Summary
我们描述了一种快速染色方法，用于对冷冻组织进行多光谱成像。
Abstract
在正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 组织中进行多光谱荧光成像，能够检测单个组织样本中的多个标记，从而提供有关标记的抗原共表达和空间分布的信息。然而，缺乏适合正式固定组织的抗体可能会限制可检测到的标记的性质。此外，染色方法非常耗时。在这里，我们描述了一种在冷冻组织中执行多光谱荧光成像的快速方法。该方法包括所使用的荧光波组合、小鼠和人类冷冻组织染色的详细步骤，以及扫描、采集和分析程序。对于染色分析，使用了商用半自动多光谱荧光成像系统。通过这种方法，在单个冷冻组织部分中，多达六个不同的标记被染色和检测。机器学习分析软件可以表型细胞，可用于定量分析。此处描述的冷冻组织方法可用于检测在 FFPE 组织中无法检测到的标记或 FFPE 组织不能针对的抗体。
Introduction
最近显微成像技术的进步大大增进了我们对生物过程和疾病状态的了解和理解。通过致色免疫组织化学（IHC）对组织中的蛋白质进行原位检测，在病理学中进行。然而，使用色谱IHC染色检测多个标记是具有挑战性的1，使用多路免疫荧光（mIF）染色方法的较新的方法，其中多个生物标记标记在单个组织样本上，正在开发中。多个生物标记的检测是有用的，因为有关组织结构、细胞空间分布和抗原共表达的信息都捕获在单个组织样本2中。多光谱荧光成像技术的使用使得检测多种生物标记成为可能。在这项技术中，使用特定的光学元件可以分离或"不混合"每个荧光波的荧光光谱，从而在没有任何光谱串扰3的情况下检测多个标记。多光谱荧光成像正在成为细胞生物学、临床前药物开发、临床病理学和肿瘤免疫功能44、5、65,6的关键方法。重要的是，免疫细胞（特别是CD8 T细胞）的分量可以作为现有肿瘤患者的预后因子7。
已经开发了多种荧光染色的各种方法，可以同时或按顺序执行。在同时染色的方法中，所有抗体在一个步骤中作为鸡尾酒一起加入，以标记组织。UltraPlex 技术使用触觉结合的初级抗体的鸡尾酒，然后采用氟磷结合抗触觉二次抗体的鸡尾酒。InSituPlex 技术8使用独特的 DNA 结合原抗体的混合物，这些抗体同时添加到组织中，然后进行放大步骤，最后是荧光结合探，这些探针与原抗体上每个独特的 DNA 序列相辅相成。这两种技术都能够检测四个标记和4'，6-2-苯胺烯酰胺（DAPI）的核染色。同时进行多路复用染色的另外两种方法是基于二次肌体质谱9。Hyperion 成像系统使用成像质量细胞学10来检测多达 37 个标记。该技术使用金属结合抗体的混合物来染色组织，组织的特定区域被激光清除，并转移到检测到金属离子的量量细胞计中。另一个类似的技术是IONPath，它使用多路复用的ion光束成像技术11。该技术使用经过改进的质谱仪和氧心源代替激光来清除金属偶联抗体。虽然所有这些同时多重染色方法能够检测多个标记，但无法低估将DNA、触觉或金属结合到抗体中所涉及的成本、消融造成的组织损失以及大量用于解混合的图像处理。此外，套件和染色协议目前仅适用于 FFPE 组织，开发定制面板需要额外的时间和支出。
相反，顺序多路复用染色方法包括将带有抗体的组织标记到一个标记，剥离以去除抗体，然后连续重复此过程以标记多个标记12。酪氨酸信号放大 （TSA） 是最常用的顺序多路复用方法。另外两种复用技术采用同时和顺序染色方法的组合。CODEX 平台13采用与独特的 DNA 寡核苷酸序列结合的抗体鸡尾酒，最终使用指数聚合步骤标记荧光磷，然后成像、剥离和重复这一过程，以检测多达 50 个标记。MultiOmyx 多路复用染色方法14是染色的迭代，其混合物由 3 到 4 个荧光素偶联抗体、成像、淬火荧光波和重复此循环来检测单个部分多达 60 个标记。与同时多重染色方法类似，虽然可以检测出广泛的标记，但染色、图像采集、处理和分析的时间也很大。剥离/淬火步骤涉及加热和/或漂白组织样本，因此，顺序多路复用染色方法通常对 FFPE 组织执行，在加热或漂白时保持组织完整性。
正式固定和随后的石蜡嵌入很容易在临床环境中进行，组织块易于存储，并提供多种多路染色方案。然而，FFPE组织的处理、嵌入和去压化，以及抗原检索15，抗体可以更好地获得表皮的过程，是费时的。此外，FFPE组织中的处理有助于自荧光16和口罩目标表皮，导致变异和缺乏抗体克隆可用于检测FFPE组织17，18，19的抗原。17,18,19一个例子是人类白细胞抗原（HLA）类I等位基因20。相反，组织的快速冻结不涉及修复前后的广泛处理步骤，无需对抗原检索21、22,22进行检测，有利于检测更广泛的靶点。因此，使用冷冻组织进行多光谱荧光成像对于检测临床前和临床研究的目标很有价值。
鉴于上述使用FFPE组织的限制，我们询问是否可以对冷冻组织进行多光谱荧光成像。为了解决这个问题，我们测试了一种同时使用荧光素结合抗体面板的多路复用染色方法，以检测多种抗原，并使用半自动多光谱成像系统对染色进行了分析。我们能够在90分钟内同时在单个组织部分中染色多达六个标记。
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Protocol
小鼠脾脏和HLF16小鼠肿瘤组织23是从我们的实验室获得的。人扁桃体组织是从一家商业供应商那里购买的。详情载于资料表。
1. 组织嵌入
- 将新鲜组织嵌入 OCT（最佳切割温度）溶液中，并使用干冰或液氮进行卡扣冻结。
- 将组织储存在-80°C。
2. 冷冻切除
- 在低温器中切割 8 μm 部分，温度设定为 -25 °C。
注：可以调整首选截面厚度以生成更清晰的图像。 - 将部分放置在带电的玻璃幻灯片上。
- 在室温 （RT） 下将部分干燥 1 小时，在组织学级冰冷的丙酮中固定 10 分钟。
注：丙酮导致水溶性蛋白质的凝固，并提取脂质，但不影响含碳水化合物成分。相反，正式在保存大多数脂质，对碳水化合物的影响很小24。固定性选择很重要，具体取决于检测到的标记的选择。 - 将幻灯片存放在 -20 °C。
3. 抗体和氟波拉的选型
注：在组织染色之前，必须验证抗体克隆，这些抗体克隆在丙酮固定组织连续部分内能牢固地具体地染色其感兴趣的抗原。有些抗体可能需要不同的固定性，它们与面板中其他抗体的相容性也必须经过经验确定。目标还包括识别与 DAPI、FITC、Cy3、德州红和 Cy5 的表异荧光过滤器可检测到的重叠最小的荧光球。
- 通过常规 IHC 或免疫荧光 （IF） 检测确认具有已知表达目标抗原的组织部分染色。
- 使用半自动成像系统上提供的激励和发射滤波器集，并在测试氟磷联合初级抗体的各种组合后，准备使用光谱重叠最小的荧光波（例如，见表1）。
4. 染色
注：组织补液和滑动处理是在科普林罐子里进行的。阻塞和抗体孵育步骤在加湿滑盒中执行。
- 让幻灯片加热到 RT 5~10 分钟。
- 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中再水 5 分钟。
- 在用抗体染色组织之前执行阻塞步骤。对于鼠标部分，在 RT 上使用专用阻塞解决方案（参见材料表）10 分钟。对于人类部分，在RT中使用10%的正常人类血清（NHS）稀释15分钟。
注：根据需要测试不同的阻塞缓冲区，以保留各节的特定属性，具体取决于要使用的后续过程。 - 阻塞后，在 PBS 中清洗幻灯片 5 分钟。
- 对于多路染色，在预定的最佳稀释下准备一种具有兼容氟光的抗体鸡尾酒。
- 在幻灯片中加入氟磷联体抗体的鸡尾酒。对于单标记染色，仅将主结合抗体添加到幻灯片中。
- 包括一个控制未染色的幻灯片，该幻灯片无需添加任何原发性抗体即可进行相同的染色过程。
- 在黑暗中 RT 孵化幻灯片 1 小时，然后用 PBS 将幻灯片洗 2x，每张 5 分钟。从这里开始，生成的幻灯片称为多路复用染色。
- 要进行反污，请将 DAPI 添加到多路彩色幻灯片中，在 RT 黑暗中孵育 7 分钟，用 PBS 将幻灯片洗 2x，每次 5 分钟。不要对单染色和未染色的幻灯片进行反染色。
- 要盖防，请添加安装介质的一滴，并轻轻地将玻璃盖玻片放在纸巾上。
5. 准备光谱库
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图像采集
- 将灯泡功率设置为 100%。通常，功率设置为 10%，因为 FFPE 组织的荧光检测包括信号放大步骤。
- 首先打开显微镜操作软件（参见材料表）。
- 选择编辑协议，然后选择新协议。
- 提供"协议名称"，并在成像模式下选择荧光，并提供"研究名称"。
- 将单染色幻灯片放在舞台上，并检查其相应的荧光通道中的每个标记，以确保染色。选择组织上表示标记最强信号的区域。
- 使用"自动对焦"和"自动曝光"选项调整曝光时间。
- 获取单染色和未染色幻灯片的快照并保存协议。
注：以下步骤在机器学习软件中执行（参见材料表），使用单个染色和未染色的幻灯片来验证特定的染色以及确定抗体交叉。 - 在软件中的"生成库"选项卡下，加载每个单染色幻灯片图像，选择适当的 Fluor，然后单击"提取"。该软件将自动提取在荧光中选择的荧光信号。
- 要保存提取的颜色，请单击"保存到存储"。可以创建"新组"，也可以将提取的颜色存储到现有组。
-
验证光谱库
- 检查每个滤镜集位于提取图像右侧的排放光谱曲线窗口。
注：如果仅在检测到荧光的滤波器集中观察到光谱曲线，则提取的信号是正确的。如果在错误的滤波器集中观察到光谱曲线，则可能意味着滤波器集中预期的主信号不够强，或者软件检测到另一个过高的信号，可能是由于频谱重叠。在这种情况下，首先尝试使用绘制处理区域工具在图像中表示荧光标记和自动荧光的区域周围绘制区域。这将训练软件以检测真实信号并删除任何干扰信号。如果这不起作用，请重复单染色幻灯片的染色过程，以测试不同的抗体滴定。
- 检查每个滤镜集位于提取图像右侧的排放光谱曲线窗口。
6. 多光谱成像
注：创建和验证光谱库后，对多路复用染色幻灯片执行以下步骤。
-
整个幻灯片扫描
- 调整第 5.1 节中所述的多路彩色幻灯片上的焦点和曝光时间。
- 在"扫描幻灯片"下，创建新任务并选择上面保存的协议。
- 在多路复用彩色幻灯片上执行整个幻灯片扫描。
- 使用整个幻灯片扫描软件，打开整个幻灯片扫描图像。此图像尚未在光谱上未混合。
- 使用"图章"或"ROI"工具在整个幻灯片扫描图像中选择感兴趣的区域 （ROI）。这些 ROIs 将使用 6.1.1 中设置的曝光时间进行扫描，用于光谱解混合和分析。
- 单击"流程幻灯片"以 20 倍放大倍率获取 RO
-
光谱解混合
- 获取 RO 后，在机器学习软件中，在"手动分析"选项卡下，通过单击"在文件下打开"加载多路复用染色图像。
- 在"光谱库源"下拉菜单中，单击"选择荧光"。
- 将打开一个新窗口。在这里，选择上面创建的光谱库或组。
- 加载未染色的幻灯片图像。单击位于所选光谱库上方的自动对焦墨标记图标，并在未染色的幻灯片上绘制一条线或区域，以识别组织中的自荧光。
- 在"编辑标记和颜色"选项卡下，为每个标记分配名称。可以在此步骤中分配伪颜色。
注：自动荧光图像的颜色默认为 DarkSlateGray。将此选项更改为黑色。 - 单击"全部准备"。
-
验证光谱未混合图像
注：完成光谱解混合步骤后，将创建由所有颜色组成的合成图像。- 单击"编辑视图眼"图标。在这里，"组件显示"中的每个颜色都可以关闭或打开以查看每个标记的污渍。
- 目视检查细胞的染色和形态，以确保标记没有重叠，除非它与生物学相关。病理学家可以帮助验证染色。
注：应通过一次排除一个荧光磷并检查染色模式来验证多路复用滑轨上的染色。此外，验证还有助于识别由于抗体交叉或出血而出现在相邻光谱中的强荧光波。 - 对于模拟每个荧光标记的明亮场图像的病理视图，单击"选择组件图像"按钮。在这里，选择一个标记来查看模拟的明亮场图像。
7. 通过细胞分割和Phenotying分析多光谱图像
注：在验证光谱未混合图像后，可以使用机器学习软件执行细胞分割，该软件将提供分步说明。此处未执行组织分割。如果面板包含一个或多个组织特定的标记，特别是如果组织是凌乱的，组织分割应执行。
- 在"段"选项下选择"细胞质"和"膜"。
注："核"是默认选择的。 - 从面板中选择标记。配置标记以检测核、细胞质或膜。例如，可以选择 DAPI 来检测膜的原子核和 CD3。
- 单击省略号按钮 （'...'） 以选择"使用此信号查找"下的选项。例如，DAPI 的"核"。可以选择面板中的多个标记进行分割。
注：对于细胞质或膜标记，选择"使用此信号协助核分割"选项。 - 该软件自动检测并创建一个蒙版，分别用于图像中的原子核、细胞质和膜。
- 确保所有单元格都"屏蔽"以进行分割。要进行调整，请切换到病理学视图，了解7.3中选择的特定标记。并使用软件中的配置选项。
- 单击"全部分割"以分割单元格。
- 细胞分割后，继续对细胞进行平化。在此步骤中，选择标型所需的标记，并手动选择至少五个带有所选标记颜色的单元格。这将训练软件，然后自动检测所有沾有图像中所选标记的细胞。
- 将创建表型映射。分析以确保带有标记的细胞正确表型。
注：细胞平定可以是一个迭代过程。如果软件无法正确表型细胞，则表示训练不足或不正确。在这种情况下，用户必须手动选择更多单元格并重新训练软件，并重复此步骤，直到用户对培训感到满意。 - 创建名为"其他"的组，并包含未为任何标记染色的单元格。
注：此步骤对于训练软件以将所有未染色的细胞排除在色平之外非常重要。
8. 导出图像和分析表
- 单击"导出"按钮以查看"导出设置"面板。
- 在"导出目录"中，单击"浏览"以选择导出图像的位置。
- 在"图像导出选项"中，选择图像输出格式。
- 在"要导出的图像"列表中，选择要导出的图像。"合成图像"是最终的伪彩色未混合图像。"病理视图"是单个模拟的明亮场图像，"组件图像（多图像 TIFF）"是组件数据的多图像 TIFF 文件，可用于第三方分析软件。
- 单击"全部导出"按钮导出图像。
注：在此步骤中也可以选择和导出分析表。
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Representative Results
检测冷冻脾脏部分的单染色标记
由于半自动成像系统使用液晶可调滤波器（LCTF）系统，允许更广泛的波长检测25，并且由于这里没有执行信号放大步骤，我们首先优化了显微镜上每个标记的初级结合抗体的检测。如图 1所示，其中每个单染色标记均为伪彩色红色。此处使用的Alexa Fluor偶联抗体已通过公司验证为免疫荧光和流细胞测定。但是，Per-CP-Cy5.5 荧光波只经过流量细胞测定验证。我们能够在我们的单染色幻灯片中检测到这种颜色，支持流细胞测量验证抗体是否适合用于多光谱成像，并提供了使用这种抗体使用两种不同技术（即流细胞学和多光谱成像）验证观测结果的好处。然后，我们继续对冷冻组织进行多光谱成像。
冷冻小鼠脾脏的多色荧光检测
为了测试多路染色方法和光谱成像，我们使用小鼠冷冻脾组织，具有丰富的免疫细胞。图 2显示了冷冻小鼠脾脏部分中不同标记的光谱未混合图像。表2描述了用于染色的抗体、克隆物和浓度。捕获的图像显示了由CD3、CD4和CD8标记物识别的T细胞区域的一部分，周围是表达CD11b的骨髓细胞，大多在边缘区域观察到。表达Ki67的增殖细胞区域主要在发芽中心观察到。每个标记的"病理视图"选项显示了其组织内的个体染色模式。观察了CD11b、Ki67和CD3、CD4和CD8标记的不同染色模式，表明多路染色方法和光谱成像对冷冻组织有效。
冷冻人扁桃体多色荧光检测
在测试了适合小鼠组织的染色板后，我们接下来评估了冷冻人体扁桃体组织的独立面板。图 3显示了所用不同标记的光谱未混合图像。表2描述了用于染色的抗体、克隆物和浓度。捕获的图像显示了一个卵泡发芽中心26，表示由CD20标记识别的B细胞。Ki67鉴定了卵泡生殖中心的增殖细胞。其中一些增殖细胞与CD20结合，可能是中腹27，天真的B细胞，经历活性体细胞超突变。毛囊发芽中心被CD3、CD4和CD8表达确定的叶角T细胞区域所包围。再次，在这里观察到不同的染色模式，证实该方法在冷冻组织上起作用。
多光谱荧光成像在冷冻小鼠肿瘤组织中的应用
多光谱成像是监测免疫细胞渗透肿瘤的有用工具，作为免疫疗法的预后。为此，我们开始染色冷冻小鼠肿瘤组织样本，并检测免疫细胞渗透。HLF16细胞系用作HLA-A_0201转基因小鼠28中的人类瘤病毒（HPV）和宫颈癌肿瘤模型。转基因细胞系是由从HLA-A_0201转染心肺成纤维细胞与HPV16 E6和E7肿瘤基因和H-Ras V1228开发的。T细胞和肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤29中最常见的免疫渗透。图 4显示了冻结 HLF16 肿瘤部分的光谱未混合图像以及病理视图;个别染色图案在补充图1中显示。表2描述了用于染色的抗体、克隆物和浓度。捕获的图像显示了 CD3 和 CD8 标记识别的肿瘤渗透 T 细胞区域，以及 CD11b 标记识别的其他骨髓细胞谱系的存在。捕获的区域还显示肿瘤相关的巨噬细胞 （TAM），可能是由 CD206 标记30检测到的 M2 表型，它与检测到的 Ki67+检测到的几个增殖细胞密切相关。
机器学习软件2附带了组织和细胞分析等功能。这些分析通常对沾有信号放大的 FFPE 组织执行。由于我们的方法不使用信号放大，我们希望测试软件是否可用于分析冷冻组织上的染色。利用软件的自适应特性，我们能够基于核标记和膜标记对细胞进行分段，并根据用于染色的标记进行表型细胞。图 5显示了软件分析的每个标记的细胞分割和表型图以及染色细胞的数量，证明该软件可用于定量冷冻组织上的多光谱染色。
图1：使用液晶可调滤镜显微镜检测原结合抗体。在冷冻小鼠脾脏上染色了指示标记的原结合抗体，并在20倍目标下使用Vectra 3.0多光谱成像系统进行检测。使用 Alexa Fluor 488 上的 CD3，在 Alexa Fluor 594 上的 CD8，在 Per-CP Cy5.5 上的 CD11b，在 Alexa Fluor 647 上的 CD206，使用 Alexa Fluor 555 上的 Ki67。每个标记都是伪彩色的红色。这些幻灯片上未使用反污。刻度柱 = 20 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：冷冻小鼠脾脏上的多光谱成像。（A） 在 4 倍目标下拍摄的多路复用彩色幻灯片的整个幻灯片扫描。在组织的不同区域选择一个2 x 2的邮票进行多光谱成像。刻度柱 = 100 μm。（B） 光谱解混合后在 20 倍目标下拍摄的复合图像。指示伪彩色标记，并在图像旁边显示红色框中的放大图像。刻度柱 = 20 μm。（C） 每个标记的病理学观点。图像旁边显示红色框中每个标记的放大图像。刻度柱 = 20 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：冷冻人扁桃体上的多光谱成像。（A） 在 4x 目标下拍摄的多路复用彩色幻灯片的整个幻灯片扫描。选择一个1 x 1戳（669 μm x 500 μm）穿过组织的不同区域进行多光谱成像。刻度柱 = 100 μm。（B） 光谱解混合后在 20 倍目标下拍摄的复合图像。指示伪彩色标记，并在图像旁边显示红色框中的放大图像。刻度柱 = 20 μm。（C） 每个标记的病理学观点。图像旁边显示红色框中每个标记的放大图像。刻度柱 = 20 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：冷冻小鼠肿瘤的多光谱成像。在20x目标下拍摄的冷冻小鼠HLF16肿瘤的1×1区域进行了多光谱成像。复合图像（上图）。指示伪彩色标记，并描绘每个标记的病理视图（下图）。原始图像旁边显示红色框中每个标记的放大图像。比例尺 = 20 μm请单击此处查看此图形的较大版本。
图5：冷冻小鼠肿瘤部分分析。（A） 单元格分割映射。使用 inForm 执行自适应单元格分段。该软件经过培训，以识别核（绿色）和膜（红色）。（B） 每个染色标记的表型图。该软件经过培训，可以根据染色物识别表型。彩色点表示指示的标记。"其他"（黑色）是指未为指示标记染色的细胞。（C） 条形图 （均值 = STDEV）， 描绘两个多光谱图像中每个标记的染色细胞数。数字指示每个图像中表型的单元格，但不指示标记是否共同表达。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 荧光 | 激发最大值（nm） | 最大排放（nm） | 筛选器集中的预期检测（名称） |
| 亚历克萨·弗卢488 | 488 | 519 | FITC |
| 亚历克萨·弗卢 555 | 555 | 580 | Cy3 和德州红 |
| 亚历克萨·弗卢 594 | 590 | 617 | 得克萨斯红 |
| 亚历克萨·弗卢 647 | 650 | 668 | 得克萨斯州红色和Cy5 |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI |
| PerCP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3， 得克萨斯州红色和 Cy5 |
表1：具有最大激发和发射波长的荧光源列表，以及适当过滤器集中的预期检测。
| 冷冻鼠标脾脏 | |||
| 抗体/染料 | 克隆 | 浓度（μg/mL） | |
| 亚历克萨·弗卢594反老鼠CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| 亚历克萨·福洛 488 防鼠 CD3 | 17A2 | 20 | |
| 亚历克萨·福禄 647 防鼠 CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 大鼠抗CD11b | M1/70 | 2 | |
| 亚历克萨·弗卢 555 小鼠抗基-67 | B56 | 10 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| 冷冻小鼠肿瘤 | |||
| 抗体/染料 | 克隆 | 浓度（μg/mL） | |
| 亚历克萨·弗卢594反老鼠CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| 亚历克萨·福洛 488 防鼠 CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 防鼠 CD206 （MMR） | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 大鼠抗CD11b | M1/70 | 1 | |
| 亚历克萨·弗卢 555 小鼠抗基-67 | B56 | 0.25 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| 冷冻人类通蒂尔 | |||
| 抗体/染料 | 克隆 | 浓度（μg/mL） | |
| 亚历克萨·弗卢594抗人类CD3 | UCHT1 | 10 | |
| PerCP/氰化物5.5抗人类CD4 | RPA-T4 | 4 | |
| 亚历克萨·弗卢647抗人类CD8a | C8/144B | 10 | |
| 亚历克萨·弗卢尔 488， eBioscience 反人类 CD20 | L26 | 10 | |
| 亚历克萨·弗卢 555 小鼠抗基-67 | B56 | 1 | |
| DAPI | 0.1 | ||
表2：抗体、克隆和所用浓度的列表。
补充图1：光谱解混合后冷冻HLF16肿瘤的个体染色模式。比例尺 = 20 μm请点击这里下载此图。
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Discussion
冷冻组织已广泛用于mIF成像，传统上使用直接和间接方法32检测组织上的3到4个标记31。在直接方法中，抗体与荧光染料或量子点33结合以标记组织，而在间接方法中，非结合原抗体用于标记组织，然后由专门识别原抗体的氟磷结合二次抗体标记。前面讨论的一些最近同时使用的多路复用染色方法也可用于染色冷冻组织和检测四个以上的标记。但是，根据检测到的标记数量，试剂的成本和染色时间会变得密集。冷冻组织的另一种多路复用技术是多上皮-配体制图（MELC）34。该技术涉及用荧光球结合抗体染色样品，成像和荧光球的光漂白。这项技术的一个主要警告是，只有一个场或区域的组织可以多路复用。为了多路复用其他字段或区域，需要手动执行技术，这非常耗时，或者需要自动化，这非常昂贵。一组35能够检测冷冻组织上的六种颜色，使用直接、间接和TSA染色的组合。然而，组织染色花了2天。相比之下，我们的方法采用同时多路染色的方法，涉及在90分钟内应用五种直接结合抗体加DAPI的混合物来染色冷冻组织。此外，利用半自动多光谱荧光成像系统，我们能够使用这种简化的多路复用染色技术，对冷冻脾脏、扁桃体和肿瘤组织中六个标记进行光谱分离和检测。显微镜上提供的 Cy3、Texas Red 和 Cy5 过滤器组提供了检测更多荧光球的机会，从而有可能增加在冷冻组织中同时检测到的标记数。
在 FFPE 组织中使用 TSA 方法进行多路染色需要抗原检索步骤，然后进行顺序标记、洗涤和剥离步骤。执行手术的时间从1-2天不等，取决于抗体6的孵育时间。最近，使用微流体组织处理器，在90分钟以下对FFPE组织进行了使用TSA方法的四丛染色。FFPE 组织的其他多路复用技术可在 4-5 小时以下使用自动染色器执行。然而，适当的抗原检索步骤需要优化，以确保抗体36的表上可用，这反过来又依赖于对抗体克隆的仔细考虑以及检测标记的顺序。例如，CD3的某些抗体克隆不能使用，因为随后的CD4和CD8抗体未检测到37。同样，可用的抗体克隆17、18,18中也有抗原检测的可变性。因此，FFPE组织的多路染色需要优化抗体克隆、其浓度和染色顺序，所有这些都非常耗时。相反，缺乏广泛的组织处理冷冻组织允许使用各种抗体克隆高特异性。此外，可用于冷冻组织的抗体克隆也可用于流细胞测定和ELISA，允许在各种检测中同时验证。组织结构也是冷冻组织38中的问题。此处显示的冷冻组织上的多路染色明显快于 TSA 方法。荧光波组合需要仔细选择标记，以确保抗体不会相互有异可做，特别是当检测到同一细胞位置表达的不同抗原时。我们选择的标记在荧光波上染色不同的细胞，这些标记在光谱上是分开的，从而可以更好地检测。抗体浓度也需要优化，但由于染色协议快速，优化所需的总时间并不耗时。我们方法的一个警告可能是无法检测组织中的低表达标记。FFPE组织上的一些多路复用染色方法涉及信号放大步骤，可用于检测低表达标记。然而，可以使用二级和三级抗体来增强信号。在这种情况下，应避免对面板中的抗体进行交叉反应，以防止对结果的解释不正确。
除了富含免疫细胞的小鼠脾脏和人体扁桃体组织外，我们还以肿瘤组织为例，用于建议的冷冻组织的多光谱荧光成像。肿瘤多光谱荧光成像提供了有价值的信息，如描述肿瘤微环境（TME）39，预测恶性黑色素瘤3940中采用T细胞转移的成功，以及肿瘤信号转导途径41中的蛋白质特征。利用肿瘤中常见的免疫细胞特有的标记，我们能够在本研究中使用的HLF16肿瘤组织中检测到渗透的CD8 T细胞和TAMs。我们使用机器学习软件成功分段和表型细胞。FFPE组织的多路复用染色采用信号放大步骤，以提高信噪（SNR）比，帮助图像处理和定量42，43。42,机器学习软件已用于分析带有信号放大2的FFPE组织。此处存在的方法不使用信号放大，但我们能够使用该软件成功分割和表型细胞。为了进一步分析（例如，表型共表达和空间关系）和准确解释定量，软件培训需要使用训练集、测试集和验证集进行验证。在迭代过程中，一组图像（即训练集）用于训练机器学习软件以识别表型，直到模型对一组单独的图像（即测试集）的预测准确无误。培训完成后，将分析最后一批预留的图像（即验证集），以查看是否有过度拟合。
最后，本文介绍的方法是一种使用冷冻组织进行多光谱荧光成像的快速方法。该方法可用于检测在 FFPE 组织中检测抗体不可用或无法检测到的标记。结合机器学习软件，进行定量分析所花时间可以显著促进临床前和临床的快速诊断，并可应用于利用冷冻组织44的高分辨率空间转录组学领域。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
成像和分析指导由研究资源中心提供——芝加哥伊利诺伊大学研究组织学和组织成像核心，该中心由研究副校长办公室提供支持。这项工作得到了NIH/NCI RO1CA191317对中电的支持，国家卫生研究院/NIAMS（SBDRC向A.Paller博士授予1P30AR075049-01），以及罗伯特·卢里综合癌症中心对西北大学免疫治疗评估核心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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