Summary
हम जमे हुए ऊतकों पर बहुनिरीक्षण इमेजिंग करने के लिए एक तेजी से धुंधला विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग एक ऊतक नमूने में कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो मार्कर के एंटीजन सहअभिव्यक्ति और स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हालांकि, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी की कमी मार्कर की प्रकृति को प्रतिबंधित कर सकती है जिसका पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा धुंधला तरीका समय लेने वाला होता है। यहां हम जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग करने के लिए एक त्वरित विधि का वर्णन करते हैं। विधि में इस्तेमाल किए गए फ्लोरोफोर संयोजन, माउस और मानव जमे हुए ऊतकों के धुंधला होने के लिए विस्तृत कदम, और स्कैनिंग, अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाएं शामिल हैं। धुंधला विश्लेषण के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अर्धस्वचालित बहुआयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है। इस विधि के माध्यम से, एक ही जमे हुए ऊतक अनुभाग में छह अलग-अलग मार्कर दाग और पाए गए। मशीन लर्निंग एनालिसिस सॉफ्टवेयर फेनोटाइप कोशिकाओं को फेनोटाइप कर सकता है जिसका उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। जमे हुए ऊतकों के लिए यहां वर्णित विधि मार्कर का पता लगाने के लिए उपयोगी है जिसे एफएफपीई ऊतकों में पता नहीं लगाया जा सकता है या जिसके लिए एफएफपीई ऊतकों के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं।
Introduction
सूक्ष्म इमेजिंग तकनीकों में हाल ही में हुई प्रगति ने जैविक प्रक्रियाओं और रोग राज्यों के हमारे ज्ञान और समझ में काफी सुधार किया है। क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के माध्यम से ऊतकों में प्रोटीन का सीटू पता लगाने में नियमित रूप से विकृति में किया जाता है। हालांकि, गुणसूत्र आईएचसी धुंधला का उपयोग कर कई मार्कर का पता लगानेके लिए 1 और नए तरीकों को चुनौती दे रहा है मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (mIF) धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग करें, जिसमें कई जैविक मार्कर एक ही ऊतक नमूने पर लेबल कर रहे हैं, विकसित किया जा रहा है । कई जैविक मार्कर का पता लगाना उपयोगी है, क्योंकि ऊतक वास्तुकला से संबंधित जानकारी, कोशिकाओं का स्थानिक वितरण, और एंटीजन सह-अभिव्यक्ति सभी एक ऊतक नमूना2में कैप्चर किए जाते हैं। बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक के उपयोग ने कई जैविक मार्कर का पता लगाना संभव बना दिया है। इस तकनीक में, विशिष्ट प्रकाशिकी का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्ति फ्लोरोफोर के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा को अलग या "अमिश्रित" किया जा सकता है, जिससे बिना किसी स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक3के कई मार्कर का पता लगाया जा सकता है। मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग सेल बायोलॉजी, प्रीक्लीनिकल ड्रग डेवलपमेंट, क्लीनिकल पैथोलॉजी और ट्यूमर इम्यून-प्रोफाइलिंग4,5,5,6में एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बनता जा रहा है। महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा कोशिकाओं (विशेष रूप से CD8 टी कोशिकाओं) के स्थानिक वितरण मौजूदा ट्यूमर7के साथ रोगियों के लिए एक शकुन कारक के रूप में काम कर सकते हैं ।
मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और या तो एक साथ या क्रमिक रूप से किया जा सकता है। एक साथ धुंधला विधि में, सभी एंटीबॉडी ऊतक लेबल करने के लिए एक ही कदम में एक कॉकटेल के रूप में एक साथ जोड़ा जाता है। अल्ट्राप्लेक्स तकनीक हैप्टेन-कॉन्जुरेटेड प्राइमरी एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है जिसके बाद फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेड एंटी-हैपटेन सेकेंडरी एंटीबॉडी का कॉकटेल होता है। InSituPlex प्रौद्योगिकी8 अद्वितीय डीएनए-conjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के एक कॉकटेल का उपयोग करता है जो एक साथ ऊतक में जोड़ा जाता है जिसके बाद एक प्रवर्धन कदम और अंत में फ्लोरोफोर-कॉन्जुगाट जांच होती है जो प्राथमिक एंटीबॉडी पर प्रत्येक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम के पूरक हैं। ये दोनों प्रौद्योगिकियां परमाणु धुंधला करने के लिए चार मार्कर प्लस 4',6-डिमिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) का पता लगाने में सक्षम बनाती हैं। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए दो अन्य दृष्टिकोण माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री9पर आधारित हैं । हाइपरियन इमेजिंग सिस्टम 37 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इमेजिंग मास साइटोमेट्री10 का उपयोग करता है। यह तकनीक ऊतकों को दाग देने के लिए धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है, और ऊतकों के विशिष्ट क्षेत्रों को लेजर द्वारा बरी किया जाता है और एक बड़े पैमाने पर साइटोमीटर में स्थानांतरित किया जाता है जहां धातु आयनों का पता लगाया जाता है। इसी तरह की एक और तकनीक आयनपाथ है, जो मल्टीप्लेक्स्ड आयन बीम इमेजिंग टेक्नोलॉजी11का इस्तेमाल करती है । यह तकनीक धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी को त्यागने के लिए लेजर के बजाय एक संशोधित द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण और ऑक्सीजन आयन स्रोत का उपयोग करती है। हालांकि ये सभी एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम होते हैं, डीएनए, हैप्टेन्स या धातुओं को एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित करने के लिए शामिल लागत, एब्लेशन के कारण ऊतक ों की हानि, और अमिश्रण के लिए व्यापक छवि प्रसंस्करण को कम करके नहीं आंका जा सकता है। इसके अलावा, किट और धुंधला प्रोटोकॉल वर्तमान में केवल FFPE ऊतकों के लिए उपलब्ध है और कस्टम पैनलों के विकास के अतिरिक्त समय और व्यय पर जोर देता है ।
अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि, इसके विपरीत, एक मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी के साथ ऊतक लेबलिंग, एंटीबॉडी को हटाने के लिए अलग करना, इस प्रक्रिया के अनुक्रमिक दोहराता के बाद कई मार्कर12लेबल शामिल हैं । टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्सिंग विधि है। दो अन्य मल्टीप्लेक्सिंग प्रौद्योगिकियां एक साथ और अनुक्रमिक धुंधला तरीकों के संयोजन का उपयोग करती हैं। कोडएक्स प्लेटफॉर्म13 अद्वितीय डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी का कॉकटेल कार्यरत है जिसे अंततः इमेजिंग, स्ट्रिपिंग और 50 मार्कर तक का पता लगाने की प्रक्रिया को दोहराने के बाद एक अनुक्रमित बहुलीकरण कदम का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है। मल्टीोमेक्स मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण14 तीन से चार फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेट एंटीबॉडी, इमेजिंग, फ्लोरोफोर्स को बुझाने और एक ही खंड पर 60 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इस चक्र को दोहराने के कॉकटेल के साथ धुंधला होने का एक पुनरावृत्ति है। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि के समान है, जबकि मार्कर की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाया जा सकता है, धुंधला, छवि अधिग्रहण, प्रसंस्करण, और विश्लेषण में शामिल समय व्यापक है । अलग-अलग/शमन कदम में ऊतक के नमूने को हीटिंग और/या ब्लीचिंग शामिल है और इस प्रकार, अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण आमतौर पर एफएफपीई ऊतकों पर किया जाता है जो हीटिंग या ब्लीचिंग पर ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं ।
फॉर्मेलिन फिक्सेशन और बाद में पैराफिन एम्बेडिंग आसानी से नैदानिक सेटिंग में की जाती है, ऊतक ब्लॉक स्टोर करना आसान होता है, और कई मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। हालांकि, एफएफपीई ऊतकों के प्रसंस्करण, एम्बेडिंग और डिपरफिनाइजेशन के साथ-साथ एंटीजन रिट्रीवल15,एक प्रक्रिया जिसके द्वारा एंटीबॉडी बेहतर एपीटोप का उपयोग कर सकते हैं, समय लेने वाली है। इसके अलावा, एफएफपीई ऊतकों में शामिल प्रसंस्करण ऑटोफ्लोरेसेंस16 में योगदान देता है और मास्क एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप एफएफपीई ऊतकों17,,18,,19में एंटीजन का पता लगाने के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन की परिवर्तनशीलता और कमी होती है। एक उदाहरण मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग मैं एलील्स20है। इसके विपरीत, ऊतकों की स्नैप फ्रीजिंग में फिक्सिंग से पहले या बाद में व्यापक प्रसंस्करण चरण शामिल नहीं हैं, एंटीजन पुनर्प्राप्ति21,,22की आवश्यकता को दरकिनार करते हैं, और लक्ष्यों की एक व्यापक श्रृंखला का पता लगाने के लिए इसे फायदेमंद बनाते हैं। इसलिए, बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का उपयोग पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों के लिए लक्ष्यों का पता लगाने के लिए मूल्यवान हो सकता है।
एफएफपीई ऊतकों का उपयोग करते समय उपरोक्त सीमाओं को देखते हुए, हमने पूछा कि क्या जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग की जा सकती है। इस सवाल का समाधान करने के लिए, हमने कई एंटीजन का पता लगाने के लिए फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेरेट एंटीबॉडी के पैनल का उपयोग करके एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि का परीक्षण किया और एक अर्धस्वचालित बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके धुंधला का विश्लेषण किया। हम एक साथ ९० मिनट के भीतर एक ही ऊतक अनुभाग में छह मार्कर को दाग करने में सक्षम थे ।
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Protocol
माउस तिल्ली और HLF16 माउस ट्यूमर ऊतक23 हमारी प्रयोगशाला से प्राप्त किए गए थे। मानव टॉन्सिल ऊतक एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया था। सामग्री की तालिका में विवरण प्रदान किया जाता है।
1. टिश्यू एम्बेडिंग
- अक्टूबर (इष्टतम काटने का तापमान) समाधान और स्नैप फ्रीज में ताजा ऊतक एंबेड या तो सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर ।
- -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतकों को स्टोर करें।
2. क्रायोसेक्शनिंग
- -25 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित तापमान के साथ एक क्रायोस्टेट में 8 माइक्रोन वर्गों में कटौती करें।
नोट: पसंदीदा अनुभाग मोटाई को कुरकुरा छवियों को उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। - आवेशित ग्लास स्लाइड पर अनुभाग रखें।
- हवा-10 मेंटिन के लिए हिस्टोलॉजी ग्रेड आइस-कोल्ड एसीटोन में फिक्सिंग से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए वर्गों सूखी ।
नोट: एसीटोन पानी में घुलनशील प्रोटीन के जमाव का कारण बनता है और लिपिड निकालता है लेकिन कार्बोहाइड्रेट युक्त घटकों को प्रभावित नहीं करता है। इसके विपरीत, फॉर्मेलिन अधिकांश लिपिड को बरकरार रखता है औरकार्बोहाइड्रेट 24पर बहुत कम प्रभाव डालता है। मार्कर का पता लगाया जा रहा है की पसंद के आधार पर फिक्सिव का चुनाव महत्वपूर्ण है। - स्लाइड्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. एंटीबॉडी और फ्लोरोफोरस का चयन
नोट: ऊतक धुंधला करने से पहले, एंटीबॉडी क्लोन जो एसीटोन फिक्स्ड ऊतक से अनुक्रमिक वर्गों के भीतर अपने हित के विरोधी को मजबूती और विशेष रूप से दाग देगा, मान्य किया जाना चाहिए। कुछ एंटीबॉडी को एक अलग फिक्सिव की आवश्यकता हो सकती है, और पैनल में अन्य एंटीबॉडी के साथ उनकी अनुकूलता को भी अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करना होगा। लक्ष्य भी न्यूनतम ओवरलैप के साथ फ्लोरोफोरस की पहचान करना है जिसे डीएपीआई, फिटैक, साइ3, टेक्सास रेड और साइ5 के लिए एपिफ्लोरेसेंस फिल्टर के साथ पता लगाया जा सकता है।
- ज्ञात अभिव्यक्ति लक्ष्य एंटीजन के साथ ऊतक वर्गों में पारंपरिक आईएचसी या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) का पता लगाने से धुंधला होने की पुष्टि करें।
- अर्धस्वचालित इमेजिंग सिस्टम पर उपलब्ध उत्तेजना और उत्सर्जन फ़िल्टर सेट का उपयोग करना और फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेट किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करने के बाद, फ्लोरोफोरस को तैयार करें जिनका उपयोग किया जाए जिसमें न्यूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप हो (जैसे, तालिका 1देखें)।
4. धुंधला
नोट: ऊतक रिहाइड्रेशन और स्लाइड वॉश एक Coplin जार में किया गया । अवरुद्ध और एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम एक आर्द्र स्लाइड बॉक्स में किया गया ।
- स्लाइड्स 5-10 मिन के लिए आरटी को गर्म करने की अनुमति दें।
- 5 मिन के लिए फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) में रिहाइड्रेट।
- एंटीबॉडी के साथ ऊतकों को धुंधला करने से पहले एक अवरुद्ध कदम उठाएं। माउस वर्गों के लिए, आरटी में 10 मिन के लिए विशेष अवरुद्ध समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। मानव वर्गों के लिए, आरटी में 15 मिन के लिए पीबीएस में पतला 10% सामान्य पूल्ड मानव सीरम (एनएचएस) का उपयोग करें।
नोट: उपयोग की जाने वाली अनुवर्ती प्रक्रियाओं के आधार पर अनुभागों के विशिष्ट गुणों को संरक्षित करने के लिए आवश्यक रूप से विभिन्न अवरुद्ध बफ़र्स का परीक्षण किया जा सकता है। - स्लाइड्स में ब्लॉक करने के बाद पीबीएस में 5 मिन के लिए...
- मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए, पूर्व निर्धारित इष्टतम कमजोर होने पर संगत फ्लोरोफोरस के साथ एंटीबॉडी का कॉकटेल तैयार करें।
- स्लाइड्स में फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेंट एंटीबॉडी का कॉकटेल डालें। सिंगल-मार्कर धुंधला करने के लिए, स्लाइड में केवल प्राथमिक-संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें।
- एक नियंत्रण अनदाग स्लाइड शामिल करें जो किसी भी प्राथमिक-संयुग्मित एंटीबॉडी के अलावा एक ही धुंधला प्रक्रिया से गुजरता है।
- अंधेरे में आरटी में 1 घंटे के लिए स्लाइड incubate और फिर 5 मिन प्रत्येक के लिए PBS के साथ स्लाइड 2x धोने । यहां से परिणामी स्लाइड को मल्टीप्लेक्स दाग के रूप में संदर्भित किया जाता है।
- जवाबी दाग के लिए, मल्टीप्लेक्स-दाग वाली स्लाइड में DAPI जोड़ें, आरटी में अंधेरे में 7 मिन के लिए इनक्यूबेट करें, और 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड 2x धोएं। सिंगल दाग और अनदाग ्ड स्लीव्स को काउंटरदाग न करें।
- कवरस्लिप के लिए, बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें, और धीरे-धीरे ग्लास कवरस्लिप को ऊतक के ऊपर रखें।
5. स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी तैयार करना
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छवि अधिग्रहण
- दीपक शक्ति को 100% तक सेट करें। आमतौर पर बिजली 10% के लिए सेट है क्योंकि FFPE ऊतकों पर फ्लोरेसेंस का पता लगाने में एक संकेत प्रवर्धन कदम शामिल है।
- माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलने से शुरू करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
- संपादित प्रोटोकॉल और फिर नए प्रोटोकॉलका चयन करें ।
- "प्रोटोकॉल नाम" प्रदान करें, और इमेजिंग मोडके तहत फ्लोरेसेंस का चयन करें, और "अध्ययन नाम" प्रदान करें।
- स्टेज पर सिंगल-दाग वाली स्लाइड्स रखें और धुंधला सुनिश्चित करने के लिए अपने इसी फ्लोरेसेंस चैनल में प्रत्येक मार्कर की जांच करें। मार्कर के लिए सबसे मजबूत संकेत व्यक्त ऊतक पर एक क्षेत्र चुनें।
- ऑटोफोकस और ऑटोएक्सपोज विकल्पों का उपयोग करके एक्सपोजर समय समायोजित करें।
- एकल दाग और अनदाग स्लाइड के लिए स्नैपशॉट प्राप्त करें और प्रोटोकॉल को बचाएं।
नोट: निम्नलिखित कदम मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) में किए जाते हैं, विशिष्ट धुंधला सत्यापित करने के साथ-साथ एंटीबॉडी क्रॉस टॉक निर्धारित करने के लिए एकल दाग और अनदाग स्लाइड का उपयोग करते हैं। - सॉफ्टवेयर में बिल्ड लाइब्रेरी टैब के तहत, प्रत्येक एकल-दाग वाली स्लाइड छवि लोड करें, उपयुक्त फ्लोर चुनें, और एक्सट्रैक्टपर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से फ्लोरर में चुने गए फ्लोरेसेंस सिग्नल निकाल देगा।
- निकाले गए रंग को बचाने के लिए, सेव टू स्टोरपर क्लिक करें। एक "नया समूह" बनाया जा सकता है या निकाले गए रंग को मौजूदा समूह में संग्रहीत किया जा सकता है।
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स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का सत्यापन
- प्रत्येक फ़िल्टर सेट के लिए निकाले गए छवि के दाईं ओर स्थित उत्सर्जन स्पेक्ट्रल वक्र विंडो की जांच करें।
नोट: निकाले गए सिग्नल सही है अगर स्पेक्ट्रल वक्र केवल फिल्टर सेट में देखा जाता है जहां फ्लोरोफोर का पता लगाया जाता है। यदि गलत फ़िल्टर सेट में एक स्पेक्ट्रल वक्र मनाया जाता है, तो इसका मतलब यह हो सकता है कि या तो फ़िल्टर सेट में अपेक्षित प्राथमिक संकेत पर्याप्त मजबूत नहीं है, या सॉफ्टवेयर एक और संकेत का पता लगा रहा है जो बहुत अधिक है, संभवतः स्पेक्ट्रल ओवरलैप के कारण। इस मामले में, पहले छवि में फ्लोरोसेंट मार्कर और ऑटोफ्लोरेसेंस व्यक्त करने वाले क्षेत्रों के आसपास के क्षेत्रों को आकर्षित करने के लिए ड्रा प्रोसेसिंग क्षेत्रों टूल का उपयोग करने का प्रयास करें। यह सॉफ्टवेयर को सही सिग्नल का पता लगाने और किसी भी हस्तक्षेप संकेतों को हटाने के लिए ट्रेन करता है। यदि यह काम नहीं करता है, तो विभिन्न एंटीबॉडी टिट्रेशन का परीक्षण करने के लिए एकल-दाग वाली स्लाइड के लिए धुंधला प्रक्रिया दोहराएं।
- प्रत्येक फ़िल्टर सेट के लिए निकाले गए छवि के दाईं ओर स्थित उत्सर्जन स्पेक्ट्रल वक्र विंडो की जांच करें।
6. मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग
नोट: एक बार स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी बनाने और सत्यापित होने के बाद मल्टीप्लेक्स-दाग वाली स्लाइड के लिए निम्नलिखित चरणों को अंजाम दें।
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पूरी स्लाइड स्कैन
- धारा 5.1 में उल्लिखित मल्टीप्लेक्स-दाग वाली स्लाइड पर फोकस और एक्सपोजर समय समायोजित करें।
- स्कैन स्लाइड केतहत, एक नया कार्य बनाएं और ऊपर सहेजे गए प्रोटोकॉल का चयन करें।
- मल्टीप्लेक्स से दागदार स्लाइड पर पूरी स्लाइड स्कैन करें।
- पूरी स्लाइड स्कैन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, पूरी स्लाइड स्कैन छवि खोलें। इस छवि को बिना मिश्रित नहीं किया गया है ।
- स्टांप या आरओआई टूल का उपयोग करके पूरी स्लाइड स्कैन छवि में ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करें। इन आरओआई को स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक्सपोजर टाइम्स 6.1.1 में सेट का उपयोग करके स्कैन किया जाएगा।
- 20x आवर्धन पर ROIs प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया स्लाइड क्लिक करें
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स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग
- एक बार आरओआई का अधिग्रहण हो जाने के बाद, मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर में, मैनुअल एनालिसिस टैब के तहत, फ़ाइलके नीचे खुले क्लिक करके मल्टीप्लेक्स दाग छवियों लोड ।
- स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी सोर्स ड्रॉपडाउन मेनू में क्लिक करें चुनिंदा फ्लोर्स।
- एक नई खिड़की खुलेगी। यहां ऊपर बनाई गई स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी या ग्रुप चुनें।
- अनसित स्लाइड इमेज लोड करते हैं। चयनित स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के ऊपर स्थित एएफ इंक मार्कर आइकन पर क्लिक करें और ऊतक में ऑटोफ्लोरेसेंस की पहचान करने के लिए अनदाग स्लाइड पर एक लाइन या क्षेत्र खींचें।
- एडिट मार्कर और कलर्स टैब के तहत, प्रत्येक मार्कर के लिए नाम आवंटित करें। छद्म रंग इस कदम पर सौंपा जा सकता है।
नोट: ऑटोफ्लोरेसेंस छवि के लिए रंग डार्कस्लेटग्रे में चूक करता है। इसे ब्लैक में बदलें। - क्लिक करें सभी तैयारकरें ।
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स्पेक्ट्रैली अमिश्रित छवियों का सत्यापन
नोट: जब स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग चरण पूरा हो जाता है, तो सभी रंगों से मिलकर एक समग्र छवि बनाई जाती है।- एडिट द व्यू आई आइकन पर क्लिक करें। यहां, "घटक प्रदर्शन" में प्रत्येक रंग को प्रत्येक व्यक्तिके मार्कर के धुंधला को देखने के लिए बंद किया जा सकता है या चालू किया जा सकता है।
- नेत्रहीन धुंधला और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां मार्कर का कोई अतिव्यापी है, जब तक कि यह जैविक रूप से प्रासंगिक है । एक पैथोलॉजिस्ट धुंधला के रूप में अच्छी तरह से सत्यापित करने में मदद कर सकते हैं ।
नोट: मल्टीप्लेक्स स्लाइड पर धुंधला एक समय में एक फ्लोरोफोर छोड़कर और धुंधला पैटर्न की समीक्षा करके मान्य किया जाना चाहिए । इसके अलावा, सत्यापन एंटीबॉडी क्रॉस टॉक या ब्लीडिंग-थ्रू के कारण आसन्न स्पेक्ट्रा में दिखाई देने वाले मजबूत फ्लोरोफोरस की पहचान करने में भी मदद करेगा। - पैथोलॉजी व्यूकेलिए, जो प्रत्येक फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए ब्राइटफील्ड छवियों का अनुकरण करते हैं, एक घटक छवि बटन का चयन करें। यहां, एक नकली ब्राइटफील्ड छवि देखने के लिए एक मार्कर चुनें।
7. सेल सेगमेंटेशन और फेनोटाइपिंग के माध्यम से बहुप्रतिक्षित छवियों का विश्लेषण करना
नोट: स्पेक्ट्रैली अनमिक्स्ड इमेज को सत्यापित करने के बाद, मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सेल सेगमेंटेशन किया जा सकता है, जो कदम-दर-कदम निर्देश प्रदान करेगा। यहां टिश्यू सेगमेंटेशन नहीं किया गया । यदि पैनल में एक या अधिक ऊतक विशिष्ट मार्कर शामिल है और विशेष रूप से यदि ऊतक गन्दा है, तो ऊतक विभाजन किया जाना चाहिए।
- 'सेगमेंट' विकल्प के तहत'साइटोप्लाज्म'और'झिल्ली'का चयन करें।
नोट: 'नाभिक'डिफ़ॉल्ट रूप से चुना जाता है। - पैनल से एक मार्कर का चयन करें। या तो नाभिक, साइटोप्लाज्म, या झिल्ली का पता लगाने के लिए मार्कर को कॉन्फ़िगर करें। उदाहरण के लिए, झिल्ली के लिए नाभिक और सीडी 3 का पता लगाने के लिए डीपीआई का चयन किया जा सकता है।
- "खोजने के लिएइस संकेत का उपयोग करें"के तहत एक विकल्प का चयन करने के लिए एलिप्सिस बटन ('...') पर क्लिक करें । उदाहरण के लिए, डीपीआई के लिए 'नाभिक'। पैनल से कई मार्कर विभाजन के लिए चुना जा सकता है।
नोट: साइटोप्लाज्मिक या झिल्ली मार्कर के लिए,"परमाणु विभाजन में सहायता के लिए इस संकेत का उपयोग करें"विकल्प का चयन करें। - सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से पता लगाता है और छवि में नाभिक, साइटोप्लाज्म और झिल्ली के लिए एक मुखौटा बनाता है।
- सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाएं विभाजन के लिए 'नकाबपोश' हैं। समायोजित करने के लिए, 7.3में चुने गए विशिष्ट मार्कर के लिए पैथोलॉजी व्यू पर स्विच करें। और सॉफ्टवेयर में विन्यास विकल्पों का उपयोग करें।
- सेगमेंट सेल के लिए'सेगमेंट ऑल'पर क्लिक करें।
- सेल विभाजन के बाद, फेनोटाइपिंग कोशिकाओं के साथ आगे बढ़ें। इस चरण में, फेनोटाइपिंग के लिए आवश्यक मार्कर चुनें और मैन्युअल रूप से कम से कम पांच कोशिकाओं का चयन करें जो चुने गए मार्कर के साथ चमकीले दाग दार हैं। यह सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से छवि में चुने हुए मार्कर के साथ दाग सभी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ट्रेन करता है।
- एक फेनोटाइप नक्शा बनाया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण करें कि मार्कर के साथ दाग कोशिका सही ढंग से फेनोटाइप है।
नोट: सेल फेनोटाइपिंग एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया हो सकती है। यदि सॉफ्टवेयर कोशिकाओं को सही ढंग से फेनोटाइप करने में असमर्थ है, तो इसका मतलब है कि प्रशिक्षण अपर्याप्त या गलत है। इस मामले में, उपयोगकर्ता को मैन्युअल रूप से अधिक कोशिकाओं का चयन करना होगा और सॉफ्टवेयर को फिर से प्रशिक्षित करना होगा और इस कदम को तब तक दोहराना होगा जब तक कि उपयोगकर्ता प्रशिक्षण से संतुष्ट न हो जाए। - "दूसरों" नाम के एक समूह बनाएं और कोशिकाओं है कि मार्कर में से किसी के लिए दाग नहीं कर रहे है शामिल हैं ।
नोट: यह कदम सॉफ्टवेयर को फेनोटाइपिंग से सभी अनसित कोशिकाओं को बाहर करने के लिए प्रशिक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
8. छवियों और विश्लेषण तालिकाओं का निर्यात
- एक्सपोर्ट सेटिंग पैनल देखने के लिए एक्सपोर्ट बटन पर क्लिक करें।
- "निर्यात निर्देशिका" में, छवियों को निर्यात करने के लिए एक स्थान का चयन करने के लिए ब्राउज़ करें।
- "इमेज एक्सपोर्ट ऑप्शंस" में, इमेज आउटपुट फॉर्मेटचुनें।
- "एक्सपोर्ट करने के लिए छवियां" सूची में, निर्यात की जाने वाली छवियों का चयन करें। "समग्र छवि" अंतिम छद्म रंग की अमिश्रित छवि है। "पैथोलॉजी व्यूज" व्यक्तिगत नकली ब्राइटफील्ड छवियां हैं और "घटक छवियां (बहु-छवि झगड़ा)" घटक डेटा की एक बहु-छवि झगड़ा फ़ाइल है जिसका उपयोग तीसरे पक्ष के विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा किया जा सकता है।
- छवियों को निर्यात करनेके लिए 'एक्सपोर्ट फॉर ऑल'बटन पर क्लिक करें।
नोट: विश्लेषण से तालिकाओं का चयन और इस कदम पर निर्यात भी किया जा सकता है।
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Representative Results
जमे हुए तिल्ली वर्गों पर एकल दाग मार्कर का पता लगाने
चूंकि अर्धस्वचालित इमेजिंग सिस्टम एक तरल क्रिस्टल tunable फिल्टर (LCTF) प्रणाली का उपयोग करता है जो तरंगदैर्ध्य का पता लगाने25की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुमति देता है, और क्योंकि यहां कोई सिग्नल प्रवर्धन कदम नहीं उठाए गए थे, हमने पहले माइक्रोस्कोप पर प्रत्येक मार्कर के लिए हमारे प्राथमिक-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने का अनुकूलन किया। एक उदाहरण चित्र ा 1में दिखाया गया है, जहां प्रत्येक एकल दाग मार्कर छद्म रंग का लाल है । एलेक्सा फ्लोर संयुग्मित एंटीबॉडी यहां इस्तेमाल किया इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री के लिए कंपनियों द्वारा मान्य किया गया है । हालांकि, प्रति-सीपी-Cy5.5 फ्लोरोफोर केवल प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मान्य है। हम अपने एकल दाग वाली स्लाइड्स में इस रंग का पता लगाने में सक्षम थे, जो मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग में उपयोग के लिए फ्लो साइटोमेट्री मान्य एंटीबॉडी की उपयुक्तता का समर्थन करते थे और दो अलग-अलग तकनीकों (यानी, फ्लो साइटोमेट्री और मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग) का उपयोग करके टिप्पणियों को मान्य करने के लिए इस तरह के एंटीबॉडी का उपयोग करने का लाभ प्रदान करते थे। हम तो जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए रवाना हुए ।
जमे हुए माउस तिल्ली पर बहुरंगी फ्लोरेसेंस का पता लगाना
मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि और स्पेक्ट्रल इमेजिंग का परीक्षण करने के लिए, हमने माउस फ्रोजन तिल्ली ऊतक का उपयोग किया, जिसमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बहुतायत है। चित्रा 2 जमे हुए माउस तिल्ली के एक वर्ग में विभिन्न मार्कर की एक स्पेक्ट्रैली अमिश्रित छवि दिखाता है। एंटीबॉडी, क्लोन और धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता तालिका 2में वर्णित हैं । कैप्चर की गई छवि सीडी 3, सीडी 4 और सीडी 8 मार्कर की उपस्थिति द्वारा पहचाने गए टी सेल जोन के एक हिस्से को दिखाती है, जो ज्यादातर सीमांत क्षेत्र में देखी गई सीडी 11बी को व्यक्त करने वाली माइलॉयड कोशिकाओं से घिरा हुआ है। Ki67 व्यक्त कोशिकाओं के क्षेत्र मुख्य रूप से अंकुरित केंद्रों में मनाए जाते हैं। प्रत्येक मार्कर के लिए "पैथोलॉजी व्यू" विकल्प ने ऊतक के भीतर अपने व्यक्तिगत धुंधला पैटर्न दिखाया। CD11b, Ki67 और CD3, CD4, और CD8 मार्कर के लिए अलग धुंधला पैटर्न एक साथ देखा गया, सुझाव है कि मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि और स्पेक्ट्रल इमेजिंग जमे हुए ऊतक पर काम किया ।
जमे हुए मानव टॉन्सिल पर बहु रंग फ्लोरेसेंस डिटेक्शन
माउस ऊतक के लिए अनुकूल एक धुंधला पैनल का परीक्षण करने के बाद, हमने अगले जमे हुए मानव टॉन्सिल ऊतक के लिए एक अलग पैनल का आकलन किया। चित्रा 3 उपयोग किए गए विभिन्न मार्कर की एक स्पेक्ट्रैली अमिश्रित छवि दिखाता है। एंटीबॉडी, क्लोन और धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता तालिका 2 में वर्णित हैं । कैप्चर की गई छवि सीडी20 मार्कर द्वारा पहचाने गए बी-कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए एक कूप अंकुरित केंद्र26 दिखाता है। कूप अंकुरित केंद्र में कोशिकाओं का प्रसार Ki67 द्वारा पहचाना गया था । इनमें से कुछ प्रसार कोशिकाएं सीडी 20 के साथ कोस्टाइन की गई हैं और27,भोली बी-कोशिकाएं हो सकती हैं जो सक्रिय दैहिक अतिपरिवर्तन से गुजरती हैं। कूप अंकुरित केंद्र सीडी 3, सीडी 4 और सीडी 8 की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाने गए इंटरफोलिएकुलर टी सेल क्षेत्र से घिरे हुए थे। फिर, अलग धुंधला पैटर्न यहां मनाया गया, पुष्टि है कि कार्यप्रणाली एक जमे हुए ऊतक पर काम किया ।
जमे हुए माउस ट्यूमर ऊतक पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का आवेदन
मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग इम्यूनोथेरपी के लिए एक पूर्वानुमान के रूप में ट्यूमर में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इस उद्देश्य के लिए, हम एक जमे हुए माउस ट्यूमर ऊतक नमूने दाग और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ का पता लगाने के लिए बाहर सेट । एचएलएफ16 सेल लाइन का उपयोग एचएलए-ए * 0201 ट्रांसजेनिक चूहों28में गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर के मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी)+ ट्यूमर मॉडल के रूप में किया जाता है। ट्रांसजेनिक सेल लाइन को एचएलए-ए * 0201 से एचपीवी16 ई6 और ई7 ओंकोजीन और एच-रास वी1228के साथ दिल के फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट को स्थानांतरित करके विकसित किया गया था। टी कोशिकाओं और ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज ट्यूमर29में मौजूद सबसे आम प्रतिरक्षा घुसपैठ कर रहे हैं । चित्रा 4 पैथोलॉजी विचारों के साथ एक जमे हुए HLF16 ट्यूमर अनुभाग पर एक स्पेक्ट्रैली अमिश्रित छवि दिखाता है; व्यक्तिगत धुंधला पैटर्न पूरक चित्रा 1में दिखाया गया है . एंटीबॉडी, क्लोन और धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता तालिका 2 में वर्णित हैं । कैप्चर की गई छवि सीडी 11बी मार्कर द्वारा पहचाने गए अन्य माइलॉयड सेल वंशों की उपस्थिति के साथ CD3 और CD8 मार्कर द्वारा पहचाने गए ट्यूमर-घुसपैठ टी कोशिकाओं के क्षेत्रों को दिखाती है। कब्जा कर लिया क्षेत्र भी ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs), संभवतः M2 फेनोटाइप, CD206 मार्कर30,जो बारीकी से Ki67+के रूप में पता लगाया कई प्रसार कोशिकाओं से जुड़ा हुआ है द्वारा पता चला दिखाता है ।
मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर2 टिश्यू और सेल एनालिसिस जैसी सुविधाओं के साथ आता है। ये विश्लेषण आमतौर पर सिग्नल प्रवर्धन के साथ दाग वाले एफएफपीई ऊतकों पर किए जाते हैं। चूंकि हमारी कार्यप्रणाली सिग्नल प्रवर्धन का उपयोग नहीं करती है, हम यह परीक्षण करना चाहते थे कि क्या सॉफ्टवेयर का उपयोग जमे हुए ऊतकों पर धुंधला का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर की अनुकूली सुविधा का उपयोग करते हुए, हम एक परमाणु और झिल्ली मार्कर के आधार पर और धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले मार्कर के आधार पर कोशिकाओं को खंडित करने में सक्षम थे। चित्रा 5 सेल विभाजन और फेनोटाइप नक्शे और सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण प्रत्येक मार्कर के लिए दाग कोशिकाओं की संख्या से पता चलता है, प्रदर्शन है कि सॉफ्टवेयर जमे हुए ऊतकों पर बहुनिरीक्षण धुंधला के परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्रा 1: तरल क्रिस्टल tunable फिल्टर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राथमिक-conjugated एंटीबॉडी का पता लगाना। संकेत ित मार्कर के लिए प्राथमिक-conjugated एंटीबॉडी एक जमे हुए माउस तिल्ली पर दाग थे और 20x उद्देश्यों के तहत वेक्ट्रा 3.0 बहुनिरीक्षण इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर का पता चला। एलेक्सा फ्लोर 488 पर सीडी 3, एलेक्सा फ्लोर 594 पर सीडी 8, प्रति-सीपी Cy5.5 पर CD11b, एलेक्सा फ्लोर 647 पर CD206, और एलेक्सा फ्लोर 555 पर Ki67 का उपयोग किया गया। प्रत्येक मार्कर छद्म रंग का लाल है। इन स्लाइड्स पर कोई काउंटरदाग इस्तेमाल नहीं किया गया। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एक जमे हुए माउस तिल्ली पर मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग। }A4x उद्देश्यों के तहत ली गई मल्टीप्लेक्स दाग वाली स्लाइड की पूरी स्लाइड स्कैन । ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में 2 x 2 स्टांप मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए चुना गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख)स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के बाद 20x उद्देश्य के तहत ली गई समग्र छवि। छद्म रंग के मार्कर संकेत दिए जाते हैं और लाल बॉक्स के भीतर एक बढ़ाया छवि छवि के बगल में दिखाया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ग)प्रत्येक व्यक्ति के मार्कर के लिए पैथोलॉजी विचार। लाल बॉक्स के भीतर प्रत्येक मार्कर के लिए एक बढ़ाया छवि छवि के बगल में दिखाया गया है । स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एक जमे हुए मानव टॉन्सिल पर मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग। (क)एक 4x उद्देश्य के तहत लिया मल्टीप्लेक्स दाग स्लाइड की पूरी स्लाइड स्कैन । ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में 1 x 1 स्टांप (669 माइक्रोन x 500 माइक्रोन) मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए चुना गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख)20x उद्देश्य के तहत किए गए स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के बाद समग्र छवि। छद्म रंग के मार्कर संकेत दिए जाते हैं और लाल बॉक्स के भीतर एक बढ़ाया छवि छवि के बगल में दिखाया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (ग)प्रत्येक व्यक्ति के मार्कर के लिए पैथोलॉजी विचार। लाल बॉक्स के भीतर प्रत्येक मार्कर के लिए एक बढ़ाया छवि छवि के बगल में दिखाया गया है । स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एक जमे हुए माउस ट्यूमर पर मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग। मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग एक 20x उद्देश्य के तहत लिया एक जमे हुए माउस HLF16 ट्यूमर के एक 1 x 1 क्षेत्र पर किया गया था । समग्र छवि (ऊपर)। छद्म रंग के मार्कर इंगित किए जाते हैं और प्रत्येक व्यक्तिके मार्कर के लिए पैथोलॉजी दृश्य (नीचे) दर्शाया गया है। लाल बॉक्स के भीतर प्रत्येक मार्कर के लिए एक बढ़ाया छवि मूल छवि के बगल में दिखाया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एक जमे हुए माउस ट्यूमर अनुभाग का विश्लेषण। (A)सेल सेगमेंटेशन मैप। इनफॉर्म का उपयोग करके अनुकूली सेल विभाजन किया गया था। सॉफ्टवेयर को नाभिक (हरा) और झिल्ली (लाल) की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। (ख)प्रत्येक दाग मार्कर के लिए फेनोटाइप नक्शे । सॉफ्टवेयर को धुंधला के आधार पर फेनोटाइप की पहचान करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। रंगीन डॉट संकेतित मार्कर का प्रतिनिधित्व करता है। "अन्य" (काला) उन कोशिकाओं को संदर्भित करता है जो संकेतित मार्कर के लिए दाग दार नहीं थे। (ग)बार प्लॉट (मतलब ± एसटीदेव) दो बहुनिरीक्षण छवियों में प्रत्येक मार्कर के लिए दाग कोशिकाओं की संख्या का चित्रण । संख्या प्रत्येक छवि में फेनोटाइप कोशिकाओं को इंगित करती है लेकिन यह इंगित नहीं करती है कि मार्कर को व्यक्त किया जाता है या नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| फ्लोरोफोर | उत्तेजना अधिकतम (एनएम) | उत्सर्जन अधिकतम (एनएम) | फ़िल्टर सेट (नाम) में अपेक्षित पता लगाना |
| एलेक्सा फ्लोर 488 | 488 | 519 | फिटेसी |
| एलेक्सा फ्लोर 555 | 555 | 580 | Cy3 और टेक्सास रेड |
| एलेक्सा फ्लोर 594 | 590 | 617 | टेक्सास रेड |
| एलेक्सा फ्लोर 647 | 650 | 668 | टेक्सास रेड और Cy5 |
| डीपीआई | 350 | 470 | डीपीआई |
| परसीपी-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, टेक्सास रेड और Cy5 |
तालिका 1: फ्लोरोफोरस की सूची उनके अधिकतम उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य और उचित फिल्टर सेट में अपेक्षित पता लगाने के साथ।
| जमे हुए माउस तिल्ली | |||
| एंटीबॉडी/डाये | क्लोन | एकाग्रता (μg/mL) | |
| एलेक्सा फ्लोर 594 एंटी-माउस सीडी8ए | 53-6.7 | 10 | |
| एलेक्सा फ्लोर 488 एंटी-माउस सीडी3 | 17A2 | 20 | |
| एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-माउस सीडी4 | जीके1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 चूहा विरोधी CD11b | M1/70 | 2 | |
| एलेक्सा फ्लोर 555 माउस एंटी-की-67 | B56 | 10 | |
| डीपीआई | 0.1 | ||
| जमे हुए माउस ट्यूमर | |||
| एंटीबॉडी/डाये | क्लोन | एकाग्रता (μg/mL) | |
| एलेक्सा फ्लोर 594 एंटी-माउस सीडी8ए | 53-6.7 | 20 | |
| एलेक्सा फ्लोर 488 एंटी-माउस सीडी3 | 17A2 | 20 | |
| एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-माउस सीडी206 (एमएमआर) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 चूहा विरोधी CD11b | M1/70 | 1 | |
| एलेक्सा फ्लोर 555 माउस एंटी-की-67 | B56 | 0.25 | |
| डीपीआई | 0.1 | ||
| फ्रोजन ह्यूमन टॉन्सिल | |||
| एंटीबॉडी/डाये | क्लोन | एकाग्रता (μg/mL) | |
| एलेक्सा फ्लोर 594 एंटी-ह्यूमन सीडी3 | UCHT1 | 10 | |
| PerCP/Cyanine5.5 मानव विरोधी CD4 | आरपीए-टी4 | 4 | |
| एलेक्सा फ्लोर 647 एंटी-ह्यूमन सीडी8ए | C8/144B | 10 | |
| एलेक्सा फ्लोर 488, ईबायोसाइंस एंटी-ह्यूमन सीडी20 | L26 | 10 | |
| एलेक्सा फ्लोर 555 माउस एंटी-की-67 | B56 | 1 | |
| डीपीआई | 0.1 | ||
तालिका 2: उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी, क्लोन और सांद्रता की सूची।
अनुपूरक चित्र1: स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के बाद जमे हुए HLF16 ट्यूमर के व्यक्तिगत धुंधला पैटर्न । स्केल बार = 20 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मआईफ इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है ताकि प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष विधि32का उपयोग करके ऊतक पर पारंपरिक रूप से तीन से चार मार्कर31 का पता लगाया जा सके । प्रत्यक्ष विधि में, एंटीबॉडी को ऊतक को लेबल करने के लिए रंगों या क्वांटम डॉट्स33 को फ्लोरोस्किंग करने के लिए संयुग्मित किया जाता है, जबकि अप्रत्यक्ष विधि में, एक अकॉन्जुगड प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग ऊतक को लेबल करने के लिए किया जाता है जिसके बाद फ्लोरोफोर-कंजुगेड माध्यमिक एंटीबॉडी होता है जो विशेष रूप से प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानता है। हाल ही में चर्चा किए गए कुछ एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोणों का उपयोग जमे हुए ऊतकों को दाग देने और चार से अधिक मार्कर का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है । लेकिन अभिकर्मकों के लिए लागत और धुंधला करने के लिए लिया गया समय मार्कर की संख्या का पता लगाए जाने के आधार पर गहन हो जाता है । जमे हुए ऊतकों के लिए एक और मल्टीप्लेक्स तकनीक मल्टी-एपिटोप-लिगामेंट-कार्टोग्राफी (एमईएलसी)34है। इस तकनीक में फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेंट एंटीबॉडी, इमेजिंग और फ्लोरोफोर के फोटोब्लीचिंग के साथ नमूने को धुंधला करना शामिल है। इस तकनीक की एक बड़ी चेतावनी यह है कि ऊतक के केवल एक क्षेत्र या क्षेत्र को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स अन्य क्षेत्रों या क्षेत्रों के लिए तकनीक को मैन्युअल रूप से करने की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली है, या स्वचालन की आवश्यकता होती है, जो महंगा है। एक समूह३५ प्रत्यक्ष, अप्रत्यक्ष, और TSA धुंधला के संयोजन का उपयोग कर जमे हुए ऊतकों पर छह रंगों का पता लगाने में सक्षम था । हालांकि टिश्यू धुंधला होने में 2 दिन लग गए। इसकी तुलना में, हमारी कार्यप्रणाली एक एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि का उपयोग करती है जिसमें पांच सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी प्लस डीएपीआई के कॉकटेल के आवेदन को 90 मिनट के भीतर जमे हुए ऊतकों को दाग देने के लिए शामिल किया गया है। इसके अलावा, एक अर्धस्वचालित बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके, हम इस सरलीकृत मल्टीप्लेक्स धुंधला तकनीक का उपयोग करके जमे हुए तिल्ली, टॉन्सिल और ट्यूमर ऊतकों में छह मार्कर का अलग-अलग निरीक्षण करने और उनका पता लगाने में सक्षम थे। Cy3, टेक्सास रेड, और माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध Cy5 फिल्टर सेट अतिरिक्त फ्लोरोफोरस का पता लगाने के लिए अवसर प्रदान करते हैं, जिससे संभावित रूप से मार्कर की संख्या बढ़ रही है जिसे जमे हुए ऊतकों में एक साथ पाया जा सकता है।
एफएफपीई ऊतकों पर टीएसए दृष्टिकोण का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए एक एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण की आवश्यकता होती है जिसके बाद अनुक्रमिक लेबलिंग, धोने और अलग करने वाले कदम होते हैं। एंटीबॉडी6के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊष्मायन समय के आधार पर प्रक्रिया का प्रदर्शन 1-2 दिनों से होता है। हाल ही में, एक माइक्रोफ्लूइडिक ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर, टीएसए दृष्टिकोण का उपयोग करके एक चार-प्लेक्स धुंधला 90 मिन के तहत एफएफपी ऊतकों पर किया गया था। एफएफपीई ऊतकों के लिए अन्य मल्टीप्लेक्स तकनीकों को स्वचालित स्टेनर का उपयोग करके 4-5 घंटे के तहत किया जा सकता है। हालांकि, एंटीबॉडी36के लिए एपिटोप उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है, जो बदले में एंटीबॉडी क्लोन के सावधानीपूर्वक विचार के साथ-साथ मार्कर के आदेश का पता लगाया जा रहा है। उदाहरण के लिए, सीडी 3 के कुछ एंटीबॉडी क्लोन का उपयोग नहीं किया जा सकता है, क्योंकि बाद में सीडी 4 और सीडी 8 एंटीबॉडी37का पता नहीं लगाया जाता है। इसी प्रकार, उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन17,18के बीच एंटीजन डिटेक्शन की परिवर्तनशीलता है । इसलिए, एफएफपीई ऊतकों के मल्टीप्लेक्स धुंधला एंटीबॉडी क्लोन, उनकी सांद्रता, और जिस क्रम में वे दाग रहे हैं, के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो सभी समय लेने वाली है। इसके विपरीत, जमे हुए ऊतकों के व्यापक ऊतक प्रसंस्करण की कमी उच्च विशिष्टता के साथ विभिन्न एंटीबॉडी क्लोन के उपयोग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, जमे हुए ऊतकों के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री और एलिसा में भी किया जा सकता है, जिससे विभिन्न परखों में एक साथ सत्यापन होता है। टिश्यू आर्किटेक्चर भी जमे हुए ऊतकों38में चिंता का विषय है । जमे हुए ऊतकों पर यहां दिखाया गया मल्टीप्लेक्स टीएसए दृष्टिकोण की तुलना में काफी तेज है। फ्लोरोफोर संयोजनों को यह सुनिश्चित करने के लिए मार्कर के सावधानीपूर्वक चयन की आवश्यकता होती है कि एंटीबॉडी एक दूसरे को बाधित न करें, खासकर जब एक ही सेलुलर स्थान में व्यक्त किए गए विभिन्न एंटीजन का पता लगाया जाता है। हमने ऐसे मार्कर चुने जो फ्लोरोफोरस पर विभिन्न कोशिकाओं को दाग देते हैं जो स्पेक्ट्रारैली अलग होते हैं, जिससे बेहतर पता लगाया जा सके। एंटीबॉडी सांद्रता को अनुकूलन की भी आवश्यकता होती है, लेकिन क्योंकि धुंधला प्रोटोकॉल त्वरित है, अनुकूलन के लिए लिया गया समग्र समय समय लेने वाला नहीं है। हमारी विधि के लिए एक चेतावनी ऊतकों में कम व्यक्त मार्कर का पता लगाने में असमर्थता हो सकती है । एफएफपीई ऊतकों पर कुछ मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोणों में एक सिग्नल प्रवर्धन कदम शामिल है जो कम व्यक्त करने वाले मार्कर का पता लगाने के लिए उपयोगी है। हालांकि, सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए माध्यमिक और तृतीयक एंटीबॉडी के उपयोग को नियोजित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, परिणामों की गलत व्याख्या को रोकने के लिए पैनल में एंटीबॉडी के लिए क्रॉस रिएक्टिविटी से बचा जाना चाहिए।
माउस तिल्ली और मानव टॉन्सिल ऊतकों के अलावा, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में समृद्ध हैं, हमने जमे हुए ऊतकों के प्रस्तावित बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए एक उदाहरण के रूप में ट्यूमर ऊतक का उपयोग किया है। ट्यूमर में मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग ने मूल्यवान जानकारी प्रदान की है, जैसे ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME)39की विशेषता, घातक मेलानोमा40में दत्तक टी सेल स्थानान्तरण की सफलता की भविष्यवाणी, और ट्यूमर सिग्नल ट्रांसडुक्शन रास्ते41में प्रोटीन की विशेषता। आमतौर पर ट्यूमर में पाए जाने वाले प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर का उपयोग करते हुए, हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले HLF16 ट्यूमर ऊतक में CD8 टी कोशिकाओं और TAMs घुसपैठ का पता लगाने में सक्षम थे। हमने मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सफलतापूर्वक सेगमेंट और फेनोटाइप कोशिकाओं के लिए किया। एफएफपीई ऊतकों के लिए मल्टीप्लेक्स धुंधला संकेत-से-शोर (एसएनआर) अनुपात को बढ़ाने के लिए एक संकेत प्रवर्धन कदम को नियोजित करता है जो छवि प्रसंस्करण और मात्राकरण42,,43में मदद करता है। मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर का उपयोग एफएफपीई ऊतकों पर विश्लेषण के लिए किया गया है जो सिग्नल प्रवर्धन2से दागित हैं। यहां मौजूद कार्यप्रणाली सिग्नल प्रवर्धन का उपयोग नहीं करती है, लेकिन हम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सफलतापूर्वक सेगमेंट और फेनोटाइप कोशिकाओं को सक्षम थे। आगे के विश्लेषण (जैसे, फेनोटाइप सहअभिव्यक्ति और स्थानिक संबंध) और क्वांटिफिकेशन की सटीक व्याख्या के लिए, सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण के लिए प्रशिक्षण सेट, परीक्षण सेट और सत्यापन सेट का उपयोग करके सत्यापन की आवश्यकता होती है। एक पुनरावृत्ति प्रक्रिया में, छवियों का एक सेट (यानी, प्रशिक्षण सेट) का उपयोग मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर को प्रशिक्षित करने के लिए किया जाता है ताकि फेनोटाइप की पहचान की जा सके जब तक कि छवियों के एक अलग सेट (यानी, परीक्षण सेट) के लिए मॉडल की भविष्यवाणियां सटीक नहीं हो जाती हैं। प्रशिक्षण पूरा होने के बाद, छवियों के एक अंतिम सेट-अलग बैच (यानी, सत्यापन सेट) का विश्लेषण यह देखने के लिए किया जाता है कि क्या ओवर-फिटिंग हुई है।
निष्कर्ष में, यहां प्रस्तुत पद्धति जमे हुए ऊतकों का उपयोग कर बहुनिरीक्षण फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रदर्शन करने का एक तेजी से तरीका है। विधि मार्कर का पता लगाने के लिए उपयोगी है जिससे या तो एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं या एफएफपीई ऊतकों में पता नहीं लगाया जा सकता है। मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में, मात्रात्मक विश्लेषण करने में लगने वाला समय तेजी से प्रीक्लिनिकल और नैदानिक निदान की सुविधा प्रदान कर सकता है और उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के क्षेत्र में लागू किया जा सकता है जो जमे हुए ऊतकों44का उपयोग करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इमेजिंग और विश्लेषण मार्गदर्शन अनुसंधान संसाधन केंद्र द्वारा प्रदान किया गया था - अनुसंधान विज्ञान और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में ऊतक इमेजिंग कोर अनुसंधान के लिए कुलपति के कार्यालय से समर्थन के साथ स्थापित किया। इस काम को NIH/NCI RO1CA191317 द्वारा सीएलपी को, NIH/NIAMS (SBDRC अनुदान 1P30AR075049-01) द्वारा डॉ ए पल्लर को, और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में इम्यूनोथेरेपी मूल्यांकन कोर के लिए रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र के समर्थन से समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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