Summary
Vi beskriver en hurtig farvningmetode til at udføre multispektral billeddannelse på frosset væv.
Abstract
Multispektraderende fluorescensbilleddannelse på formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv gør det muligt at påvise flere markører i en enkelt vævsprøve, der kan give oplysninger om antigen samekspression og rumlig fordeling af markørerne. Manglen på egnede antistoffer mod formalinfast væv kan dog begrænse arten af markører, der kan påvises. Desuden er farvningsmetoden tidskrævende. Her beskriver vi en hurtig metode til at udføre multispektral fluorescensscanning på frosset væv. Metoden omfatter fluorophore kombinationer, der anvendes, detaljerede trin til farvning af mus og menneskelige frosne væv, og scanning, erhvervelse og analyse procedurer. Til farvningsanalyse anvendes et kommercielt tilgængeligt halvautomatisk multispektral fluorescensbilledsystem. Ved hjælp af denne metode blev op til seks forskellige markører farves og detekteret i en enkelt frossen vævssektion. Machine learning analysis software kan fænotypeceller, der kan bruges til kvantitativ analyse. Den metode, der er beskrevet her for frosset væv, er nyttig til påvisning af markører, der ikke kan påvises i FFPE-væv, eller for hvilke der ikke er antistoffer til rådighed for FFPE-væv.
Introduction
De seneste fremskridt inden for mikroskopiske billeddannelsesteknikker har forbedret vores viden og forståelse af biologiske processer og sygdomstilstande betydeligt. In situ påvisning af proteiner i væv via kromoogen immunhistokemi (IHC) udføres rutinemæssigt i patologi. Påvisning af flere markører ved hjælp af kromoogen IHC-farvning er imidlertid udfordrende1, og nyere metoder til anvendelse af multiplex immunofluorescens (mIF) farvningsmetoder, hvor flere biologiske markører er mærket på en enkelt vævsprøve, er under udvikling. Påvisning af flere biologiske markører er nyttig, fordi oplysninger om vævsarkitektur, rumlig fordeling af celler og antigen-samekspression alle er fanget i en enkelt vævsprøve2. Brugen af multispektral fluorescensbilleddannelsesteknologi har gjort det muligt at påvise flere biologiske markører. Ved hjælp af specifik optik kan fluorescenssen for hver enkelt fluorophore adskilles eller "ublandede", hvilket gør det muligt at påvise flere markører uden spektralkrydstale3. Multispektraderende fluorescens imaging er ved at blive en kritisk tilgang i cellebiologi, præklinisk lægemiddeludvikling, klinisk patologi, og tumor immun-profilering4,5,6. Vigtigere er det, den spacial fordeling af immunceller (specielt CD8 T-celler) kan tjene som en prognosefaktor for patienter med eksisterende tumorer7.
Forskellige tilgange til multiplex fluorescens farvning er blevet udviklet og kan udføres enten samtidigt eller sekventialt. I den samtidige farvningsmetode tilsættes alle antistofferne sammen som en cocktail i et enkelt trin for at mærke vævet. UltraPlex-teknologi bruger en cocktail af hapten-konjugerede primære antistoffer efterfulgt af en cocktail af fluorophore-konjugerede anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex teknologi8 bruger en cocktail af unikke DNA-konjugerede primære antistoffer, der samtidig føjes til vævet efterfulgt af en forstærkning trin og endelig fluorophore-konjugerede sonder, der supplerer hver unik DNA-sekvens på det primære antistof. Begge disse teknologier gør det muligt at påvise fire markører plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) til nuklear farvning. To andre metoder til samtidig multiplexfarvning er baseret på sekundært ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruger billeddannelse masse cytometri10 til at opdage op til 37 markører. Denne teknologi bruger en cocktail af metal-konjugerede antistoffer til pletter væv, og specifikke områder af væv er ablated af en laser og overføres til en masse cytometer, hvor metalioner detekteres. En anden lignende teknologi er IONPath, som bruger multiplexed ion stråle imaging teknologi11. Denne teknologi bruger et modificeret massespektrometriinstrument og en iltionskilde i stedet for laser til at ablatede de metalkonjugerede antistoffer. Mens alle disse samtidige multiplex farvning tilgange gør det muligt at påvise flere markører, omkostningerne forbundet med konjugering DNA, haptens, eller metaller til antistoffer, tab af væv på grund af ablation, og den omfattende billedbehandling for unmixing kan ikke undervurderes. Desuden er kits og farvningprotokoller i øjeblikket kun tilgængelige for FFPE-væv, og udvikling af brugerdefinerede paneler medfører yderligere tid og udgifter.
Den sekventielle multiplex farvning metode, derimod, omfatter mærkning af vævet med et antistof til en markør, stripning at fjerne antistoffet, efterfulgt af sekventielle gentagelser af denne proces til at mærke flere markører12. Forstærkningen af tyramidsignalet (TSA) er den hyppigst anvendte sekventielle multipleksingmetode. To andre multipleksing teknologier bruger en kombination af samtidige og sekventielle farvning metoder. CODEX-platformen13 anvender en cocktail af antistoffer, der er konjugeret til unikke DNA-oligonukleotidsekvenser, der i sidste ende mærkes med en fluorophore ved hjælp af et indekseret polymeriseringstrin efterfulgt af billeddannelse, stripning og gentagelse af processen for at detektere op til 50 markører. MultiOmyx multiplex-farvningsmetoden14 er en gentagelse af farvning med en cocktail af tre til fire fluorophore-konjugerede antistoffer, billeddannelse, dæmpning af fluorophores og gentagelse af denne cyklus for at detektere op til 60 markører på en enkelt sektion. Svarende til den samtidige multiplex farvning metode, mens en bred vifte af markører kan detekteres, den tid, der er involveret i farvning, billede erhvervelse, behandling og analyse er omfattende. Stripping / quenching trin indebærer opvarmning og / eller blegning af vævsprøve og dermed den sekventielle multiplex farvning tilgang er almindeligt udført på FFPE væv, der opretholder væv integritet ved opvarmning eller blegning.
Formalin fiksering og efterfølgende paraffin indlejring er let udføres i en klinisk indstilling, væv blokke er nemme at gemme, og flere multiplex farvning protokoller er tilgængelige. Men, behandling, indlejring, og deparaffinization af FFPE væv, samt antigen hentning15, en proces, hvorved antistoffer bedre kan få adgang epitoper, er tidskrævende. Desuden bidrager den behandling, der er involveret i FFPE-væv, til autofluorescens16 og masker er rettet mod epitoper, hvilket resulterer i variabilitet og mangel på antistofklon til rådighed til påvisning af antigener i FFPE-væv17,18,19. Et eksempel er det humane leukocytantigen (HLA) klasse I alleler20. I modsætning hertil indebærer fastfrysning af væv ikke omfattende behandlingstrin før eller efter fastsættelse, omgåelse af behovet for antigenudtagning21,22og gør det gavnligt at påvise en bredere vifte af mål. Derfor kan det være værdifuldt at bruge frosset væv til multispektral fluorescensscanning til at påvise mål for prækliniske og kliniske undersøgelser.
I betragtning af ovennævnte begrænsninger ved brug af FFPE-væv spurgte vi, om multispektral fluorescensbilleddannelse kan udføres på frosset væv. For at løse dette spørgsmål, vi testede en samtidig multiplex farvning metode ved hjælp af et panel af fluorophore-konjugerede antistoffer til at opdage flere antigener og analyseret farvning ved hjælp af en semiautomated multispektral imaging system. Vi var i stand til samtidig plette op til seks markører i en enkelt vævssektion inden for 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus milt og HLF16 mus tumor væv23 blev fremstillet fra vores laboratorium. Human tonsil væv blev købt fra en kommerciel leverandør. Nærmere oplysninger findes i materialetabellen.
1. Indlejring af væv
- Integrer frisk væv i OCT (optimal skæretemperatur) opløsning og snap fryse ved hjælp af enten tøris eller flydende nitrogen.
- Opbevar væv ved -80 °C.
2. Kryosektion
- Skær 8 μm sektioner i en kryoat med temperaturer indstillet til -25 °C.
BEMÆRK: Den foretrukne sektionstykkelse kan justeres til at generere skarpere billeder. - Placer sektioner på ladede glasglas.
- Lufttørres sektionerne i 1 time ved stuetemperatur (RT), inden der i histologikvalitet fastsættes iskold acetone i 10 min.
BEMÆRK: Acetone forårsager koagulation af vandopløselige proteiner og ekstrakter lipider, men påvirker ikke kulhydrat-holdige komponenter. I modsætning hertil formalin bevarer de fleste lipider og har ringe indflydelse på kulhydrater24. Valget af fiksativ er vigtigt afhængigt af valget af markør, der detekteres. - Opbevar objektglassene ved -20 °C.
3. Udvælgelse af antistoffer og fluorophorer
BEMÆRK: Før vævsfarvning skal antistofkloner, der robust og specifikt pletter deres relevante antigener inden for sekventielle sektioner fra acetone fast væv, valideres. Nogle antistoffer kan kræve en anden fiksativ, og deres kompatibilitet med andre antistoffer i panelet skal også empires bestemmes. Målet er også at identificere fluorophores med minimal overlapning, der kan detekteres med epifluorescens filtre for DAPI, FITC, Cy3, Texas Red, og Cy5.
- Bekræft farvning ved konventionel IHC eller immunfluorescens (IF) detektion i vævssektioner med kendt udtryksmålantigen.
- Ved hjælp af de excitations- og emissionsfiltersæt, der er tilgængelige på det halvautomatiske billeddannelsessystem, og efter afprøvning af forskellige kombinationer af fluorpræjugerede primære antistoffer, skal fluorophores fremstilles, der har minimal spektral overlapning (f.eks. se tabel 1).
4. Farvning
BEMÆRK: Vævet rehydrering og dias vasker blev udført i en Coplin krukke. Blokerings- og antistofinkubationstrinnene blev udført i en befugtet glideboks.
- Lad objektglassene varme til RT i 5-10 min.
- Rehydrat i fosfatbufferet saltvand (PBS) i 5 min.
- Udfør et blokerende trin før farvning af væv med antistoffer. For musesektioner skal du bruge specialiseret blokeringsopløsning (se Materialetabel)i 10 min på RT. For humane sektioner, bruge 10% normal pooled human serum (NHS) fortyndet i PBS i 15 min på RT.
BEMÆRK: Forskellige blokeringsbuffere kan testes efter behov for at bevare sektionernes specifikke egenskaber afhængigt af de opfølgningsprocedurer, der skal anvendes. - Objektglassene vaskes i 5 minutter i PBS efter blokering.
- For multiplex farvning, forberede en cocktail af antistoffer med kompatible fluorophores på forudbestemt optimale fortyndinger.
- Tilsæt cocktail af fluorophore-konjugerede antistoffer til dias. Ved enkeltmarkørfarvning tilsættes kun det primære konjugerede antistof til slæden.
- Medtag en kontrol ubejdset dias, der gennemgår den samme farvning procedure uden tilsætning af nogen primær-konjugeret antistof.
- Inkuber objektglassene i 1 time ved RT i mørke, og derefter vaskes objektglassene 2x med PBS i 5 min. hver. Herfra kaldes det resulterende dias multiplex-farve.
- For at imødegå plet, tilføje DAPI til multiplex-farvede dias, inkubere i 7 min i mørke på RT, og vask dias 2x med PBS i 5 min hver. Må ikke imødegå sfarvede enkeltfarvede og ufarvede dias.
- Til coverslip, tilsæt en dråbe af monteringsmediet, og forsigtigt placere glasdækslet slip over vævet.
5. Forberedelse af et spektralbibliotek
-
Erhvervelse af billede
- Indstil lampens effekt til 100 %. Normalt er effekten indstillet til 10%, fordi fluorescensdetektion på FFPE væv indeholder et signalforstærkningstrin.
- Begynd med at åbne mikroskopets betjeningssoftware(se Materialetabel ).
- Vælg Rediger protokol og derefter Ny protokol.
- Angiv et "protokolnavn", og vælg Fluorescens under Billedtilstand, og angiv et "Studienavn".
- Placer enkeltfarvede objektglas på scenen, og undersøg hver markør i den tilsvarende fluorescenskanal for at sikre farvning. Vælg en region på vævet, der udtrykker det stærkeste signal til markøren.
- Juster eksponeringstiderne ved hjælp af indstillingerne Autofokus og Automatisk visning.
- Få snapshots til de enkeltbejdsede og ubejdsede dias, og gem protokollen.
BEMÆRK: Følgende trin udføres i machine learning software (se Materialetabel), ved hjælp af enkelt farvede og ufarvede dias til at kontrollere specifikke farvning samt til at bestemme antistof cross talk. - Indlæs hvert enkelt farvebejà ̧t tã¦ret diasbillede under fanen Byg biblioteker i softwaren, væeller være et enkelt farvebejà ̧t tærmen med et farves , væeller værktà ̧j . Extract Softwaren vil automatisk udtrække fluorescens signal valgt i Fluor.
- Klik på Gem i store for atgemme den udtrukne farve. Der kan oprettes en "ny gruppe", eller den udtrukne farve kan gemmes i en eksisterende gruppe.
-
Kontrol af spektralbiblioteket
- Kontroller vinduet for emissionsspektralkurve, der er placeret til højre for det udtrukne billede, for hvert filtersæt.
BEMÆRK: Det udtrukne signal er korrekt, hvis spektralkurven kun observeres i de filtersæt, hvor fluorophoren detekteres. Hvis der observeres en spektralkurve i det forkerte filtersæt, kan det betyde, at enten det primære signal, der forventes i filtersættet, ikke er stærkt nok, eller softwaren registrerer et andet signal, der er for højt, muligvis på grund af spektral overlapning. I dette tilfælde skal du først prøve at bruge værktøjet Tegn behandlingsområder til at tegne områder omkring områder, der udtrykker fluorescerende markør og autofluorescens i billedet. Dette træner softwaren til at registrere det sande signal og fjerne eventuelle forstyrrende signaler. Hvis dette ikke virker, gentages farvningsprocessen for det enkeltfarvede dias for at teste forskellige antistoftitretitre.
- Kontroller vinduet for emissionsspektralkurve, der er placeret til højre for det udtrukne billede, for hvert filtersæt.
6. Multispektral billedbehandling
BEMÆRK: Når spektralbiblioteket er oprettet og bekræftet, skal du udføre følgende trin for det multiplex-farvede dias.
-
Hele diasscanningen
- Juster fokus- og eksponeringstiderne på det multiplexfarvede dias som nævnt i punkt 5.1.
- Opret en ny opgave under Scanningsdias, og vælg den protokol, der er gemt ovenfor.
- Udfør en hel slidescanning på den multiplex-farvede slide.
- Ved hjælp af hele slide scan software, åbne hele slide scan billede. Dette billede er ikke blevet spectrally ublandet.
- Vælg interesseområder på tværs af hele slidescanningsbilledet ved hjælp af værktøjet Stempel eller INVESTERINGSAFKAST. Disse ROI'er vil blive scannet ved hjælp af de eksponeringstider, der er fastsat i 6.1.1, og som skal anvendes til spektral unmixing og analyse.
- Klik på Procesdias for at hente investeringsafkast ved 20x-forstørrelse
-
Spektral unmixing
- Når investeringsafkast er anskaffet, skal du indlæse multiplex-farvede billeder under fanen Manuel analyse under fanen Manuel analyse ved at klikke på Åbn under Fil.
- Klik på Vælg Fluoreri rullemenuen Spektral bibliotekskilde .
- Der åbnes et nyt vindue. Her skal du vælge det spektrale bibliotek eller den spektrale gruppe, der er oprettet ovenfor.
- Indlæs det ufarvede slidebillede. Klik AF på AF-blækmarkørikonet, der er placeret over det valgte spektralbibliotek, og tegn en linje eller et område på det ubejdende objektglas for at identificere autofluorescens i vævet.
- Tildel navne for hvert mærke under fanen Rediger mærker og farver. Pseudofarver kan tildeles på dette trin.
BEMÆRK: Farven på billedet Autofluorescence er som standard DarkSlateGray. Skift dette til Sort. - Klik på Forbered alle.
-
Kontrol af ublandede billeder i spektont
BEMÆRK: Når det spektrale unmixing-trin er fuldført, oprettes et sammensat billede, der består af alle farverne.- Klik på ikonet Rediger visningens øje. Her kan hver farve i "Komponentdisplayet" slås fra eller til for at se farvningen af hver enkelt markør.
- Undersøg cellernes farvning og morfologi visuelt for at sikre, at der ikke er overlapning af markør, medmindre det er biologisk relevant. En patolog kan hjælpe med at kontrollere farvning så godt.
BEMÆRK: Farvningen på det multiplekserede dias skal valideres ved at udelade en fluorophore ad gangen og gennemgå farvningsmønsteret. Desuden vil valideringen også bidrage til at identificere stærke fluorophores, der vises i tilstødende spektre på grund af antistof cross talk eller bleed-through. - Klik på knappen Vælg et komponentbillede for Patologivisninger, som simulerer billeder af brightfield for hver lysstofmarkør. Her skal du vælge en markør for at få vist et simuleret brightfield-billede.
7. Analyse af multispektrale billeder via cellesegmentering og fænotning
BEMÆRK: Når du har kontrolleret det spektert ublandede billede, kan cellesegmentering udføres ved hjælp af machine learning-softwaren, som vil give trinvise instruktioner. Vævssegmentering blev ikke udført her. Hvis panelet indeholder en eller flere vævsspecifik markør, og især hvis vævet er rodet, bør vævssegmentering udføres.
- Vælg "Cytoplasma" og "Membran" under indstillingen 'Segment'.
BEMÆRK: "Kerner" vælges som standard. - Vælg et mærke fra panelet. Konfigurer markøren til at detektere enten kerner, cytoplasma eller membran. For eksempel kan DAPI vælges til at detektere kerner og CD3 for membran.
- Klik på ellipseknappen ('...') for at vælge en indstilling under "brug dette signal til at finde". For eksempel 'kerner' for DAPI. Flere mærker fra panelet kan vælges til segmentering.
BEMÆRK: For cytoplasmatiske eller membranmarkører skal du vælge indstillingen "Brug dette signal til at hjælpe med nuklear segmentering". - Softwaren registrerer og skaber automatisk en maske hver for kernen, cytoplasma, og membran i billedet.
- Sørg for, at alle cellerne er 'maskeret' til segmentering. Hvis du vil justere, skal du skifte til patologivisningen for den specifikke markør, der er valgt i 7.3. og bruge konfigurationsindstillingerne i softwaren.
- Klik på "Segment alle" for at segmentere celler.
- Efter cellesegmentering skal du fortsætte med fænonomærkeceller. I dette trin skal du vælge de markører, der er nødvendige for fænonoduning, og manuelt markere mindst fem celler, der er farves med den valgte markør. Dette træner softwaren til derefter automatisk at registrere alle celler farves med den valgte markør i billedet.
- Der oprettes et fænotypekort. Analysér for at sikre, at cellen, der farves med mærket, er korrekt fænotype.
BEMÆRK: Cellefænotning kan være en iterativ proces. Hvis softwaren ikke er i stand til at fænoskrive cellerne korrekt, betyder det, at træningen er utilstrækkelig eller forkert. I dette tilfælde skal brugeren manuelt vælge flere celler og omskole softwaren og gentage dette trin, indtil brugeren er tilfreds med træningen. - Opret en gruppe med navnet "Andre", og medtag celler, der ikke farves for nogen af mærkerne.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt at træne softwaren til at udelukke alle de ufarvede celler fra fænomærke.
8. Eksport af billeder og analysetabeller
- Klik på knappen Eksporter for at få vist panelet Eksporter indstillinger.
- Klik på Gennemse i "Eksporter mappe" for at vælge en placering, hvor billederne skal eksporteres.
- Vælg Billedoutputformateti "Indstillinger for billedeksport".
- Vælg de billeder, der skal eksporteres, på listen "Billeder, der skal eksporteres". "Sammensat billede" er det endelige pseudofarvede ublandede billede. "Patologi Visninger" er de enkelte simulerede brightfield billeder og "Component Images (multi-image TIFF)" er en multi-image TIFF-fil af komponent data, der kan bruges af tredjeparts analyse software.
- Klik på knappen "Eksporter for alle" for at eksportere billederne.
BEMÆRK: Tabeller fra analyse kan også vælges og eksporteres på dette trin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Påvisning af enkeltfarvede markører på frosne miltsektioner
Da det halvautomatiske billedbehandlingssystem bruger et LCTF-system (liquid crystal tunable filter), der giver mulighed for en bredere vifte af bølgelængdedetektering25, og fordi der ikke blev udført signalforstærkningstrin her, optimerede vi først påvisningen af vores primære konjugerede antistoffer for hver markør på mikroskopet. Et eksempel vises i Figur 1, hvor hver enkeltfarves markør er pseudofarvet rød. De Samtidige Alexa Fluor-antistoffer, der anvendes her, er blevet valideret af virksomhederne for immunfluorescens og flowcytometri. Men, Per-CP-Cy5.5 fluorophore er kun valideret for flow cytometri. Vi var i stand til at opdage denne farve i vores enkeltfarvede dias, der understøtter egnetheden af flow cytometri validerede antistoffer til brug i multispektral billeddannelse og giver fordelen ved at bruge sådanne antistoffer til at validere observationer ved hjælp af to forskellige teknikker (dvs. flow cytometri og multispektral billeddannelse). Vi fortsatte derefter med at udføre multispektral billeddannelse på frosset væv.
Multicolor fluorescens detektion på frosne musemilmnun
For at teste multiplex farvningsmetoden og spektralbilleddannelse brugte vi musefrosset miltvæv, som har en overflod af immunceller. Figur 2 viser et spektert ublandet billede af forskellige markører i en del af den frosne musemilt. De antistoffer, kloner og koncentrationer, der anvendes til farvning, er beskrevet i tabel 2. Det optagne billede viser en del af T-cellezonen identificeret ved tilstedeværelsen af CD3, CD4 og CD8 markører, omgivet af myeloidceller, der udtrykker CD11b for det meste observeret i den marginale zone. Regioner af prolifererende celler, der udtrykker Ki67, observeres primært i spirende centre. Indstillingen "Patologivisninger" for hver markør viste sit individuelle farvningsmønster i vævet. Forskellige farvningsmønstre for CD11b, Ki67 og CD3- og CD4- og CD8-markørerne blev observeret sammen, hvilket tyder på, at multiplexfarvningsmetoden og spektralbilleddannelse bevirkede på det frosne væv.
Multi-farve fluorescens detektion på frosne menneskelige tonsil
Efter at have testet et farvningspanel, der er egnet til musevæv, vurderede vi derefter et separat panel for frosset humant tonsil væv. Figur 3 viser et spektert ublandet billede af de forskellige anvendte markører. De antistoffer, kloner og koncentrationer, der anvendes til farvning, er beskrevet i tabel 2. Det optagne billede viser et follikulært germinal center26, der udtrykker B-celler identificeret ved CD20-markøren. Prolifererende celler i follikulære germinal center blev identificeret af Ki67. Nogle af disse prolifererende celler costained med CD20 og kan centroblasts27, naive B-celler, der gennemgår aktiv somatiske hypermutation. Follikulære germinale centre var omgivet af den interfollikulære T-celle region identificeret ved udtrykket af CD3, CD4, og CD8. Igen blev der observeret forskellige farvningsmønstre her, hvilket bekræftede, at metoden virkede på et frosset væv.
Anvendelse af multispektrale fluorescensscanning på frossen musetumorvæv
Multispektral billeddannelse er et nyttigt værktøj til overvågning af immuncelleinfiltration i tumorer som prognose for immunterapier. Til dette formål satte vi os for at plette en frossen mus tumor væv prøve og opdage immuncelle infiltrerer. HLF16-cellelinjen anvendes som human papillomavirus (HPV)+ tumormodel for livmoderhalskræft hos HLA-A*0201 transgene mus28. Den transgene cellelinje blev udviklet ved at transfecting hjerte lunge fibroblaster fra HLA-A * 0201 med HPV16 E6 og E7 onkogener og H-Ras V1228. T celler og tumor associerede makrofager er de mest almindelige immun infiltrerer til stede i tumorer29. Figur 4 viser et spektert ublandet billede på en frossen HLF16 tumor sektion sammen med patologi synspunkter; de enkelte farvningsmønstre er vist i supplerende figur 1. De antistoffer, kloner og koncentrationer, der anvendes til farvning, er beskrevet i tabel 2. Det optagne billede viser regioner af tumor-infiltrerende T-celler identificeret af CD3 og CD8 markører sammen med tilstedeværelsen af andre myeloid celle slægter identificeret ved CD11b markør. Den erobrede region viser også tumor associerede makrofager (TAMs), muligvis af M2 fænotype, opdaget af CD206 markør30, som er tæt forbundet med flere prolifererende celler opdaget som Ki67+.
Machine learning software2 leveres med funktioner som vævs- og celleanalyser. Disse analyser udføres almindeligvis på FFPE væv farves med signalforstærkning. Da vores metode ikke bruger signalforstærkning, ønskede vi at teste, om softwaren kunne bruges til at analysere farvning på frosset væv. Ved hjælp af softwarens adaptive funktion var vi i stand til at segmentere celler baseret på en atom- og membranmarkør og fænotypeceller baseret på de markører, der anvendes til farvning. Figur 5 viser cellesegmenterings- og fænotypekort og antallet af farvede celler for hver markør, der analyseres af softwaren, hvilket viser, at softwaren kan bruges til kvantificering af multispektralfarvning på frosset væv.
Figur 1: Detektering af primære konjugerede antistoffer ved hjælp af et flydende krystalfilter, der ikke kan stemme filter. Primære konjugerede antistoffer mod de angivne markører blev plettet på en frossen musemilt og detekteret ved hjælp af Vectra 3.0 multispektralbilledsystemet under 20x mål. CD3 på Alexa Fluor 488, CD8 på Alexa Fluor 594, CD11b på Per-CP Cy5.5, CD206 på Alexa Fluor 647 og Ki67 på Alexa Fluor 555 blev brugt. Hver markør er pseudofarvet rød. Der blev ikke brugt nogen modplet på disse objektglas. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Multispektral billeddannelse på en frossen musemilt. (A) Hele diasscanning af multiplexed farvede dias taget under 4x mål. Et 2 x 2 stempel på tværs af forskellige områder af vævet blev valgt til multispektral billeddannelse. Skalabar = 100 μm. (B) Sammensat billede taget under en 20x mål efter spektral unmixing. De pseudofarvede markører er angivet, og der vises et forstørret billede i den røde boks ved siden af billedet. Skalabjælke = 20 μm. (C) Patologivisninger for hver enkelt markør. Der vises et forstørret billede for hvert mærke i den røde boks ved siden af billedet. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Multispektral billeddannelse på en frossen menneskelig tonsil. (A) Hele diasscanning af multiplexed farvede dias taget under en 4x mål. Et 1 x 1 stempel (669 μm x 500 μm) på tværs af forskellige områder af vævet blev valgt til multispektral billeddannelse. Skalabar = 100 μm. (B) Sammensat billede efter spektral unmixing taget under en 20x mål. De pseudofarvede markører er angivet, og der vises et forstørret billede i den røde boks ved siden af billedet. Skalabjælke = 20 μm. (C) Patologivisninger for hver enkelt markør. Der vises et forstørret billede for hvert mærke i den røde boks ved siden af billedet. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Multispektral billeddannelse på en frossen musesvulst. Multispektral billeddannelse blev udført på en 1 x 1 region af en frossen mus HLF16 tumor taget under en 20x mål. Det sammensatte billede (ovenfor). De pseudofarvede markører er angivet, og patologivisningerne (nedenfor) for hver enkelt markør afbildes. Et forstørret billede for hvert mærke i den røde boks vises ved siden af det oprindelige billede. Skalabar = 20 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Analyse af en frossen musetumorsektion. (A) Cellesegmenteringskort. Adaptiv cellesegmentering ved hjælp af inForm blev udført. Softwaren blev uddannet til at identificere kerner (grøn) og membran (rød). (B) Fænotype kort for hver farvet markør. Softwaren blev uddannet til at identificere fænotyper baseret på farvning. Farvet prik repræsenterer den angivne markør. "Andet" (sort) henviser til celler, der ikke blev farves for den angivne markør. (C) Søjleplot (gennemsnit ± STDAFV), der viser antallet af farvede celler for hver markør i to multispektrale billeder. Tallet angiver celler fænotypeer i hvert billede, men angiver ikke, om mærkerne er udtrykt i coudtrykt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fluorophore | Excitation maksimum (nm) | Emissionsmaksimum (nm) | Forventet registrering i filtersæt (navn) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | FITC (FITC) |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 og Texas Rød |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Texas Rød |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Rød og Cy5 |
| DAPI (DAPI) | 350 | 470 | DAPI (DAPI) |
| PerCP-Cy 5,5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Rød og Cy5 |
Tabel 1: Liste over fluorophorer med deres maksimale excitations- og emissionsbølgelængder og forventet detektion i passende filtersæt.
| Frossen mus milt | |||
| Antistof/farvestof | Klon | Koncentration (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mus CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5,5 rotte Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (B56) | 10 | |
| DAPI (DAPI) | 0.1 | ||
| Frosne mus tumor | |||
| Antistof/farvestof | Klon | Koncentration (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mus CD206 (MMR) | C068C2 (C068C2) | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Rotte Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (B56) | 0.25 | |
| DAPI (DAPI) | 0.1 | ||
| Frosne menneskelige tonsiller | |||
| Antistof/farvestof | Klon | Koncentration (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-menneskelige CD3 | UCHT1 (UCHT1) | 10 | |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 anti-menneskelige CD8a | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | L26 (L26) | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (B56) | 1 | |
| DAPI (DAPI) | 0.1 | ||
Tabel 2: Liste over anvendte antistoffer, kloner og koncentrationer.
Supplerende figur 1: Individuelle farvningsmønstre for den frosne HLF16 tumor efter spektral unmixing. Scale bar = 20 μm Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frosset væv er i vid udstrækning blevet anvendt til mIF-billeddannelse til traditionelt at detektere tre til fire markører31 på et væv ved hjælp af den direkte og indirekte metode32. I den direkte metode konjugeres antistoffer til fluorescerende farvestoffer eller kvanteprikker33 for at mærke vævet, mens der i den indirekte metode anvendes et ukonjugeret primært antistof til at mærke vævet efterfulgt af et fluorophore-konjugeret sekundært antistof, der specifikt genkender det primære antistof. Nogle af de seneste samtidige multiplex farvning tilgange drøftet tidligere kan også bruges til at plette frosne væv og opdage mere end fire markører. Men omkostningerne til reagenserne og den tid, det tager at holde farvning, bliver intensive afhængigt af antallet af markører, der opdages. En anden multiplex teknik til frosne væv er multi-epitop-ligand-kartografi (MELC)34. Teknikken indebærer farvning prøven med fluorophore-konjugerede antistoffer, billeddannelse, og fotoblegning af fluorophore. En væsentlig advarsel af denne teknik er, at kun ét felt eller region af vævet kan multiplexeret. For at multiplex andre felter eller regioner teknikken skal udføres manuelt, hvilket er tidskrævende, eller kræver automatisering, hvilket er dyrt. En gruppe35 var i stand til at opdage seks farver på frosne væv ved hjælp af en kombination af direkte, indirekte og TSA farvning. Men vævfarvning tog 2 dage. Til sammenligning bruger vores metode en samtidig multiplex farvningsmetode, der involverer anvendelse af en cocktail af fem direkte konjugerede antistoffer plus DAPI til at plette frosset væv inden for 90 min. Endvidere, ved hjælp af en semiautomatiseret multispektral fluorescens imaging system, vi var i stand til spektrally adskille og opdage seks markører i frosne milt, tonsil, og tumor væv ved hjælp af denne forenklede multiplex farvning teknik. Den Cy3, Texas Red, og Cy5 filtersæt til rådighed på mikroskopet giver mulighed for at opdage yderligere fluorophores, og dermed potentielt øge antallet af markører, der kan påvises samtidigt i frosne væv.
Multiplex farvning ved hjælp af TSA tilgang på FFPE væv kræver en antigen hentning trin efterfulgt af sekventiel mærkning, vask, og stripning trin. Udførelsen af proceduren varierer fra 1-2 dage afhængigt af inkubationstiden for antistofferne6. For nylig, ved hjælp af en mikrofluidisk vævsprocessor, en fire-plex farvning ved hjælp af TSA tilgang blev udført på FFPE væv under 90 min. Andre multiplex teknikker til FFPE væv kan udføres under 4-5 h ved hjælp af en automatiseret plet. De passende antigenudtagningstrin skal dog optimeres for at sikre epitoptilgængelighed for antistofferne36, hvilket igen afhænger af en omhyggelig overvejelse af antistofklonerne samt rækkefølgen af markører, der detekteres. F.eks. kan nogle antistofkloner af CD3 ikke anvendes, da der efterfølgende ikke påvises cd4- og CD8-antistoffer37. Tilsvarende er der variation i antigendetektion blandt de tilgængelige antistofkloner17,18. Derfor kræver multiplex farvning af FFPE-væv optimering af antistofkloner, deres koncentrationer og den rækkefølge, hvori de farves, hvilket alt sammen er tidskrævende. I modsætning hertil giver manglen på omfattende vævsbehandling af frosset væv mulighed for brug af forskellige antistofkloner med høj specificitet. Desuden kan antistofkloner til frosne væv også anvendes i flowcytometri og ELISA, hvilket muliggør samtidig validering på tværs af forskellige analyser. Vævsarkitektur er også et problem i frosset væv38. Den multiplex farvning vist her på frosne væv er betydeligt hurtigere end TSA tilgang. Fluorophore-kombinationerne kræver et omhyggeligt udvalg af markører for at sikre, at antistoffer ikke hæmmer hinanden sterically, især når forskellige antigener udtrykt på samme cellested detekteres. Vi valgte markører, der pletter forskellige celler på fluorophores, der er spektrally separate, hvilket muliggør bedre detektion. Antistofkoncentrationerne kræver også optimering, men fordi farvningsprotokollen er hurtig, er den samlede tid, det tager for optimering, ikke tidskrævende. En advarsel til vores metode kan være den manglende evne til at opdage lave udtrykke markører i væv. Nogle af de multiplex farvning tilgange på FFPE væv indebærer et signal forstærkning trin, der er nyttigt at opdage lav udtrykke markører. Brugen af sekundære og tertiære antistoffer kan dog anvendes til at øge signalet. I sådanne tilfælde bør krydsreaktivitet mod antistoffer i panelet undgås for at forhindre forkert fortolkning af resultaterne.
Ud over musemilt og humane tonsil væv, som er rige på immunceller, har vi brugt tumorvæv som et eksempel for den foreslåede multispektrale fluorescens scanning af frosne væv. Multispektraderende fluorescens billeddannelse i tumorer har givet værdifulde oplysninger, såsom at karakterisere tumor mikromiljø (TME)39, forudsige succes adoptivT celleoverførsler i maligne melanom40,og karakterisere proteiner i tumor signal transduktionsveje41. Ved hjælp af markører specifikke for immunceller almindeligt forekommende i tumorer, Vi var i stand til at opdage infiltrerende CD8 T-celler og TAMs i HLF16 tumorvæv, der anvendes i denne undersøgelse. Vi brugte maskinen læring software til at kunne segmentere og fænotype celler. Multiplex farvning for FFPE væv anvender et signal forstærkning trin til at forbedre signal-støj (SNR) forhold, der hjælper billedbehandling og kvantificering42,43. Machine learning-softwaren er blevet brugt til analyser af FFPE-væv, der er plettet med signalforstærkning2. Den metode, der er til stede her, bruger ikke signalforstærkning, men vi var i stand til at segmentere og fænotypeceller ved hjælp af softwaren. Til yderligere analyse (f.eks. samekspression og rumlige relationer) og nøjagtig fortolkning af kvantificeringen kræver softwaretræningen validering ved hjælp af et træningssæt, et testsæt og valideringssæt. I en iterativ proces bruges et sæt billeder (dvs. træningssættet) til at træne maskinindlæringssoftwaren til at identificere fænotyperne, indtil modellens forudsigelser for et separat sæt billeder (dvs. testsættet) er korrekte. Når træningen er fuldført, analyseres et endeligt tilsidesat parti billeder (dvs. valideringssættet) for at se, om der har været overmontering.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den metode, der præsenteres her, er en hurtig måde at udføre multispektral fluorescensscanning ved hjælp af frosset væv. Metoden er nyttig til at detektere markører, som enten antistoffer ikke er tilgængelige for, eller som ikke kan påvises i FFPE-væv. I forbindelse med machine learning software, den tid, det tager at udføre kvantitative analyser kan i væsentlig grad lette hurtige prækliniske og kliniske diagnoser og kan anvendes inden for høj opløsning rumlige transkriptorer, der udnytter frosne væv44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Imaging og analyse vejledning blev leveret af Research Resources Center - Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etableret med støtte fra kontoret for vicekansler for forskning. Arbejdet blev støttet af NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, af NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og med støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core på Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
References
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
- Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
- Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
- Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
- Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
- Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
- Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
- Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
- Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
- Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
- Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
- Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
- van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
- Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
- Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
- Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
- Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
- Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
- Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
- Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).
