Summary
Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.
Abstract
Imagens multiespectrais de fluorescência em tecidos parafina-fixados em parafina (FFPE) permitem a detecção de múltiplos marcadores em uma única amostra de tecido que pode fornecer informações sobre coexpressão de antígeno e distribuição espacial dos marcadores. No entanto, a falta de anticorpos adequados para tecidos formalin-fixos pode restringir a natureza dos marcadores que podem ser detectados. Além disso, o método de coloração é demorado. Aqui descrevemos um método rápido para realizar imagens de fluorescência multiespectral em tecidos congelados. O método inclui as combinações de fluoróforos utilizadas, etapas detalhadas para a coloração de camundongos e tecidos congelados humanos e os procedimentos de varredura, aquisição e análise. Para análise de coloração, é utilizado um sistema de imagem multiespectral multiespectral semiautomatizado disponível comercialmente. Através deste método, até seis marcadores diferentes foram manchados e detectados em uma única seção de tecido congelado. O software de análise de aprendizado de máquina pode fenótipo células que podem ser usadas para análise quantitativa. O método descrito aqui para tecidos congelados é útil para a detecção de marcadores que não podem ser detectados em tecidos FFPE ou para os quais os anticorpos não estão disponíveis para os tecidos FFPE.
Introduction
Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando1 e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as informações relacionadas à arquitetura tecidual, distribuição espacial das células e co-expressão de antígenos são capturadas em uma única amostra de tecido2. O uso da tecnologia de imagem de fluorescência multiespectral tornou possível a detecção de múltiplos marcadores biológicos. Nesta tecnologia, utilizando óptica específica, o espectro de fluorescência de cada fluoróforo individual pode ser separado ou "não misturado", permitindo a detecção de múltiplos marcadores sem qualquer crosstalk espectral3. A imagem de fluorescência multiespectral está se tornando uma abordagem crítica na biologia celular, desenvolvimento de fármacos pré-clínicos, patologia clínica e perfil imunológico do tumor4,5,6. É importante ressaltar que a distribuição espaçada das células imunes (especificamente as células CD8 T) pode servir como fator prognóstico para pacientes com tumores existentes7.
Várias abordagens para a coloração de fluorescência multiplex foram desenvolvidas e podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. No método de coloração simultânea, todos os anticorpos são adicionados como um coquetel em um único passo para rotular o tecido. A tecnologia UltraPlex usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com hapten seguido de um coquetel de anticorpos secundários anti-hapten conjugados com fluoroforre. A tecnologia InSituPlex8 usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com DNA únicos que são simultaneamente adicionados ao tecido seguido de um passo de amplificação e finalmente sondas conjugadas com fluoroforre que são complementares a cada seqüência de DNA única no anticorpo primário. Ambas as tecnologias permitem a detecção de quatro marcadores mais 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Duas outras abordagens para coloração multiplex simultânea são baseadas na espectrometria de massa de íons secundária9. O Sistema de Imagem Hyperion usa citometria de massa de imagem10 para detectar até 37 marcadores. Esta tecnologia usa um coquetel de anticorpos conjugados em metal para manchar os tecidos, e áreas específicas dos tecidos são ablatadas por um laser e transferidas para um citómetro de massa onde os íons metálicos são detectados. Outra tecnologia semelhante é o IONPath, que usa tecnologia de imagem de feixe de íons multiplexados11. Esta tecnologia usa um instrumento de espectrometria de massa modificado e uma fonte de íons de oxigênio em vez de laser para abpartir os anticorpos conjugados com metal. Embora todas essas abordagens simultâneas de coloração multiplex permitam a detecção de múltiplos marcadores, os custos envolvidos para conjugar DNA, haptens ou metais a anticorpos, a perda de tecido devido à ablação e o processamento extensivo de imagem para desmisturanão não podem ser subestimados. Além disso, kits e protocolos de coloração estão atualmente disponíveis apenas para tecidos FFPE e o desenvolvimento de painéis personalizados implica tempo e gastos adicionais.
O método sequencial de coloração multiplex, em contraste, inclui rotular o tecido com um anticorpo para um marcador, descascando para remover o anticorpo, seguido por repetições seqüenciais deste processo para rotular múltiplos marcadores12. A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é o método de multiplexação seqüencial mais utilizado. Duas outras tecnologias de multiplexação usam uma combinação de métodos de coloração simultâneas e seqüenciais. A plataforma CODEX13 emprega um coquetel de anticorpos conjugados a sequências únicas de DNA oligonucleotídeo que são eventualmente rotulados com um fluoróforo usando uma etapa de polimerização indexada seguida de imagem, descascamento e repetição do processo para detectar até 50 marcadores. A abordagem de coloração multiplex MultiOmyx14 é uma iteração de coloração com um coquetel de três a quatro anticorpos conjugados com fluoroformes, imagem, saciação dos fluoróforos, e repetindo este ciclo para detectar até 60 marcadores em uma única seção. Semelhante ao método de coloração multiplex simultâneo, enquanto uma ampla gama de marcadores pode ser detectada, o tempo envolvido na coloração, aquisição de imagens, processamento e análise é extenso. A etapa de descascamento/saciedade envolve aquecimento e/ou branqueamento da amostra de tecido e, portanto, a abordagem sequencial de coloração multiplex é comumente realizada em tecidos FFPE que mantêm a integridade do tecido ao aquecer ou branquear.
A fixação da formalina e a incorporação subseqüente de parafina são prontamente realizadas em um ambiente clínico, blocos de tecido são fáceis de armazenar e vários protocolos de coloração multiplex estão disponíveis. No entanto, o processamento, incorporação e deparafinação dos tecidos de FFPE, bem como a recuperação de antígenos15, um processo pelo qual os anticorpos podem acessar melhor os epítopos, é demorado. Além disso, o processamento envolvido nos tecidos ffpe contribui para a autofluorescência16 e mascara epitopes-alvo, resultando na variabilidade e falta de clone de anticorpos disponíveis para detectar antígenos nos tecidos FFPE17,18,19. Um exemplo é o antígeno leucócito humano (HLA) classe I alelos20. Em contraste, o congelamento instantâneo de tecidos não envolve etapas de processamento extensivas antes ou depois da fixação, contornando a necessidade de recuperação de antígenos21,22, e tornando-o benéfico para a detecção de uma gama mais ampla de alvos. Portanto, o uso de tecidos congelados para imagens de fluorescência multiespectrais pode ser valioso para detectar alvos para estudos pré-clínicos e clínicos.
Dadas as limitações acima mencionadas ao usar tecidos FFPE, perguntamos se a imagem de fluorescência multiespectral pode ser realizada em tecidos congelados. Para responder a essa questão, testamos um método de coloração multiplex simultâneo usando um painel de anticorpos conjugados com fluoroforo para detectar múltiplos antígenos e analisamos a coloração usando um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado. Conseguimos simultaneamente manchar até seis marcadores em uma única seção de tecido dentro de 90 minutos.
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Protocol
Os tecidos tumorais de camundongos e hlf1623 foram obtidos em nosso laboratório. O tecido de amígdalas humanas foi comprado de um vendedor comercial. Os detalhes estão fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Incorporação de tecidos
- Incorpore tecido fresco na solução OCT (temperatura de corte ideal) e congele o snap usando gelo seco ou nitrogênio líquido.
- Armazene tecidos a -80 °C.
2. Criosecção
- Corte seções de 8 μm em um criostato com temperaturas fixadas em -25 °C.
NOTA: A espessura da seção preferida pode ser ajustada para gerar imagens mais nítidas. - Coloque seções em lâminas de vidro carregadas.
- Seque as seções por 1 h à temperatura ambiente (RT) antes de fixar em acetona de grau de histologia por 10 min.
NOTA: A acetona causa coagulação de proteínas solúveis em água e extrai lipídios, mas não afeta componentes que contêm carboidratos. Em contrapartida, a formalina preserva a maioria dos lipídios e tem pouco impacto sobre os carboidratos24. A escolha do fixador é importante dependendo da escolha do marcador ser detectado. - Armazene os slides a -20 °C.
3. Seleção de Anticorpos e Fluoróforos
NOTA: Antes da coloração do tecido, os clones de anticorpos que irão manchar robustamente e especificamente seus antígenos de interesse dentro de seções seqüenciais do tecido fixo de acetona devem ser validados. Alguns anticorpos podem exigir um fixação diferente, e sua compatibilidade com outros anticorpos no painel também terá que ser empiricamente determinada. O objetivo também é identificar fluoróforos com sobreposição mínima que podem ser detectadas com os filtros de epifluorescência para DAPI, FITC, Cy3, Texas Red e Cy5.
- Confirme a coloração por iHC convencional ou detecção de imunofluorescência (IF) em seções teciduais com antígeno alvo de expressão conhecido.
- Utilizando os conjuntos de filtros de excitação e emissão disponíveis no sistema de imagem semi-automatizado e depois de testar várias combinações de anticorpos primários conjugados com fluoroforre, prepare fluoróforos para serem usados que tenham sobreposição espectral mínima (por exemplo, ver Tabela 1).
4. Coloração
NOTA: A reidratação tecidual e as lavadoras de slides foram realizadas em um frasco de Coplin. As etapas de bloqueio e incubação de anticorpos foram realizadas em uma caixa de slides umidificada.
- Deixe os slides aquecerem para RT por 5-10 min.
- Reidratar em salina tamponada fosfato (PBS) por 5 min.
- Realize um passo de bloqueio antes de colorir tecidos com anticorpos. Para seções de mouse, use solução de bloqueio especializada (ver Tabela de Materiais) por 10 min no RT. Para seções humanas, use 10% de soro humano agrupado normal (NHS) diluído em PBS por 15 min em RT.
NOTA: Diferentes buffers de bloqueio podem ser testados conforme necessário para preservar as propriedades específicas das seções, dependendo dos procedimentos de seguimento a serem utilizados. - Lave os slides por 5 min na PBS após o bloqueio.
- Para coloração multiplex, prepare um coquetel de anticorpos com fluoróforos compatíveis em diluições ideais predeterminadas.
- Adicione o coquetel de anticorpos conjugados com fluoroforre aos slides. Para coloração de um único marcador, adicione apenas o anticorpo conjugado primário ao slide.
- Inclua um slide não manchado de controle que passa pelo mesmo procedimento de coloração sem a adição de qualquer anticorpo conjugado primário.
- Incubar os slides por 1 h no RT no escuro e, em seguida, lavar os slides 2x com PBS por 5 min cada. A partir de agora, o slide resultante é referido como multiplex-manchado.
- Para contra-manchar, adicione DAPI ao slide manchado de multiplex, incubar por 7 min no escuro em RT e lavar os slides 2x com PBS por 5 min cada. Não contrariar slides manchados e não manchados.
- Para cobrir, adicione uma gota do meio de montagem e coloque suavemente a tampa do vidro sobre o tecido.
5. Preparando uma Biblioteca Espectral
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Aquisição de imagens
- Coloque a potência da lâmpada em 100%. Normalmente, a energia é definida para 10% porque a detecção de fluorescência em tecidos FFPE inclui um passo de amplificação de sinal.
- Comece abrindo o software operacional do microscópio (ver Tabela de Materiais).
- Selecione Editar protocolo e, em seguida, Novo Protocolo.
- Forneça um "Nome de Protocolo", selecione Fluorescência no Modo de Imageme forneça um "Nome de Estudo".
- Coloque os slides de uma mancha no palco e examine cada marcador em seu canal de fluorescência correspondente para garantir a coloração. Escolha uma região no tecido expressando o sinal mais forte para o marcador.
- Ajuste os tempos de exposição usando as opções Autofocus e Autoexpose.
- Adquira instantâneos para os slides manchados e não manchados e salve o protocolo.
NOTA: As etapas a seguir são realizadas em software de aprendizagem de máquina (ver Tabela de Materiais),usando os slides manchados e não manchados para verificar a coloração específica, bem como para determinar a conversa cruzada de anticorpos. - Na guia Construir bibliotecas no software, carregue cada imagem de slide de mancha única, escolha o Fluor apropriado e clique em Extrair. O software extrairá automaticamente o sinal de fluorescência escolhido no Fluor.
- Para salvar a cor extraída, clique em Salvar para armazenar. Um "Novo Grupo" pode ser criado ou a cor extraída pode ser armazenada em um grupo existente.
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Verificando a biblioteca espectral
- Verifique a janela da curva espectral de emissão, localizada à direita da imagem extraída, para cada conjunto de filtros.
NOTA: O sinal extraído está correto se a curva espectral for observada apenas nos conjuntos de filtros onde o flúor é detectado. Se uma curva espectral for observada no conjunto de filtros errado, pode significar que o sinal primário esperado no conjunto de filtros não é forte o suficiente, ou o software está detectando outro sinal que é muito alto, possivelmente devido à sobreposição espectral. Neste caso, primeiro tente usar a ferramenta Draw Processing Regions para desenhar regiões ao redor de áreas que expressam o marcador fluorescente e autofluorescência na imagem. Isso treina o software para detectar o sinal verdadeiro e remover quaisquer sinais de interferência. Se isso não funcionar, repita o processo de coloração do slide manchado único para testar diferentes titulações de anticorpos.
- Verifique a janela da curva espectral de emissão, localizada à direita da imagem extraída, para cada conjunto de filtros.
6. Imagem multiespectral
NOTA: Uma vez que a biblioteca espectral seja criada e verificada, execute as seguintes etapas para o slide manchado de multiplex.
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Varredura de slides inteira
- Ajuste os tempos de foco e exposição no slide manchado de multiplex, conforme mencionado na seção 5.1.
- Em Scan Slides,crie uma nova tarefa e escolha o protocolo salvo acima.
- Faça uma varredura de slides completa no slide manchado de multiplex.
- Usando todo o software de varredura de slides, abra toda a imagem de varredura de slides. Esta imagem não foi espectralmente não misturada.
- Selecione regiões de interesse (ROI) em toda a imagem de varredura de slides usando a ferramenta Carimbo ou ROI. Estes ROIs serão escaneados usando os tempos de exposição definidos em 6.1.1 para serem utilizados para desmistura e análise espectrais.
- Clique em Process Slide para adquirir ROIs em ampliação de 20x
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Desmistura espectral
- Uma vez que os ROIs tenham sido adquiridos, no software de aprendizagem de máquina, na guia Análise Manual, carregue as imagens manchadas multiplex clicando em Abrir em Arquivo.
- No menu suspenso Fonte da Biblioteca Espectral clique em Selecionar Fluors.
- Uma nova janela se abrirá. Aqui, escolha a biblioteca espectral ou grupo criado acima.
- Carregue a imagem de slides não manchada. Clique no ícone do marcador de tinta AF localizado acima da biblioteca espectral selecionada e desenhe uma linha ou região no slide não manchado para identificar a autofluorescência no tecido.
- Na guia Editar marcadores e cores, atribua nomes para cada marcador. Pseudo cores podem ser atribuídas nesta etapa.
NOTA: A cor da imagem Autofluorescence é padrão para DarkSlateGray. Mude isso para black. - Clique em Preparar tudo.
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Verificando imagens espectralmente não misturadas
NOTA: Quando a etapa de desmistura espectral é concluída, uma imagem composta composta por todas as cores é criada.- Clique em Editar o ícone 'Exibir olho'. Aqui, cada cor no "Exibição de Componentes" pode ser desligada ou ligada para visualizar a coloração de cada marcador individual.
- Inspecione visualmente a coloração e a morfologia das células para garantir que não haja sobreposição de marcadores, a menos que seja biologicamente relevante. Um patologista pode ajudar a verificar a coloração também.
NOTA: A coloração no slide multiplexado deve ser validada deixando de fora um flúor de cada vez e revendo o padrão de coloração. Além disso, a validação também ajudará a identificar fluoróforos fortes que aparecem em espectros adjacentes devido à conversa cruzada de anticorpos ou sangramento. - Para Visualizações patológicas,que simulam imagens de campo brilhante para cada marcador fluorescente, clique no botão Selecionar uma imagem componente. Aqui, escolha um marcador para visualizar uma imagem de campo brilhante simulada.
7. Analisar imagens multiespectrais através de segmentação celular e fenotipagem
NOTA: Após verificar a imagem espectralmente não misturada, a segmentação celular pode ser realizada usando o software de aprendizado de máquina, que fornecerá instruções passo a passo. A segmentação do tecido não foi realizada aqui. Se o painel incluir um ou mais marcadores específicos de tecido e especialmente se o tecido estiver bagunçado, a segmentação tecidual deve ser realizada.
- Selecione "Cytoplasm" e "Membrana" na opção "Segment".
NOTA: "Núcleos" é escolhido por padrão. - Selecione um marcador no painel. Configure o marcador para detectar núcleos, citoplasma ou membrana. Por exemplo, o DAPI pode ser selecionado para detectar núcleos e CD3 para membrana.
- Clique no botão ellipsis ('...') para selecionar uma opção em "use este sinal para encontrar". Por exemplo, 'núcleos' para DAPI. Vários marcadores do painel podem ser selecionados para segmentação.
NOTA: Para marcadores citoplasmáticos ou de membrana, selecione a opção "Use este sinal para auxiliar na segmentação nuclear". - O software detecta e cria automaticamente uma máscara para o núcleo, citoplasma e membrana na imagem.
- Certifique-se de que todas as células estão 'mascaradas' para segmentação. Para ajustar, mude para a exibição patológica para o marcador específico escolhido em 7.3. e usar as opções de configuração no software.
- Cliqueem "Segmentar tudo"para segmentar células.
- Após a segmentação celular, prossiga com células fenotipadas. Nesta etapa, escolha os marcadores necessários para a fenotipagem e selecione manualmente pelo menos cinco células que estejam manchadas com o marcador escolhido. Isso treina o software para detectar automaticamente todas as células manchadas com o marcador escolhido na imagem.
- Um mapa fenótipo é criado. Analise para garantir que a célula manchada com o marcador esteja corretamente fenotipo.
NOTA: Fenotipagem celular pode ser um processo iterativo. Se o software não for capaz de fenótipo corretamente as células, significa que o treinamento é inadequado ou incorreto. Neste caso, o usuário tem que selecionar manualmente mais células e retreinar o software e repetir este passo até que o usuário esteja satisfeito com o treinamento. - Crie um grupo chamado "Outros" e inclua células que não estão manchadas para nenhum dos marcadores.
NOTA: Esta etapa é importante para treinar o software para excluir todas as células não manchadas da fenotipagem.
8. Exportando imagens e tabelas de análise
- Clique no botão Exportar para exibir o painel Exportar configurações.
- No "Diretório de exportação", clique em Procurar para selecionar um local para exportar as imagens.
- Em "Opções de exportação de imagens", escolha o formato de saída de imagem.
- Na lista "Imagens para Exportar", selecione as imagens a serem exportadas. "Imagem composta" é a imagem final pseudocolorida e não misturada. "Pathology Views" são as imagens de campo brilhante simuladas individuais e as "Imagens componentes (TIFF multi-imagem)" é um arquivo TIFF de várias imagens de dados componentes que pode ser usado por software de análise de terceiros.
- Clique no botão"Exportar para todos"para exportar as imagens.
NOTA: Tabelas de análise também podem ser selecionadas e exportadas nesta etapa.
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Representative Results
Detecção de marcadores manchados únicos em seções congeladas do baço
Como o sistema de imagem semi-automatizado usa um sistema de filtro de cristal líquido (LCTF) que permite uma gama mais ampla de detecção de comprimento de onda25, e como não foram realizadas etapas de amplificação de sinal aqui, primeiro otimizamos a detecção de nossos anticorpos conjugados primários para cada marcador no microscópio. Um exemplo é mostrado na Figura 1,onde cada marcador de cor única é vermelho pseudocolorido. Os anticorpos conjugados Alexa Fluor utilizados aqui foram validados pelas empresas para imunofluorescência e citometria de fluxo. No entanto, o fluoróforo Per-CP-Cy5.5 só é validado para citometria de fluxo. Fomos capazes de detectar essa cor em nossos slides de colorição única, apoiando a adequação dos anticorpos validados por citometria de fluxo para uso em imagens multiespectrais e fornecendo o benefício de usar tais anticorpos para validar observações usando duas técnicas diferentes (ou seja, citometria de fluxo e imagem multiespectral). Em seguida, passamos a realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.
Detecção de fluorescência multicolor no baço congelado do mouse
Para testar o método de coloração de multiplex e a imagem espectral, usamos tecido de baço congelado de rato, que tem uma abundância de células imunes. A Figura 2 mostra uma imagem espectralmente não misturada de diferentes marcadores em uma seção do baço do mouse congelado. Os anticorpos, clones e concentrações utilizados para coloração são descritos na Tabela 2. A imagem capturada mostra uma parte da zona celular T identificada pela presença de marcadores CD3, CD4 e CD8, cercados por células mieloides expressando CD11b, observadas principalmente na zona marginal. As regiões de células de proliferação expressando Ki67 são observadas principalmente em centros germinais. A opção "Visões patológicas" para cada marcador mostrou seu padrão de coloração individual dentro do tecido. Foram observados padrões de coloração distintos para CD11b, Ki67 e os marcadores CD3, CD4 e CD8, sugerindo que o método de coloração multiplex e a imagem espectral trabalharam no tecido congelado.
Detecção de fluorescência multicolorida em amígdalas humanas congeladas
Depois de testar um painel de coloração adequado para tecido de rato, avaliamos em seguida um painel separado para tecido de amígdalas humanas congelados. A Figura 3 mostra uma imagem espectralmente não misturada dos diferentes marcadores utilizados. Os anticorpos, clones e concentrações utilizadas para coloração são descritos na Tabela 2. A imagem capturada mostra um centro germinal folicular26 expressando células B identificadas pelo marcador CD20. As células proliferadoras do centro germinal folicular foram identificadas por Ki67. Algumas dessas células proliferadoras costanas com CD20 e podem ser centroblastos27, células B ingênuas que sofrem hipermutação somática ativa. Os centros germinais foliculares foram cercados pela região celular T interfollicular identificada pela expressão de CD3, CD4 e CD8. Novamente, foram observados padrões de coloração distintos aqui, confirmando que a metodologia funcionava em um tecido congelado.
Aplicação de imagens de fluorescência multiespectral em tecido tumoral de camundongocongelado
A imagem multiespectral é uma ferramenta útil para monitorar a infiltração de células imunes em tumores como prognóstico para imunoterápicos. Para isso, partimos para manchar uma amostra de tecido tumoral congelado e detectar infiltrações de células imunes. A linha celular HLF16 é usada como papilomavírus humano (HPV)+ modelo tumoral de câncer cervical em camundongos transgênicos HLA-A*020128. A linha celular transgênica foi desenvolvida por fibroblastos pulmonares cardíacos transfeccionadores de HLA-A*0201 com HPV16 E6 e E7 oncogenes e H-Ras V1228. As células T e os macrófagos associados ao tumor são os infiltrados imunológicos mais comuns presentes nos tumores29. A Figura 4 mostra uma imagem espectralmente não misturada em uma seção de tumor HLF16 congelada, juntamente com as visões patológicas; os padrões individuais de coloração são mostrados na Figura Suplementar 1. Os anticorpos, clones e concentrações utilizadas para coloração são descritos na Tabela 2. A imagem capturada mostra regiões de células T infiltradas em tumores identificadas pelos marcadores CD3 e CD8, juntamente com a presença de outras linhagens de células mieloides identificadas pelo marcador CD11b. A região capturada também apresenta macrófagos associados ao tumor (TAMs), possivelmente do fenótipo M2, detectados pelo marcador CD20630, que está intimamente associado a várias células proliferadoras detectadas como Ki67+.
O software de aprendizagem de máquina2 vem com recursos como análises de tecidos e células. Essas análises são comumente realizadas em tecidos FFPE manchados com amplificação de sinal. Como nossa metodologia não utiliza amplificação de sinal, queríamos testar se o software poderia ser usado para analisar a coloração em tecidos congelados. Usando a característica adaptativa do software, conseguimos segmentar células baseadas em um marcador nuclear e de membrana e em células fenótipo baseadas nos marcadores usados para coloração. A Figura 5 mostra os mapas de segmentação celular e fenótipo e o número de células manchadas para cada marcador analisado pelo software, demonstrando que o software pode ser usado para quantificação de manchas multiespectrais em tecidos congelados.
Figura 1: Detectando anticorpos conjugados primários usando um microscópio de filtro de cristal líquido. Os anticorpos conjugados primários aos marcadores indicados foram manchados em um baço de rato congelado e detectados usando o sistema de imagem multiespectral Vectra 3.0 sob objetivos de 20x. CD3 em Alexa Fluor 488, CD8 na Alexa Fluor 594, CD11b no Per-CP Cy5.5, CD206 na Alexa Fluor 647 e Ki67 na Alexa Fluor 555 foram usados. Cada marcador é vermelho pseudo-colorido. Nenhuma contramancha foi usada nestes slides. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem multiespectral em um baço de rato congelado. (A)Varredura total do slide manchado multiplexado feito objetivos 4x. Um carimbo 2 x 2 em diferentes regiões do tecido foi escolhido para imagem multiespectral. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagem composta tirada um objetivo de 20x após a desmistura espectral. Os marcadores pseudocoloridos são indicados e uma imagem ampliada dentro da caixa vermelha é mostrada ao lado da imagem. Barra de escala = 20 μm. (C) Visões patológicas para cada marcador individual. Uma imagem ampliada para cada marcador dentro da caixa vermelha é mostrada ao lado da imagem. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem multiespectral em uma amígdala humana congelada. (A)Varredura total do slide manchado multiplexado feito um objetivo 4x. Um selo 1 x 1 (669 μm x 500 μm) em diferentes regiões do tecido foi escolhido para a imagem multiespectral. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagem composta após a desmistura espectral tomada um objetivo de 20x. Os marcadores pseudocoloridos são indicados e uma imagem ampliada dentro da caixa vermelha é mostrada ao lado da imagem. Barra de escala = 20 μm. (C) Visões patológicas para cada marcador individual. Uma imagem ampliada para cada marcador dentro da caixa vermelha é mostrada ao lado da imagem. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem multiespectral em um tumor de rato congelado. A imagem multiespectral foi realizada em uma região 1 x 1 de um tumor hlf16 de rato congelado, com um objetivo de 20x. A imagem composta (acima). Os marcadores pseudocoloridos são indicados e as visões patológicas (abaixo) para cada marcador individual são representadas. Uma imagem ampliada para cada marcador dentro da caixa vermelha é mostrada ao lado da imagem original. Barra de escala = 20 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de uma seção de tumor de rato congelado. (A)Mapa de segmentação celular. Foi realizada segmentação celular adaptativa utilizando-se inForm. O software foi treinado para identificar núcleos (verde) e membrana (vermelho). (B) Mapas de fenótipo para cada marcador manchado. O software foi treinado para identificar fenótipos com base na coloração. O dot colorido representa o marcador indicado. "Outro" (preto) refere-se a células que não foram manchadas para o marcador indicado. (C) Parcela da barra (média ± STDEV) representando o número de células manchadas para cada marcador em duas imagens multiespectrais. O número indica células fenotiponadas em cada imagem, mas não indica se os marcadores são coexpressos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Flúor | Máximo de excitação (nm) | Máximo de emissão (nm) | Detecção esperada no conjunto de filtros (nome) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | FITC |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 e Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Vermelho do Texas |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Red e Cy5 |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI |
| PerCP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Red e Cy5 |
Tabela 1: Lista de fluoróforos com seus comprimentos de onda de excitação máxima e emissão e detecção esperada em conjuntos de filtros apropriados.
| Baço de rato congelado | |||
| Anticorpo/Tino | Clone | Concentração (μg/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Rato Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 | 10 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| Tumor de rato congelado | |||
| Anticorpo/Tino | Clone | Concentração (μg/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Rato Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 | 0.25 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| Amígdalas Humanas Congeladas | |||
| Anticorpo/Tino | Clone | Concentração (μg/mL) | |
| Alexa Fluor 594 CD3 anti-humano | UCHT1 | 10 | |
| CD 4 anti-humano PerCP/Cyanine5.5 | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 CD8a anti-humano | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humano CD20 | L26 | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 | 1 | |
| DAPI | 0.1 | ||
Tabela 2: Lista de anticorpos, clones e concentrações utilizadas.
Figura suplementar 1: Padrões individuais de coloração do tumor HLF16 congelado após a desmistura espectral. Barra de escala = 20 μm Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Os tecidos congelados têm sido amplamente utilizados para a imagem mIF para detectar tradicionalmente três a quatro marcadores31 em um tecido usando o método direto e indireto32. No método direto, os anticorpos são conjugados a corantes fluorescativos ou pontos quânticos33 para rotular o tecido, enquanto no método indireto, um anticorpo primário não conjugado é usado para rotular o tecido seguido por um anticorpo secundário conjugado com fluoroforme que reconhece especificamente o anticorpo primário. Algumas das recentes abordagens simultâneas de coloração multiplex discutidas anteriormente também podem ser usadas para manchar tecidos congelados e detectar mais de quatro marcadores. Mas o custo para os reagentes e o tempo de coloração tornam-se intensivos dependendo do número de marcadores a serem detectados. Outra técnica multiplex para tecidos congelados é a multi-epítope-ligand-cartografia (MELC)34. A técnica envolve a coloração da amostra com anticorpos florofóricos conjugados, imagens e fotobranqueamento do fluoróforo. Uma grande ressalva desta técnica é que apenas um campo ou região do tecido pode ser multiplexado. Para multiplex arquear outros campos ou regiões, a técnica precisa ser realizada manualmente, o que é demorado, ou requer automação, o que é caro. Um grupo35 foi capaz de detectar seis cores em tecidos congelados usando uma combinação de coloração direta, indireta e TSA. No entanto, a coloração do tecido levou 2 dias. Em comparação, nossa metodologia utiliza um método de coloração multiplex simultâneo envolvendo a aplicação de um coquetel de cinco anticorpos diretamente conjugados mais DAPI para manchar tecidos congelados dentro de 90 minutos. Além disso, usando um sistema de imagem multiespectral de fluorescência semi-automatizada, conseguimos separar e detectar espectralmente seis marcadores em tecidos congelados de baço, amígdalas e tumores usando esta técnica simplificada de coloração multiplex. Os conjuntos cy3, texas red e cy5 disponíveis no microscópio fornecem oportunidades para detectar fluoróforos adicionais, aumentando potencialmente o número de marcadores que podem ser detectados simultaneamente em tecidos congelados.
A coloração multiplex usando a abordagem TSA em tecidos FFPE requer um passo de recuperação de antígeno seguido de etiquetagem seqüencial, lavagem e etapas de descascamento. A realização do procedimento varia de 1 a 2 dias, dependendo dos tempos de incubação utilizados para os anticorpos6. Recentemente, usando um processador de tecido microfluido, uma coloração de quatro plex usando a abordagem TSA foi realizada em tecidos FFPE abaixo de 90 minutos. Outras técnicas multiplex para tecidos FFPE podem ser realizadas abaixo de 4-5 h usando um colorador automatizado. No entanto, as etapas apropriadas de recuperação de antígenos precisam ser otimizadas para garantir a disponibilidade de epítopos para os anticorpos36, que por sua vez se baseia na cuidadosa consideração dos clones de anticorpos, bem como na ordem dos marcadores que estão sendo detectados. Por exemplo, alguns clones de anticorpos de CD3 não podem ser usados, porque posteriormente os anticorpos CD4 e CD8 não são detectados37. Da mesma forma, há variabilidade da detecção de antígenos entre os clones de anticorpos disponíveis17,18. Portanto, a coloração multiplex dos tecidos FFPE requer a otimização dos clones de anticorpos, suas concentrações e a ordem em que eles são manchados, tudo isso é demorado. Em contrapartida, a falta de processamento extensivo de tecidos congelados permite o uso de vários clones de anticorpos com alta especificidade. Além disso, clones de anticorpos disponíveis para tecidos congelados também podem ser usados em citometria de fluxo e ELISA, permitindo validação simultânea em vários ensaios. A arquitetura tecidual também é uma preocupação em tecidos congelados38. A coloração multiplex mostrada aqui em tecidos congelados é significativamente mais rápida do que a abordagem TSA. As combinações de fluoróforos requerem uma seleção cuidadosa de marcadores para garantir que os anticorpos não dificultem esteicamente uns aos outros, especialmente quando diferentes antígenos expressos na mesma localização celular são detectados. Escolhemos marcadores que mancham diferentes células em fluoróforos que são espectralmente separados, permitindo uma melhor detecção. As concentrações de anticorpos também requerem otimização, mas como o protocolo de coloração é rápido, o tempo total necessário para otimização não é demorado. Uma ressalva ao nosso método pode ser a incapacidade de detectar marcadores de baixa expressão nos tecidos. Algumas das abordagens de coloração multiplex em tecidos FFPE envolvem uma etapa de amplificação de sinal que é útil para detectar marcadores de baixa expressão. No entanto, o uso de anticorpos secundários e terciários pode ser empregado para aumentar o sinal. Nesses casos, deve-se evitar a reatividade cruzada aos anticorpos no painel para evitar a interpretação incorreta dos resultados.
Além do baço do camundongo e dos tecidos de amígdalas humanas, que são ricos em células imunes, temos usado o tecido tumoral como exemplo para a imagem de fluorescência multiespectral proposta de tecidos congelados. A imagem multiespectral de fluorescência em tumores forneceu informações valiosas, como caracterizar o microambiente tumoral (TME)39, prever o sucesso das transferências de células T adotivas em melanoma maligno40, e caracterizar proteínas nas vias de transdução de sinaltumoral 41. Usando marcadores específicos para células imunes comumente encontradas em tumores, fomos capazes de detectar células CD8 T infiltradas e TAMs no tecido tumoral HLF16 usado neste estudo. Usamos o software de aprendizado de máquina para segmentar com sucesso células fenótipo. A coloração multiplex para tecidos FFPE emprega uma etapa de amplificação de sinal para melhorar a relação sinal-ruído (SNR) que ajuda o processamento e a quantificação da imagem42,43. O software de aprendizagem de máquina tem sido utilizado para análises em tecidos FFPE manchados com amplificação de sinal2. A metodologia presente aqui não utiliza amplificação de sinal, mas conseguimos segmentar com sucesso células fenótipos usando o software. Para análise sépartia (por exemplo, coexpressão fenótipo e relações espaciais) e interpretação precisa da quantitação, o treinamento de software requer validação usando um conjunto de treinamento, conjunto de testes e conjunto de validação. Em um processo iterativo, um conjunto de imagens (ou seja, o conjunto de treinamento) é usado para treinar o software de aprendizagem de máquina para identificar os fenótipos até que as previsões do modelo para um conjunto separado de imagens (ou seja, o conjunto de testes) sejam precisas. Após a conclusão do treinamento, um lote final de imagens (ou seja, o conjunto de validação) é analisado para ver se houve excesso de encaixe.
Em conclusão, a metodologia aqui apresentada é uma forma rápida de realizar imagens de fluorescência multiespectrais utilizando tecidos congelados. O método é útil para detectar marcadores aos quais os anticorpos não estão disponíveis ou não podem ser detectados em tecidos FFPE. Em conjunto com o software de aprendizagem de máquina, o tempo de realização de análises quantitativas pode facilitar significativamente diagnósticos pré-clínicos e clínicos rápidos e pode ser aplicado no campo da transcrição espacial de alta resolução que utiliza tecidos congelados44.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
A orientação de imagem e análise foi fornecida pelo Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core da Universidade de Illinois em Chicago, criado com o apoio do escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa. O trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI RO1CA191317 ao CLP, pelo NIH/NIAMS (subvenção da SBDRC 1P30AR075049-01) ao Dr. A. Paller, e pelo apoio do Centro De Câncer Integral Robert H. Lurie ao Núcleo de Avaliação de Imunoterapia da Universidade Northwestern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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