השומרים על שלמות הרקמה על חימום או הלבנה.

קיבעון formalin והטבעה של פרפין בהמשך מבוצע בקלות בהגדרה קלינית, בלוקים רקמות קל לאחסן, ומספר פרוטוקולים מכתים כתמים זמינים. עם זאת, עיבוד, הטבעה, והאחלות של רקמות FFPE, כמו גם לאחזור אנטיגן15, תהליך שבו הנוגדנים יכולים לגשת לאפיסקופים יותר, היא גוזלת זמן. יתר על כן, עיבוד מעורב ברקמות ffpe תורם אוטומטי של16 ומסכות היעד אפיסקופים, וכתוצאה מכך השונות וחוסר שיבוט נוגדן זמין כדי לזהות אנטיגנים ברקמות ffpe17,18,19. דוגמה לכך היא אנטיגן הלוקוציט האנושי (HLA) הכיתה ה-20. לעומת זאת, הקפאה הצמד של הרקמות אינו כרוך שלבי עיבוד נרחב לפני או אחרי תיקון, לעקוף את הצורך אחזור אנטיגן21,22, ועושה את זה מועיל לגילוי מגוון רחב יותר של מטרות. לכן, באמצעות רקמות קפואות עבור הדמיה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית יכול להיות יקר כדי לזהות מטרות עבור מחקרים פרה-קליניים וקליניים.

בהינתן המגבלות שהוזכרו לעיל בעת שימוש ברקמות FFPE, שאלנו אם הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית ניתן לבצע על רקמות קפואות. כדי לענות על שאלה זו, בדקנו את השיטה בו מכתים בו באמצעות פאנל של שיטת fluorophore-מעלה נוגדנים כדי לזהות אנטיגנים מרובים וניתח את הצביעת באמצעות מערכת הדמיה מרובת ספקטרלית חצי אוטומטי. הצלחנו להכתים בו שישה סמנים בסעיף אחד ברקמה בתוך 90 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הטחול של העכבר ורקמות הגידול של העכבר HLF1623 התקבלו מהמעבדה שלנו. רקמת השומן האנושית נרכשה מספק מסחרי. פרטים מסופקים ברשימת החומרים.

1. הטמעת רקמות

  1. הטמע רקמות טריות ב-OCT (טמפרטורת חיתוך אופטימלית) והקפא הקפאה באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי.
  2. אחסון רקמות ב-80 ° c.

2. קריוסיס1

  1. גזור 8 יקרומטר סעיפים ב קריוסטט עם טמפרטורות להגדיר ב-25 ° c.
    הערה: ניתן לכוונן את עובי המקטע המועדף כדי ליצור תמונות מיוחדות.
  2. מקם מקטעים על שקופיות של זכוכית טעונה.
  3. האוויר יבש את הסעיפים 1 h בטמפרטורת החדר (RT) לפני תיקון היסטולוגיה כיתה קרח קר באצטון עבור 10 דקות.
    הערה: אצטון גורם קרישה של חלבונים מסיסים במים, תמציות שומנים אך אינו משפיע על החומרים המכילים פחמימות. לעומת זאת, פורמאלין שומר על רוב השומנים ויש לו השפעה קטנה על פחמימות24. הבחירה של קבע חשוב בהתאם לבחירה של סמן להיות מזוהה.
  4. אחסן את השקופיות ב-20 ° c.

3. מבחר של נוגדנים וfluorophores

הערה: לפני מכתים רקמות, שיבוטים נוגדן כי יהיה מכבש ובמיוחד כתם שלהם אנטיגנים של עניין בתוך סעיפים רציפים מ אצטון קבוע רקמות חייב להיות מאומת. נוגדנים מסוימים עשויים לדרוש תיקונים שונים, ואת התאימות שלהם עם נוגדנים אחרים בפאנל תצטרך גם להיות אמפירי. המטרה היא גם לזהות fluorophores עם חפיפה מינימלית, כי ניתן לזהות עם מסננים epiפלואורסצנטית עבור DAPI, FITC, Cy3, טקסס אדום, ו Cy5.

  1. אשר כתמים על-ידי IHC קונבנציונאלי או לזיהוי immunofluorescence (IF) בסעיפים רקמה עם הביטוי הידוע אנטיגן היעד.
  2. באמצעות עירור ומסנן פליטה ערכות זמין על מערכת הדמיה חצי אוטומטי ולאחר בדיקת שילובים שונים של fluorophore-נוגדנים ראשוניים מצופני, להכין fluorophores לשמש כי יש חפיפה ספקטרלית מינימלית (למשל, לראות את לוח 1).

4. צביעת מיכל

הערה: מחדש רקמות ושוטף שקופיות בוצעו בצנצנת Coplin. שלבי הדגירה של החסימה והנוגדן בוצעו בתיבת השקופיות מחולל לחות.

  1. אפשר לשקופיות להתחמם ל-RT במשך 5 – 10 דקות.
  2. הידרוקסיד מחדש בתמיסת מלח (PBS) במשך 5 דקות.
  3. בצע שלב חסימה לפני צביעת רקמות עם נוגדנים. למקטעי עכבר, השתמש בפתרון חסימה מיוחד (ראה טבלת חומרים) במשך 10 דקות בשעה RT. עבור חלקים אנושיים, להשתמש 10% הסרום האנושי רגיל במאגר (בשנת) מדולל ב-PBS עבור 15 דקות ב RT.
    הערה: ניתן לבדוק מאגרי חסימה שונים לפי הצורך כדי לשמר את המאפיינים הספציפיים של המקטעים בהתאם להליכי המעקב שישמשו.
  4. שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב-PBS לאחר חסימת.
  5. לצביעת התאים, הכינו קוקטייל של נוגדנים עם fluorophores תואם בדילול אופטימלי מראש.
  6. מוסיפים את הקוקטייל של מעגל פלואור מצופף לשקופיות. עבור כתמים בעלי סימון בודד, הוסף רק את הנוגדן הראשי לשקופית.
  7. כלול שקופית שאינה מוכתמת בפקד שעוברת את אותה הליך כתמים ללא תוספת של נוגדן מעלה מעלה.
  8. דגירה את השקופיות עבור 1 h ב RT בחושך ולאחר מכן לשטוף את השקופיות 2x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד. מכאן והלאה, השקופית המתקבלת מכונה מוכתם באמצעות מולטיפלקס.
  9. כדי להכתים את הכתם, הוסף DAPI לשקופית מוכתמת במגה-בתים, דגירה של 7 דקות בחשיכה ב-RT, ושטוף את השקופיות 2x עם PBS עבור 5 דקות כל אחד. אל תכחד את הכתמים על שקופיות מוכתמות ובלתי מוכתמות.
  10. כדי coverslip, להוסיף טיפה של המדיום להרכבה, ובעדינות למקם את שמיכות זכוכית על הרקמה.

5. הכנת ספרייה ספקטראלית

  1. רכישת תמונה
    1. . הגדר את כוח המנורה ל-100% בדרך כלל העוצמה מוגדרת ל-10% מכיוון שזיהוי של קרינה ברקמות FFPE כולל צעד הגברה של אות.
    2. התחל בפתיחת תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).
    3. בחר באפשרות ' עריכת פרוטוקול ' ולאחר מכן ' פרוטוקול חדש'.
    4. ספק "שם פרוטוקול", ובחר באפשרות ' זריחה ' תחת מצב הדמיהוספק "שם מחקר".
    5. הצב את השקופיות המוכתמות בלבד על הבמה ובדוק כל סמן בערוץ הזריחה המקביל שלו כדי להבטיח כתמים. בחר אזור על הרקמה המבטאת את האות החזק ביותר עבור סמן.
    6. כוונן את זמני החשיפה באמצעות פוקוס אוטומטי ואפשרויות לחשוף אוטומטית .
    7. השג תמונות עבור השקופיות המוכתמת ושאינן מוכתמות ושמור את הפרוטוקול.
      הערה: השלבים הבאים מתבצעים בתוכנת למידה ממוחשבת (ראה טבלת חומרים), תוך שימוש בשקופיות ויטראז ' בודדות כדי לוודא את הכתמים הספציפיים, כמו גם לקבוע את הדיבור על הנוגדן.
    8. תחת הכרטיסיה בניית ספריות בתוכנה, טען כל אחת מתמונות השקופיות המוכתמת, בחר את האפשרות fluor המתאימה ולחץ על הלחצן ' חילוץ'. התוכנה לחלץ באופן אוטומטי את האות הפלואורסצנטית שנבחר Fluor.
    9. כדי לשמור את הצבע שחולץ, לחץ על שמור לחנות. ניתן ליצור "קבוצה חדשה" או לאחסן את הצבע המחולצים לקבוצה קיימת.
  2. מאמת את הספרייה הספקטראלית
    1. בדוק את חלון עקומת הפליטה ספקטרלי, הממוקם מימין לתמונה המחולצים, עבור כל ערכת מסנן.
      הערה: האות המחולצים נכון אם העקומה ספקטרלית נצפתה רק בסטים מסנן שבו מזוהה fluorophore. אם עקומה ספקטרלית נצפתה בערכת הסינון הלא נכונה, משמעות הדבר היא שהאות הראשי המצופה בערכת המסננים אינו חזק דיו, או שהתוכנה מזהה אות אחר שהוא גבוה מדי, ייתכן שעקב חפיפה ספקטרלית. במקרה זה, נסה תחילה להשתמש בכלי צייר אזורי עיבוד כדי לצייר אזורים סביב אזורים המבטאים את סמן הפלורסנט ואת הניאון האוטומטית בתמונה. זה מאמן את התוכנה כדי לזהות את האות האמיתי ולהסיר אותות מפריעים. אם הדבר אינו פועל, חזור על התהליך המוכתם עבור השקופית המוכתמת בודדת כדי לבדוק את החדירות השונות לנוגדנים.

6. הדמיה רב ספקטראלית

הערה: לאחר שהספריה הספקטרלית נוצרת ואומתה, בצע את השלבים הבאים עבור השקופית המוכתמת באמצעות המגה-בפלקס.

  1. סריקת שקופיות מלאה
    1. כוונן את זמני המיקוד והחשיפה על השקופית המוכתמת במגה-פלקס כפי שהוזכר תחת בסעיף 5.1.
    2. תחת סרוק שקופיות, צור משימה חדשה ובחר את הפרוטוקול שנשמר לעיל.
    3. בצע סריקת שקופית שלמה על השקופית המוכתמת באמצעות מולטיפלקס.
    4. באמצעות תוכנת סריקת השקופיות כולה, פתח את תמונת סריקת השקופיות כולה. תמונה זו לא היתה מעורבת בספקטרואולית.
    5. בחר אזורים מעניינים (ROI) לאורך תמונת סריקת השקופיות כולה באמצעות הכלי חותמת או ROI . ROIs אלה ייסרקו באמצעות זמני החשיפה שנקבעו ב6.1.1 לשמש לניתוח ספקטרלי ואנליזה.
    6. לחץ על עבד שקופית כדי לרכוש rois בהגדלה של 20 x
  2. ערבוב ספקטרלי
    1. לאחר הרכישה של ROIs, בתוכנת הלמידה של המחשב, תחת הכרטיסייה ניתוח ידני , טען את התמונות המוכתמות על-ידי לחיצה על פתח תחת קובץ.
    2. בתפריט הנפתח מקור הספרייה הנפתחת לחץ על בחר fluors.
    3. חלון חדש ייפתח. כאן, לבחור את הספרייה רפאים או קבוצה שנוצרו לעיל.
    4. טען את תמונת השקופית הבלתי מוכתמת. לחץ על סמל AF ink סמן הממוקם מעל הספרייה ספקטרלית שנבחרו ולצייר קו או אזור על השקופית הבלתי מוכתם כדי לזהות פלואורסצנטית אוטומטי ברקמה.
    5. תחת הכרטיסיה ערוך סמנים וצבעים , הקצה שמות עבור כל סמן. ניתן להקצות צבעים מדומים בשלב זה.
      הערה: הצבע עבור ברירת המחדל של התמונה באמצעות הקרינה האוטומטית הוא Darksלטיף. . שנה את זה לשחור
    6. לחץ על הכן הכל.
  3. אימות תמונות שאינן מעורבות באופן משולב
    הערה:
    כאשר השלב הבלתי מתערבב מושלם, נוצרת תמונה מורכבת המורכבת מכל הצבעים.
    1. לחצו על הסמל ' עריכת עין '. כאן, כל צבע ב-"תצוגת רכיב" יכול להיות מכובה או מופעל כדי להציג את ההכתמים של כל סמן בודד.
    2. לבדוק חזותית את ההכתמים ואת המבנה של התאים כדי להבטיח כי אין חפיפה של סמן, אלא אם כן הוא רלוונטי ביולוגית. פתולוג יכול לעזור לאמת את הצביעת גם.
      הערה: הצביעת על השקופית מרבב צריך להיות מאומת על ידי השארת החוצה fluorophore אחד בכל פעם ובדיקת דפוס הצביעת. בנוסף, האימות יסייע גם לזהות fluorophores חזק המופיעים בספקטרום הסמוך בשל שיחה לחצות נוגדנים או דימום-through.
    3. לתצוגות פתולוגיה, המדמים תמונות ברייטפילד לכל סמן פלורסנט, לחצו על הלחצן ' בחר תמונת רכיב '. כאן, בחר סמן כדי להציג תמונה מדומה של שדה ברייטאלי.

7. ניתוח תמונות מרובת ספקטרליות באמצעות פילוח של תאים ופנוטיפים

הערה: לאחר שמאמת את התמונה שאינה מעורבת בספקטרום, ניתן לבצע פילוח של תאים באמצעות תוכנת הלמידה של המחשב, שתספק הוראות צעד-אחר-צעד. פילוח רקמות לא התבצע כאן. אם הפאנל כולל סמן אחד או יותר רקמה ספציפית ובמיוחד אם הרקמה מבולגן, פילוח רקמות צריך להתבצע.

  1. בחר "ציטופלסמה" ו-"קרום" תחת האפשרות ' פלח '.
    הערה: "גרעינים" נבחר כברירת מחדל.
  2. בחרו סמן מהחלונית. הגדר את הסמן כך שיזהה גרעינים, ציטופלסמה או קרום. לדוגמה, ניתן לבחור DAPI כדי לזהות גרעינים ו CD3 עבור קרום.
  3. לחץ על לחצן שלוש נקודות ('... ') כדי לבחור אפשרות תחת "השתמש באות זה כדי למצוא". לדוגמה, ' גרעין ' עבור DAPI. ניתן לבחור מספר סמנים מהחלונית לפילוח.
    הערה: עבור cytoplasmic או סמנים ממברנה, בחר את "השתמש באות זה כדי לסייע בפילוח גרעיני" אופציה.
  4. התוכנה מאתרת ויוצרת באופן אוטומטי מסכה לכל אחד מהגרעין, הציטופלסמה והקרום בתמונה.
  5. ודא שכל התאים ' מוסתרים ' לפילוח. כדי לכוונן, עבור לתצוגה ' פתולוגיה ' עבור הסמן המסוים שנבחר ב- 7.3. ולהשתמש באפשרויות התצורה בתוכנה.
  6. לחץ על "פלח הכל" כדי לפלח תאים.
  7. לאחר פילוח התא, המשך באמצעות תאים פנוטיפים. בשלב זה, לבחור את הסמנים הדרושים לפנוטיפים ולבחור באופן ידני לפחות חמישה תאים מוכתמים בבהירות עם הסמן הנבחר. זה מאמן את התוכנה לאחר מכן באופן אוטומטי לזהות את כל התאים מוכתם עם הסמן הנבחר בתמונה.
  8. מפת פנוטיפ נוצרת. לנתח כדי להבטיח את התא מוכתם עם הסמן הוא כראוי פנומן.
    הערה: הפנוטיפים לתא יכול להיות תהליך איטרטיבי. אם התוכנה אינה מסוגלת לפנוטיפ לתאים כראוי, משמעות הדבר היא שהאימונים אינם מספיקים או שגויים. במקרה זה, על המשתמש לבחור באופן ידני יותר תאים ולהכשיר מחדש את התוכנה ולחזור על שלב זה עד שהמשתמש יהיה מרוצה מהאימון.
  9. צור קבוצה בשם "אחרים" וכלול תאים שאינם מוכתמים עבור כל הסמנים.
    הערה: שלב זה חשוב להכשיר את התוכנה כדי להוציא את כל התאים הבלתי מוכתמים מן פנוטיפים.

8. ייצוא תמונות ושולחנות ניתוח

  1. לחצו על הלחצן ' ייצוא ' כדי להציג את החלונית ' הגדרות ייצוא '.
  2. ב "ייצוא ספריה", לחץ על עיון כדי לבחור מיקום לייצא את התמונות.
  3. ב "אפשרויות ייצוא תמונה", בחר את תבנית פלט תמונה.
  4. ברשימה "תמונות לייצוא", בחר את התמונות שיוצאו. "תמונה ללא הפרדות צבע" היא התמונה המדומה האחרונה שאינה מעורבת. "השקפות פתולוגיה" הן הדמויות הבודדות המשמשות לבדיקות ביומיות והן "תמונות Component (מרובת תמונות TIFF)" היא קובץ TIFF מרובה תמונות של נתוני רכיבים הניתנים לשימוש על-ידי תוכנות ניתוח צד שלישי.
  5. לחץ "ייצוא עבור כל" כפתור כדי לייצא את התמונות.
    הערה: ניתן לבחור גם טבלאות מניתוח ולייצא אותן בשלב זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זיהוי סמנים חד-מוכתמים במקטעי טחול קפואים
כמו מערכת הדמיה למחצה אוטומטית משתמשת מסנן גביש נוזלי tunable (מערכת ליקוויד TF) המאפשר מגוון רחב יותר של גילוי אורך הגל25, ומשום שאין שלבי הגברה האות בוצעו כאן, אנו הראשון אופטימיזציה של הזיהוי של נוגדנים הראשי שלנו מצופנים עבור כל סמן על המיקרוסקופ. דוגמה מוצגת באיור 1, כאשר כל סמן מוכתם בודד הוא אדום בצבע מדומה. השימוש כאן אומת על ידי החברות המשמשות לאימונוצילובורנציה ולהזרמת cy, שימוש בנוגדנים. עם זאת, ל-CP-Cy 5.5 fluorophore מאומת רק לזרימה cy, try. הצלחנו לזהות את הצבע הזה בתוך שקופיות מוכתם בודד שלנו, תמיכה התאמה של זרימה cy, לנסות נוגדנים מאומת לשימוש הדמיה רב ספקטראלית ולספק את היתרון של שימוש בנוגדנים כגון לאמת תצפיות באמצעות שתי טכניקות שונות (כלומר, הזרמת cy, לזרום הדמיה רב ספקטרלית). לאחר מכן המשכנו לבצע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

איתור פלואורסצנטית רב-צבעי על הטחול של העכבר הקפוא
כדי לבדוק את השיטה מכתים את שיטת הדמיה ספקטרלית, השתמשנו ברקמת הטחול הקפואה של העכבר, אשר יש שפע של תאים חיסוניים. איור 2 מראה תמונה בלתי מעורבת בספקטרום של סמנים שונים במקטע של טחול עכבר קפוא. הנוגדנים, המשובטים, והריכוזים המשמשים לצביעת מתוארים בטבלה 2. התמונה שנלכדה מציגה חלק של אזור התא T מזוהה על ידי נוכחות של CD3, CD4, ו CD8 סמנים, מוקף בתאי מיאלואידית המבטא CD11b נצפתה בעיקר באזור השולי. מחוזות תאים מתרבים המבטאים Ki67 נצפו בעיקר במרכזים נבטי. "השקפות פתולוגיה" אפשרות עבור כל סמן הראה דפוס הצביעת האינדיבידואלי שלה בתוך הרקמה. דפוסי מכתים ברורים עבור CD11b, Ki67 ו CD3, CD4, ו CD8 סמנים יחד נצפו, מציע כי השיטה הצביעת הנייר הדמיה ספקטרלית עבד על הרקמה הקפואה.

האיתור הפלואורסצנטית רב צבעי על הטון האנושי הקפוא
לאחר בדיקת פאנל מכתים המתאים לרקמת העכבר, הגענו הבא העריכו פאנל נפרד לרקמות האדם קפוא שקדים. איור 3 מציג תמונה בלתי מעורבת של הסמנים השונים המשמשים. הנוגדנים, המשובטים, והריכוזים המשמשים לצביעת מתוארים בטבלה 2. התמונה שנתפסו מראה מרכז הזקיקים נבטי26 ביטוי B-תאים מזוהה על ידי סמן CD20. תאים מתרבים במרכז נבטי הפוליקולרית זוהו על ידי Ki67. כמה תאים אלה מתרבים מוכתם עם CD20 והוא עשוי להיות centroblasts חזיק27, נאיבי B-תאים העוברים היפרמוטציות הפעיל של סומאטציה. מרכזי נבטי הזקיקים היו מוקפים באזור התא T הזקיקים המזוהה על ידי הביטוי של CD3, CD4, ו CD8. שוב, דפוסי כתמים נפרדים נצפו כאן, ומאשרים כי המתודולוגיה עבדה על רקמה קפואה.

יישום הדמיה של קרינה פלואורסצנטית רב-ספקטרלית על רקמות הגידול של העכבר הקפוא
הדמיה רב ספקטראלית הוא כלי שימושי ניטור הסתננות התא החיסונית בגידולים כפרוגנוזה של חיסוני. למטרה זו, יצאנו להכתים מדגם רקמות העכבר הקפוא ולזהות מחלחל תאים החיסונית. קו התא HLF16 משמש כווירוס הפפילומה האנושי (HPV)+ מודל הגידול של סרטן צוואר הרחם ב hla-a * 0201 העכברים הטרנסגניים28. קו התאים הטרנסגניים פותח על-ידי העברה של הריאות והעור מתוך HLA-A * 0201 עם HPV16 E6 ו E7 אונגנים ו-H-Ras רובוטית v1228. תאים T ו מקרופאגים הקשורים הגידול הם המערכת החיסונית הנפוצה ביותר בגידולים29. איור 4 מראה תמונה בלתי מעורבת בספקטרום של מקטע גידול HLF16 קפוא יחד עם הדעות פתולוגיה; דפוסי הצביעת הבודדים מוצגים באיור המשלים 1. הנוגדנים, המשובטים, והריכוזים המשמשים לצביעת מתוארים בטבלה 2. התמונה שנתפסו מראה אזורים של תאים T הסתננות הגידול שזוהו על ידי CD3 ו-CD8 סמנים יחד עם נוכחות של מיאלואידית אחרים תאים מיאלואידים מזוהה על ידי סמן CD11b. האזור שנתפסו גם מראה הקשורים הגידול מקרופאגים (TAMs), אולי של M2 פניטיפ, זיהה על ידי CD206 marker30, אשר קשורה היטב לכמה תאים מתרבים שזוהו כמו Ki67+.

התוכנה למידה מחשב2 מגיע עם תכונות כמו רקמה ניתוח תאים. ניתוחים אלה מבוצעים בדרך כלל על רקמות FFPE מוכתם הגברה האות. כפי שמתודולוגיה שלנו אינו משתמש הגברה האות, רצינו לבדוק אם התוכנה יכולה לשמש כדי לנתח מכתים על רקמות קפואות. באמצעות תכונה מסתגלת של התוכנה, היינו מסוגלים לפלח את התאים על בסיס סמן גרעיני וממברנה ו פניטיפ תאים מבוסס על סמנים המשמשים לצביעת. איור 5 מראה את פילוח התא ומפות פנוטיפ ואת מספר התאים המוכתמת עבור כל סמן שנותח על ידי התוכנה, הוכחת כי התוכנה ניתן להשתמש עבור כימות של כתמים מרובה ספקטרלי על רקמות קפואות.

Figure 1
איור 1: מזהה נוגדנים בעלי מעלה מעלה באמצעות מיקרוסקופ מסנן גביש נוזלי. העיקרי מצוכי נוגדנים הסמנים המצוין היו מוכתם על הטחול העכבר הקפוא זוהה באמצעות מערכת 3.0 Vectra הדמיה רב ספקטרלית תחת מטרות 20x. CD3 על אלקסה Fluor 488, CD8 על אלקסה Fluor 594, CD11b ב-CP Cy 5.5, CD206 על אלקסה Fluor 647, ו Ki67 על אלקסה Fluor 555 שימשו. כל סמן הוא אדום בצבע מדומה. לא נעשה שימוש בכתם נגדי. בשקופיות האלה סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה מרובת ספקטרלית על טחול עכבר קפוא. (A) השקופית השלמה של השקופית המוכתמת שנלקחה תחת יעדי 4x. חותמת 2 x 2 על פני אזורים שונים של הרקמה נבחרו להדמיה רב ספקטרלית. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) תמונה מורכבת שצולמה תחת מטרה 20x לאחר ערבוב ספקטרלי. הסמנים בצבע המדומה מסומנים ותמונה מוגדלת בתוך התיבה האדומה מוצגת ליד התמונה. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ג) השקפות מחלות עבור כל סמן בודד. תמונה מוגדלת עבור כל סמן בתוך התיבה האדומה מוצגת ליד התמונה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה מרובת ספקטרלית על טונסיל האדם הקפוא. (A) השקופית השלמה של השקופית המוכתמת שצולמה תחת מטרת 4x. A 1 x 1 חותמת (669 יקרומטר x 500 יקרומטר) על פני אזורים שונים של הרקמה נבחרה עבור הדמיה רב ספקטראלית. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) תמונה ללא הפרדות צבע לאחר הערבוב ספקטרלי שנלקח תחת המטרה 20x. הסמנים בצבע המדומה מסומנים ותמונה מוגדלת בתוך התיבה האדומה מוצגת ליד התמונה. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ג) השקפות מחלות עבור כל סמן בודד. תמונה מוגדלת עבור כל סמן בתוך התיבה האדומה מוצגת ליד התמונה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה רב ספקטראלית על גידול בעכבר קפוא. הדמיה מרובת ספקטרלית בוצעה על 1 x 1 באזור של עכבר קפוא HLF16 הגידול נלקח תחת המטרה 20x. התמונה המורכבת (מעל). הסמנים בצבע המדומה מצוינים והתצוגות הפתולוגיה (להלן) עבור כל סמן בודד מתוארת. תמונה מוגדלת לכל סמן בתוך התיבה האדומה מוצגת ליד התמונה המקורית. סרגל בקנה מידה = 20 יקרומטר לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח של מקטע הגידול בעכבר קפוא. (A) מפת פילוח תא. פילוח תא מסתגל באמצעות ' הודע ' בוצע. התוכנה הוכשרו לזהות גרעינים (ירוק) ו קרום (אדום). (ב) פנוטיפ מפות לכל סמן מוכתם. התוכנה היתה מאומנת לזהות פנוטיפים המבוססים על ההכתמים. נקודה צבעונית מייצגת את הסמן המצוין. "אחר" (שחור) מתייחס לתאים שאינם מוכתמים עבור הסמן שצוין. (ג) מגרש בר (כלומר ± STDEV) המתאר את מספר התאים המוכתמת עבור כל סמן בשתי תמונות מרובת ספקטרליות. המספר מציין פנופני תאים המוקלדים בכל תמונה אך אינו מציין אם הסמנים מבוטאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פלואור הריגוש המקסימלי (nm) פליטה מקסימלית (nm) זיהוי צפוי בערכת מסננים (שם)
אלקסה פלואור 488 488 519 מיכל הג
אלקסה פלואור 555 555 580 Cy3 וטקסס האדום
אלקסה פלואור 594 590 617 טקסס רד
אלקסה פלואור 647 650 668 טקסס רד וCy5
דאפי 350 470 דאפי
PerCP-Cy 5.5 482 690 Cy3, טקסס אדום ו Cy5

טבלה 1: רשימה של fluorophores עם עירור מקסימום שלהם אורכי גל וזיהוי צפוי בערכות מסנן המתאים.

הטחול של העכבר הקפוא
נוגדן/צבען שיבוט ריכוז (μg/mL)
אלקסה פלואור 594 נגד עכבר CD8a 53-10.8 10
אלקסה פלואור 488 נגד עכבר CD3 שלמה כהן 20
אלקסה פלואור 647 נגד עכבר CD4 GK 1.5 10
PerCP-Cy 5.5 עכברוש נגד CD11b M1/70 2
אלקסה פלואור 555 עכבר anti-Ki-67 B56 10
דאפי 0.1
הגידול בעכבר קפוא
נוגדן/צבען שיבוט ריכוז (μg/mL)
אלקסה פלואור 594 נגד עכבר CD8a 53-10.8 20
אלקסה פלואור 488 נגד עכבר CD3 שלמה כהן 20
אלקסה Fluor 647 נגד העכבר CD206 (MMR) C068C2 מיכל 5
PerCP-Cy 5.5 עכברוש נגד CD11b M1/70 1
אלקסה פלואור 555 עכבר anti-Ki-67 B56 0.25
דאפי 0.1
האדם הקפוא בטונסיל
נוגדן/צבען שיבוט ריכוז (μg/mL)
אלקסה פלואור 594 נגד אדם CD3 UCHT1 10
PerCP/Cyanine 5.5 אנטי אדם CD4 RPA-T4 4
אלקסה פלואור 647 נגד אדם CD8a C8/144B 10
אלקסה פלואור 488, eBioscience CD20 נגד אדם L26 10
אלקסה פלואור 555 עכבר anti-Ki-67 B56 1
דאפי 0.1

שולחן 2: רשימת נוגדנים, שיבוטים, וריכוזים בשימוש.

איור משלים 1: דפוסי מכתים בודדים של הגידול HLF16 קפוא לאחר מיקס ספקטרלי. סרגל בקנה מידה = 20 יקרומטר לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הרקמות הקפואות השתמשו בהרחבה עבור הדמיה mIF כדי לזהות באופן מסורתי שלושה עד ארבעה סמנים31 על רקמה באמצעות שיטה ישירה ועקיפה32. בשיטה ישירה, נוגדנים הם מצוענים צבעים רואה או נקודות הקוונטים33 לתווית את הרקמה, ואילו בשיטה עקיפה, נוגדן ראשוני מצומת משמש לתייג את הרקמה ואחריו רואה מצופף משני מעלה מאוד המזהה את הנוגדן העיקרי. כמה מהחדשים האחרונים מכתים גישות שנדונו קודם לכן יכול לשמש גם כדי כתם רקמות קפואות לזהות יותר מארבעה סמנים. אבל את העלות של ריאגנטים ואת הזמן נלקח עבור כתמים להיות אינטנסיבי בהתאם למספר של סמנים להיות מזוהה. טכניקת מולטיפלקס נוספת לרקמות קפואות היא מרובת האפילוגרפיה-ליגולי-קרטוגרפיה (MELC)34. הטכניקה כוללת להכתים את המדגם עם fluorophore-נוגדנים מצותמים, הדמיה, והלבנת של fluorophore. אזהרה מרכזית של טכניקה זו היא כי רק שדה אחד או אזור של הרקמה יכול להיות מריבוב. כדי לבצע מיון של שדות או אזורים אחרים הטכניקה צריכה להתבצע באופן ידני, אשר צורכת זמן, או דורש אוטומציה, וזה יקר. קבוצה אחת35 הצליחה לזהות שישה צבעים על הרקמות הקפואות באמצעות שילוב של כתמים ישירים, עקיפים, ו-מיזוג. עם זאת, מכתים רקמות לקח יומיים. לעומת זאת, המתודולוגיה שלנו משתמשת בשיטה מכתים בו במקביל הכוללת את היישום של קוקטייל של חמישה נוגדנים מוכתמים ישירות בתוספת DAPI כדי להכתים רקמות קפואות בתוך 90 דקות. יתר על כן, באמצעות מערכת הדמיה מרובת ספקטרלית למחצה של קרינה פלואורסצנטית, היינו מסוגלים להפריד ביניהם ולזהות שישה סמנים בטחול קפוא, tonsil, רקמות הגידול באמצעות הטכניקה הפשוטה הזאת הצביעת בתוך הקולנוע. Cy3, טקסס אדום, ואת מסנן Cy5 מגדיר זמין על המיקרוסקופ לספק הזדמנויות כדי לזהות fluorophores נוספים, ובכך פוטנציאל להגדיל את מספר סמנים כי ניתן להבחין בו זמנית ברקמות קפואות.

הוספת מולטיפלקס באמצעות גישה לרקמות FFPE מחייבת שלב אחזור אנטיגן ואחריו תיוג רציף, כביסה ושלבי חשפנות. ביצוע ההליך נע בין 1 – 2 ימים, תלוי בזמני הדגירה המשמשים את הנוגדנים6. לאחרונה, באמצעות מעבד מיקרופלואידיג רקמות, מכתים ארבע-plex באמצעות הגישה לחברה בוצעה על רקמות FFPE תחת 90 דקות. טכניקות אחרות בקולנוע עבור רקמות FFPE ניתן לבצע תחת 4-5 שעות באמצעות הסטנר אוטומטי. עם זאת, את הצעדים המתאימים לאחזור אנטיגן צריך להיות ממוטב כדי להבטיח זמינות אפיפי עבור נוגדנים36, אשר בתורו מסתמך על שיקול קפדני של שיבוטים נוגדנים, כמו גם את הסדר של סמנים להיות מזוהה. לדוגמה, כמה שיבוטים נוגדנים של CD3 לא ניתן להשתמש, כי לאחר מכן CD4 ו CD8 נוגדנים אינם מזוהים37. באופן דומה, יש שינויים של זיהוי אנטיגן בין שיבוטים נוגדן זמין17,18. לכן, כתמים מולטיפלקס של ממחטות FFPE דורש אופטימיזציה של שיבוטים נוגדנים, ריכוזי שלהם, ואת סדר שבו הם מוכתמים, כולם צורכת זמן. לעומת זאת, חוסר עיבוד רקמות נרחב של רקמות קפואות מאפשר להשתמש שיבוטים נוגדנים שונים עם ספציפיות גבוהה. יתר על כן, שיבוטים נוגדן זמין עבור רקמות קפואות יכול לשמש גם cy, הזרמת לנסות ו-אליסה, המאפשר אימות סימולטני על פני assays שונים מספר. ארכיטקטורת רקמות היא גם דאגה ברקמות קפואות38. הנייר הממכתים המוצג כאן על הרקמות הקפואות הוא מהיר יותר באופן משמעותי מהגישה של היחידה. שילובים fluorophore דורשים מבחר זהיר של סמנים כדי להבטיח כי נוגדנים לא באופן שונה להפריע זה לזה, במיוחד כאשר אנטיגנים שונים מבוטא באותו מיקום סלולרי מזוהים. בחרנו סמנים כי הכתם תאים שונים על fluorophores כי הם הפרדה באופן ספקטרופתי, המאפשר זיהוי טוב יותר. ריכוזי נוגדנים גם דורשים אופטימיזציה, אבל בגלל הפרוטוקול מכתים הוא מהיר, הזמן הכולל נלקח עבור אופטימיזציה לא צורכת זמן. אזהרה לשיטה שלנו יכול להיות חוסר יכולת לזהות סמנים ביטוי נמוך ברקמות. חלק הגישות לצביעת מולטיפלקס ברקמות FFPE כרוכות בצעד הגברה אותות שימושי כדי לזהות סמנים ביטוי נמוך. עם זאת, השימוש בנוגדנים משני ושלישוני יכול להיות מועסק כדי להגביר את האות. במקרים כאלה יש להימנע מפעילות מחודשת לנוגדנים בפאנל כדי למנוע פרשנות שגויה של התוצאות.

בנוסף הטחול העכבר ורקמות האדם שקדים, אשר עשירים בתאי החיסון, השתמשנו ברקמת הגידול כדוגמה עבור הדמיה מרובת ספקטרלית שהוצעו של רקמות קפואות. הדמיה מרובת ספקטרלית בגידולים שסיפקה מידע רב ערך, כגון אפיון מיקרו הסביבה הגידול (TME)39, חיזוי ההצלחה של העברות תא T המאמצת מלנומה ממאיר40, ואפיון חלבונים ב-אותות הגידול התמרה מסלולים41. באמצעות סמנים ספציפיים לתאים חיסוניים נפוץ למצוא בגידולים, הצלחנו לזהות החדירה תאים CD8 T ו TAMs ברקמת הגידול HLF16 בשימוש זה מחקר. השתמשנו התוכנה למידה מחשב לפלח בהצלחה פנוטיפ תאים. מולטיפלקס לרקמות ffpe מעסיקה צעד הגברה האות כדי לשפר את האות לרעש (SNR) יחס המסייע עיבוד תמונה וכימות42,43. התוכנה למידה מחשב שימש ניתוח על רקמות FFPE מוכתם הגברה האות2. המתודולוגיה שקיימת כאן אינה משתמשת בהגברה של האות, אך הצלחנו לפלח ולפנוטיפ בהצלחה באמצעות התוכנה. לקבלת ניתוח נוסף (לדוגמה, ביטוי פנוטיפ וקשרי גומלין מרחביים) ופרשנות מדויקת של כימות הדרך, הכשרת התוכנה דורשת אימות באמצעות ערכת הדרכה, ערכת בדיקות וערכת אימות. בתהליך איטראטיבי, קבוצה אחת של תמונות (כלומר, ערכת ההדרכה) משמשת כדי להכשיר את תוכנת הלמידה של המחשב כדי לזהות את הפנוטיפים עד לתחזיות של המודל עבור קבוצה נפרדת של תמונות (כלומר, ערכת הבדיקה) מדויקות. לאחר השלמת ההכשרה, הקבוצה הסופית של התמונות (כלומר, ערכת האימות) מנותח כדי לראות אם היתה מתאימה יותר.

לסיכום, המתודולוגיה המוצגת כאן היא דרך מהירה לבצע הדמיה פלואורסצנטית רב ספקטראלית באמצעות רקמות קפואות. השיטה שימושית לזיהוי סמנים שאותם נוגדנים אינם זמינים או שלא ניתן לאתרם ברקמות FFPE. בשיתוף עם תוכנת למידה מכונה, הזמן שנלקח לבצע ניתוחים כמותיים יכול להקל באופן משמעותי אבחון טרום קליני וקליני ניתן להחיל בתחום ברזולוציה גבוהה מרחבית ההמרה הנצלת רקמות קפואות44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

הדרכה הדמיה וניתוח סופקו על ידי מרכז משאבי מחקר – מחקר היסטולוגיה ודימות רקמות הליבה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו הוקמה עם תמיכה מהמשרד של סגן הקנצלר למחקר. העבודה נתמכת על ידי NIH/NCI RO1CA191317 to CLP, על ידי NIH/NIAMS (SBDRC מענק 1P30AR075049-01) כדי ד ר א. Paller, ועל ידי תמיכה של רוברט לוריא מקיף סרטן המרכז להערכת הליבה חיסוני באוניברסיטת נורת'ווסטרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1x Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1x ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33, (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24, (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11, (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20, (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19, (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174, (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51, (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54, (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26, (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21, (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62, (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82, (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125, (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22, (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12, (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122, (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8, (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32, (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42, (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133, (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2, (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24, (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65, (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202, (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46, (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244, (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2, (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7, (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120, (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. 563338 (2019).
שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).More

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter