Summary
凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。
Abstract
ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織上のマルチスペクトル蛍光イメージングは、抗原共発現およびマーカーの空間分布に関する情報を提供できる単一の組織サンプル内の複数のマーカーの検出を可能にする。しかしながら、ホルマリン固定組織に対する適切な抗体の欠如は、検出できるマーカーの性質を制限する可能性がある。また、染色方法は時間がかかります。ここでは、凍結組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行う迅速な方法について説明する。この方法には、使用されるフルオロフォアの組み合わせ、マウスおよびヒト凍結組織の染色に関する詳細なステップ、およびスキャン、取得、および分析手順が含まれる。染色解析には、市販の半自動マルチスペクトル蛍光イメージングシステムが使用されている。この方法を通じて、1つの凍結組織セクションで最大6つの異なるマーカーが染色され、検出された。機械学習解析ソフトウェアは、定量分析に使用できる表現型細胞を使用できます。ここで説明する凍結組織の方法は、FFPE組織では検出できないマーカーや、FFPE組織に対して抗体が利用できないマーカーの検出に有用である。
Introduction
顕微鏡イメージング技術の最近の進歩は、生物学的プロセスおよび疾患状態に関する我々の知識と理解を大幅に向上させました。染色原性免疫組織化学(IHC)を介した組織中のタンパク質のインサイチュ検出は、病理において日常的に行われている。しかし、発泡IHC染色を用いた複数のマーカーの検出は、1つ以上の新しい方法で多重免疫蛍光(mIF)染色法を用い、複数の生物学的マーカーが単一の組織サンプル上に標識され、開発されている。複数の生体マーカーの検出は、組織アーキテクチャ、細胞の空間分布、および抗原共発現に関する情報がすべて単一の組織試料2に捕捉されるため有用である。マルチスペクトル蛍光イメージング技術を用いることが、複数の生物学的マーカーの検出を可能にしました。この技術では、個々の蛍光色素の蛍光スペクトルを個別の蛍光スペクトルに特異的な光学を用いて、分離したり「混合しない」と、スペクトルクロストーク3を一切起らなく複数のマーカーを検出することを可能にする。マルチスペクトル蛍光イメージングは、細胞生物学、前臨床薬の開発、臨床病理学、および腫瘍免疫プロファイリング44、5、65,6において重要なアプローチになりつつある。重要なことに、免疫細胞(具体的にはCD8 T細胞)の容量分布は、既存の腫瘍7を有する患者の予後因子として機能し得る。
多重蛍光染色に対する様々なアプローチが開発されており、同時または順次に行うことができます。同時染色法では、すべての抗体をカクテルとして一回のステップで添加し、組織にラベルを付けます。UltraPlex技術は、ハプテン共役一次抗体のカクテルに続いて、フルオロフォア共役抗ハプテン二次抗体のカクテルを使用します。InSituPlex技術8は、組織に同時に付加されるユニークなDNA共役一次抗体のカクテルを使用し、その後に増幅ステップを行い、最後に一次抗体上の各固有DNA配列を補完するフルオロフォア共役プローブを用いる。これらの技術は、4つのマーカーに加えて、核染色のための4',6-diamino-2-フェニリンドール(DAPI)を検出することを可能にする。同時多重染色のための他の2つのアプローチは、二次イオン質量分析9に基づいています。Hyperion Imaging システムは、イメージング質量サイトメトリー10を使用して、最大 37 個のマーカーを検出します。この技術は、組織を染色するために金属共役抗体のカクテルを使用し、組織の特定の領域はレーザーによってアブレートされ、金属イオンが検出される質量サイトメーターに移されます。もう一つの同様の技術は、多重化イオンビームイメージング技術11を使用するIONPathです。この技術は、金属共役抗体をアブラクトするためにレーザーの代わりに、変性質量分析計装置と酸素イオン源を使用します。これらすべての同時多重染色法により、複数のマーカーの検出が可能になりますが、DNA、ハプテン、または金属を抗体に結合するためのコスト、アブレーションによる組織の喪失、および混合解除のための広範な画像処理を過小評価することはできません。さらに、キットおよび染色の議定書はFFPEティッシュのために現在だけ利用でき、カスタムパネルを開発することは付加的な時間および支出を伴う。
シーケンシャル多重染色法には、対照的に、抗体を用いた組織を1つのマーカーに標識し、除去して抗体を除去し、続いてこのプロセスの逐次反復を行い、複数のマーカー12を標識する。このチラミド信号増幅(TSA)は、最も頻繁に使用される逐次多重化法である。他の2つの多重化技術は、同時染色法と逐次染色法の組み合わせを使用します。CODEXプラットフォーム13は、インデックス化された重合ステップを使用して最終的にフルオロフォアで標識されるユニークなDNAオリゴヌクレオチド配列に結合した抗体のカクテルを採用し、その後、最大50個のマーカーを検出するプロセスを繰り返します。MultiOmyx多重染色アプローチ14は、3〜4個のフルオロフォア共役抗体のカクテルで染色し、イメージング、蛍光ホルを焼入れ、このサイクルを繰り返して単一のセクションで最大60個のマーカーを検出する反復である。同時多重染色法と同様に、広範囲のマーカーを検出できる一方で、染色、画像取得、処理、および分析に関わる時間は広範囲に及ぶ。ストリッピング/クエンチングステップは、組織サンプルの加熱および/または漂白を伴い、加熱または漂白時に組織の完全性を維持するFFPE組織に対してシーケンシャルな多重染色アプローチが一般的に行われます。
ホルマリン固定およびそれに続くパラフィン埋め込みは臨床現場で容易に行われ、組織ブロックは保存しやすく、複数の多重染色プロトコルが利用可能である。しかしながら、FFPE組織の処理、埋め込み、および脱パラフィン化、ならびに抗原検索15は、抗体がエピトープに良好にアクセスできるプロセスに、時間がかかる。さらに、FFPE組織に関与する処理は、自己蛍光16およびマスク標的エピトープに寄与し、FFPE組織17、18、1918,19における抗原を検出するために利用可能な抗体クローンのばら17つきおよび欠如をもたらす。例としては、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIアレル20である。対照的に、組織のスナップ凍結は、固定前または後に広範な処理ステップを伴わない、抗原検索21、22の必要性を回避し、22より広い範囲の標的を検出するのに有益である。したがって、マルチスペクトル蛍光イメージングに凍結組織を用い、前臨床および臨床研究の標的を検出する価値がある。
FFPE組織を用いた上述の制限を踏まえると、冷凍組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行うことができるかどうか尋ねた。この問題に対処するため、複数の抗原を検出するフルオロフォア共役抗体のパネルを用いて同時多重染色法を試験し、半自動マルチスペクトルイメージングシステムを用いて染色を解析した。90分以内に1つの組織セクションで最大6つのマーカーを同時に染色することができました。
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Protocol
マウス脾臓およびHLF16マウス腫瘍組織23は、当研究室から得られた。ヒト扁桃組織は、市販業者から購入した。詳細については、資料一覧を参照してください。
1. 組織埋め込み
- 新しい組織をOCT(最適な切断温度)溶液に埋め込み、ドライアイスまたは液体窒素を使用して凍結します。
- 組織を-80°Cで保存する。
2. クライオセクション
- クライオスタットで8μmのセクションをカットし、温度を-25 °Cに設定します。
注:推奨断面の厚さは、より鮮明な画像を生成するように調整することができます。 - 帯電ガラススライドにセクションを配置します。
- 10分間、占星術グレードの氷冷アセトンを固定する前に、室温(RT)で1時間の部分を空気乾燥させます。
注:アセトンは水溶性タンパク質の凝固を引き起こし、脂質を抽出しますが、炭水化物含有成分には影響しません。対照的に、ホルマリンはほとんどの脂質を保存し、炭水化物24にほとんど影響を与えない。固定性の選択は、検出されるマーカーの選択に応じて重要です。 - スライドは-20°Cで保管してください。
3. 抗体および蛍光体の選択
注:組織染色の前に、アセトン固定組織からのシーケンシャル切片内で目的の抗原を強固かつ特異的に染色する抗体クローンを検証する必要があります。一部の抗体は、異なる固定性を必要とし、パネル内の他の抗体との相溶性も経験的に決定する必要があります。目標はまた、DAPI、FITC、Cy3、テキサスレッド、およびCy5の蛍光フィルターで検出できる最小限の重複を有する蛍光性を同定することです。
- 既知の発現標的抗原を有する組織切片における従来のIHCまたは免疫蛍光(IF)検出による染色を確認する。
- 半自動画像化システムで利用可能な励起および発光フィルタセットを用いて、フルオロフォア共役一次抗体の様々な組み合わせをテストした後、最小限のスペクトルオーバーラップを有するフルオロフォアを調製する(例えば、表1参照)。
4. 染色
注:組織の水分補給およびスライドのすきは、コプリン瓶で行った。ブロッキングおよび抗体インキュベーションステップを加湿スライドボックスで行った。
- スライドを 5 ~ 10 分間 RT に暖かくします。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5分間水分補給を行った。
- 抗体で組織を染色する前にブロッキングステップを行います。マウスセクションでは、RTで10分間、特殊なブロッキングソリューション(「材料表」を参照)を使用します。ヒト切片の場合、RTで15分間PBSで希釈した正常なプールされたヒト血清(NHS)を10%使用してください。
注:使用する後続手順に応じてセクションの特定のプロパティを保持するために、必要に応じてさまざまなブロッキング バッファをテストできます。 - ブロック後にPBSで5分間スライドを洗います。
- 多重染色の場合は、所定の最適な希釈液で相性の高いフルオロフォアを有する抗体のカクテルを調製してください。
- スライドにフルオロフォア共役抗体のカクテルを加えます。シングルマーカー染色の場合は、一次結合抗体のみをスライドに追加します。
- 一次結合抗体を添加することなく同じ染色手順を経る対照未染色スライドを含む。
- 暗闇の中でRTでスライドを1時間インキュベートし、スライド2倍をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。ここから、得られたスライドはマルチプレックス染色と呼ばれる。
- 対抗するには、DAPIをマルチプレックス染色スライドに加え、RTで暗闇の中で7分間インキュベートし、スライド2xをPBSでそれぞれ5分間洗浄します。単染色および未染色スライドに対抗しないでください。
- カバースリップするには、取り付け媒体の一滴を加え、ガラスカバースリップを組織の上にそっと置きます。
5. スペクトルライブラリの準備
-
画像取得
- ランプの電源を100%に設定します。FFPE組織の蛍光検出にはシグナル増幅ステップが含まれるため、通常電力は10%に設定される。
- 顕微鏡の操作ソフトウェアを開くことから始めます(材料表を参照)。
- [プロトコルの編集] を選択し、[新しいプロトコル] をクリックします。
- 「プロトコル名」を入力し、イメージングモードで蛍光を選択し、「研究名」を入力します。
- 単染色スライドをステージ上に置き、対応する蛍光チャネルの各マーカーを調べて染色を確実にします。マーカーの最も強い信号を表現する組織上の領域を選択します。
- [自動焦点]オプションと[自動公開]オプションを使用して、露出時間を調整します。
- 単染色および未染色スライドのスナップショットを取得し、プロトコルを保存します。
注:以下の手順は、機械学習ソフトウェア(材料表を参照)で、単一の染色スライドと未染色スライドを使用して特定の染色を検証し、抗体クロストークを決定します。 - ソフトウェアの [ライブラリの作成]タブで、1 つのスライド イメージを読み込み、適切な Fluor を選択して 、[抽出] をクリックします。ソフトウェアは自動的に蛍光で選ばれた蛍光シグナルを抽出します。
- 抽出した色を保存するには、[保存 ]をクリックします。「新しいグループ」を作成するか、抽出した色を既存のグループに保存できます。
-
スペクトルライブラリの検証
- 抽出した画像の右側にある、各フィルタセットの発光スペクトルカーブウィンドウを確認します。
注:蛍光色素が検出されたフィルターセット内でのみスペクトル曲線が観測された場合、抽出された信号は正しい。スペクトル曲線が間違ったフィルタセットで観測された場合、フィルタセットで想定される1次信号が十分に強くないか、スペクトルの重なりが原因でソフトウェアが高すぎる別の信号を検出している可能性があります。この場合は、まず描画処理領域ツールを使用して、画像内の蛍光マーカーと自己蛍光を表現する領域の周りに領域を描画してみてください。これは、真の信号を検出し、任意の干渉信号を削除するソフトウェアを訓練します。これがうまくいかない場合は、単染色スライドの染色プロセスを繰り返して、異なる抗体滴定をテストします。
- 抽出した画像の右側にある、各フィルタセットの発光スペクトルカーブウィンドウを確認します。
6. マルチスペクトルイメージング
注:スペクトルライブラリを作成して検証したら、マルチプレックス染色スライドに対して次の手順を実行します。
-
スライド全体のスキャン
- セクション 5.1 で説明されているように、マルチプレックス染色スライドのフォーカスと露出時間を調整します。
- [スキャン スライド] で新しいタスクを作成し、上記で保存したプロトコルを選択します。
- マルチプレックススライドでスライド全体のスキャンを実行します。
- スライド スキャン ソフトウェア全体を使用して、スライド スキャン イメージ全体を開きます。この画像はスペクトル的に混合されていません。
- スタンプまたは ROI ツールを使用して、スライド スキャン イメージ全体で対象地域(ROI)を選択します。これらのROIは、6.1.1で設定された露光時間を使用してスキャンされ、スペクトルの非混合および分析に使用されます。
- [スライドの処理]をクリックして、20倍の倍率でROIsを取得します。
-
スペクトルアンミックス
- ROI を取得したら、機械学習ソフトウェアの [手動分析] タブで、[ファイル] の下の [開く] をクリックして、マルチプレックス染色された画像を読み込みます。
- [スペクトル ライブラリ ソース] ドロップダウン メニューで、[蛍光素の選択] をクリックします。
- 新しいウィンドウが開きます。ここで、上記で作成したスペクトルライブラリまたはグループを選択します。
- 未染色のスライド イメージを読み込みます。選択したスペクトルライブラリの上にあるAFインクマーカーアイコンをクリックし、未染色スライド上に線または領域を描いて、組織の自己蛍光を識別します。
- [マーカーと色の編集] タブで、各マーカーの名前を割り当てます。この手順では、擬似色を割り当てることができます。
注:自己蛍光画像の色は、デフォルトで DarkSlateGray になります。これを [黒] に変更します。 - [すべて準備]をクリックします。
-
スペクトルの非混合画像の検証
注:スペクトルのアンミックス手順が完了すると、すべての色からなる合成画像が作成されます。- [ビューの編集]アイコンをクリックします。ここでは、「コンポーネント表示」の各色をオフまたはオンにして、個々のマーカーの染色を確認することができます。
- 細胞の染色と形態を視覚的に調べて、生物学的に関連しない限り、マーカーの重複がないことを確認します。病理学者は、染色の検証にも役立ちます。
注:多重化されたスライドの染色は、一度に1つのフルオロフォアを取り出し、染色パターンを見直すことによって検証されるべきである。さらに、この検証は、抗体クロストークやブリードスルーにより隣接スペクトルに現れる強い蛍光体を同定するのにも役立ちます。 - 各蛍光マーカーの明視野画像をシミュレートする「病理学ビュー」の場合は、「コンポーネントイメージを選択」ボタンをクリックします。ここでは、シミュレートされた明視野画像を表示するマーカーを選択します。
7. 細胞のセグメンテーションとフェノタイピングによるマルチスペクトル画像の解析
注:スペクトル的に混合されていない画像を検証した後、機械学習ソフトウェアを使用して細胞のセグメンテーションを行い、ステップバイステップの指示を提供します。ここでは組織の分節は行われなかった。パネルが1つ以上の組織特異的マーカーを含み、特に組織が乱雑な場合は、組織のセグメンテーションを行う必要があります。
- [セグメント] オプションの下にある [細胞質] と [膜] を選択します。
注 :既定では、"Nuclei"が選択されています。 - パネルからマーカーを選択します。核、細胞質、または膜のいずれかを検出するようにマーカーを構成します。例えば、膜の核およびCD3を検出するためにDAPIを選択することができる。
- 省略記号ボタン ('...') をクリックして、 "このシグナルを使用して" を検索する ] の下のオプションを選択します。たとえば、DAPI の '核' です。パネルから複数のマーカーをセグメンテーション用に選択できます。
注:細胞質マーカーまたは膜マーカーの場合は、「この信号を使用して核セグメンテーションを支援する」オプションを選択します。 - ソフトウェアは自動的に検出し、画像内の核、細胞質、および膜のマスクを作成します。
- セグメンテーションのためにすべてのセルが「マスク」されていることを確認します。調整するには、7.3で選択した特定のマーカーの「病理ビュー」に切り替えます。をクリックし、ソフトウェアの設定オプションを使用します。
- [すべてセグメント ]をクリックしてセルをセグメント化します。
- 細胞のセグメンテーションの後、細胞のフェノタイピングを進めます。このステップでは、フェノタイピングに必要なマーカーを選択し、選択したマーカーで明るく染色されたセルを少なくとも 5 つ選択します。これにより、ソフトウェアが自動的に画像内の選択したマーカーで染色されたすべてのセルを検出するようにトレーニングされます。
- 表現型マップが作成されます。解析して、マーカーで染色されたセルが正しくフェノタイプされていることを確認します。
注:細胞のフェノタイピングは反復プロセスになり得る。ソフトウェアが細胞を正しく表現できない場合は、トレーニングが不十分または間違っていることを意味します。この場合、ユーザーは手動でセルを選択し、ソフトウェアを再トレーニングし、ユーザーがトレーニングに満足するまでこの手順を繰り返す必要があります。 - "その他" という名前のグループを作成し、どのマーカーにも染色されないセルを含めます。
注:このステップは、ソフトウェアをトレーニングして、染色されていない細胞をすべて、フェノタイピングから除外するために重要です。
8. 画像と分析テーブルのエクスポート
- [エクスポート]ボタンをクリックして、[エクスポート設定]パネルを表示します。
- [エクスポート ディレクトリ] で[参照]をクリックして、イメージをエクスポートする場所を選択します。
- [イメージのエクスポート オプション] で、[イメージ出力形式] を選択します。
- [エクスポートするイメージ] の一覧で、エクスポートするイメージを選択します。「合成画像」は、最終的な擬似色の未混合画像です。「病理ビュー」は、個々のシミュレートされた明視野画像であり、「コンポーネント画像(マルチ画像TIFF)」は、サードパーティの分析ソフトウェアで使用できるコンポーネントデータのマルチ画像TIFFファイルです。
- [すべてエクスポート] ボタンをクリックして、イメージをエクスポートします。
注:このステップで、分析のテーブルを選択してエクスポートすることもできます。
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Representative Results
凍結した脾臓セクション上の単染色マーカーの検出
半自動撮像システムは、より広い範囲の波長検出25を可能にする液晶調整フィルター(LCTF)システムを使用し、ここで信号増幅ステップが行われなかったため、まず顕微鏡上の各マーカーに対して一次共役抗体の検出を最適化しました。図1に示す例を示し、各単色マーカーは疑似色の赤です。ここで使用されるAlexa Fluorコンジュゲート抗体は、免疫蛍光およびフローサイトメトリーについて企業によって検証されています。しかし、Per-CP-Cy5.5フルオロフォアはフローサイトメトリーに対してのみ検証されます。この色を単染色スライドで検出し、マルチスペクトルイメージングで使用するためのフローサイトメトリー検証抗体の適合性をサポートし、そのような抗体を使用して2つの異なる技術(すなわちフローサイトメトリーとマルチスペクトルイメージング)を使用して観察を検証する利点を提供することができました。その後、凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行いました。
凍結マウス脾臓における多色蛍光検出
多重染色法とスペクトルイメージングをテストするために、免疫細胞が豊富なマウス凍結脾臓組織を用いた。図2は、凍結マウス脾臓の断面における異なるマーカーのスペクトル的に混合されていない画像を示す。染色に用いる抗体、クローン、および濃度は表2に記載されている。撮影した画像は、CD3、CD4、およびCD8マーカーの存在によって同定されたT細胞ゾーンの一部を示し、ほとんどが限界ゾーンで観察されたCD11bを発現する骨髄細胞に囲まれている。Ki67を発現する増殖細胞の領域は、主に胚中心で観察される。各マーカーの「病理ビュー」オプションは、組織内の個々の染色パターンを示した。CD11b、Ki67およびCD3、CD4およびCD8マーカーの明確な染色パターンが一緒に観察され、多重染色法およびスペクトルイメージングが凍結組織に働いていたことが示唆された。
凍結したヒト扁桃の多色蛍光検出
マウス組織に適した染色パネルを試験した後、次に凍結したヒト扁桃組織用の別のパネルを評価した。図3は、使用される異なるマーカーのスペクトル的に混合されていない画像を示す。染色に用いる抗体、クローン、および濃度は表2に記載されている。撮影した画像は、CD20マーカーにより同定されたB細胞を発現する濾胞発性中心26を示す。濾胞性胚中心における増殖細胞をKi67によって同定した。これらの増殖細胞の一部はCD20とコスタイン化し、心芽細胞27であり得るが、活性体細胞ハイパー突然変異を受けるナイーブB細胞である。濾胞性胚中心は、CD3、CD4、およびCD8の発現によって同定された濾胞性T細胞領域で囲まれていた。ここでも、明確な染色パターンが観察され、方法論が凍結組織に働いていたことを確認した。
凍結マウス腫瘍組織におけるマルチスペクトル蛍光イメージングの応用
マルチスペクトルイメージングは、免疫療法の予後として腫瘍の免疫細胞浸潤をモニタリングするのに有用なツールです。この最後に、我々は、凍結マウス腫瘍組織試料を染色し、免疫細胞浸潤を検出することに着手した。HLF16細胞株は、HLA-A*0201トランスジェニックマウス28における子宮頸癌のヒトパピローマウイルス(HPV)+腫瘍モデルとして使用される。+トランスジェニック細胞株は、HLA-A*0201からHPV16 E6およびE7オンコジーンおよびH-Ras V1228との心臓肺線維芽細胞をトランスフェクトすることによって開発された。T細胞および腫瘍関連マクロファージは、腫瘍29に存在する最も一般的な免疫浸潤物である。図4は、凍結したHLF16腫瘍セクション上のスペクトル的に混合されていない画像を病理図と共に示している。個々の染色パターンを補助図1に示します。染色に用いる抗体、クローン、および濃度は表2に記載されている。撮影した画像は、CD3およびCD8マーカーによって同定された腫瘍浸潤T細胞の領域と、CD11bマーカーによって同定された他の骨髄細胞系統の存在を示す。また、捕捉された領域は、腫瘍関連マクロファージ(TAM)を示し、おそらくM2表現型の、CD206マーカー30によって検出され、これはKi67+として検出されたいくつかの増殖細胞に+密接に関連している。
機械学習ソフトウェア2には、組織および細胞分析などの機能が付属しています。これらの分析は、シグナル増幅で染色されたFFPE組織に対して一般的に行われます。我々の方法論は信号増幅を使用しないので、凍結組織の染色を分析するためにソフトウェアを使用できるかどうかをテストしたいと考えました。ソフトウェアの適応機能を用いて、核および膜マーカーに基づいて細胞をセグメント化し、染色に使用するマーカーに基づいて細胞を表現することができました。図5は、細胞のセグメンテーションおよび表現型マップと、ソフトウェアによって分析された各マーカーの染色細胞数を示し、凍結組織上のマルチスペクトル染色の定量にソフトウェアを使用できることを示す。
図1:液晶調整可能なフィルター顕微鏡を用いた一次共役抗体の検出示されたマーカーに対する一次共役抗体は、凍結マウス脾臓上で染色され、20x目標の下でVectra 3.0マルチスペクトルイメージングシステムを使用して検出された。アレクサフルーオール488のCD3、アレクサフルーオール594のCD8、PER-CP Cy5.5のCD11b、アレクサフルーオール647のCD206、アレクサフルーター5555のKi67が使用されました。各マーカーは擬似色の赤です。これらのスライドではカウンターステインは使用されなかった。スケールバー= 20 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:凍結マウス脾臓上のマルチスペクトルイメージング。(A) 4倍の目的で撮影された多重化された染色されたスライドの全体のスライドスキャン。組織の異なる領域にわたる2 x 2スタンプを、マルチスペクトルイメージング用に選択した。スケールバー= 100 μm(B)スペクトルの非混合後に20倍の目的で撮影された合成画像。擬似色のマーカーが示され、赤いボックス内の拡大画像が画像の横に表示されます。スケールバー= 20 μm(C) 個々のマーカーごとの病理図。赤いボックス内の各マーカーの拡大画像が、画像の横に表示されます。スケールバー= 20 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:凍結したヒト扁桃腺上のマルチスペクトルイメージング。(A)4倍の目的で撮影された多重化された染色されたスライドの全体のスライドスキャン。組織の異なる領域にわたる1 x 1スタンプ(669 μm x 500 μm)が、マルチスペクトルイメージングに選択されました。スケールバー= 100 μm(B)20倍の目的で撮影したスペクトル非混合後の合成画像。擬似色のマーカーが示され、赤いボックス内の拡大画像が画像の横に表示されます。スケールバー= 20 μm(C) 個々のマーカーごとの病理図。赤いボックス内の各マーカーの拡大画像が、画像の横に表示されます。スケールバー= 20 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:凍結マウス腫瘍上のマルチスペクトルイメージング。マルチスペクトルイメージングは、20倍の目的で採取した凍結マウスHLF16腫瘍の1x1領域に対して行った。合成イメージ (上)。擬似色のマーカーが示され、個々のマーカーの病理図(下)が描かれています。赤いボックス内の各マーカーの拡大画像が、元の画像の横に表示されます。スケールバー= 20 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:凍結マウス腫瘍セクションの分析。(A) セルセグメンテーションマップ。inFormを用いたアダプティブセルセグメンテーションを行った。ソフトウェアは、核(緑色)と膜(赤)を同定するために訓練されました。(B)各染色マーカーの表現型マップ。ソフトウェアは染色に基づいて、型を識別するために訓練されました。色付きのドットは、示されたマーカーを表します。「その他」(黒)は、示されたマーカーについて染色されなかった細胞を指す。(C)棒プロット(平均±STDEV)は、2つのマルチスペクトル画像における各マーカーの染色された細胞の数を表す。この数値は、各画像に表現されたセルを示しますが、マーカーが共発現しているかどうかは示しません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| フルオロフォア | 励起の最大値(nm) | 放出の最大値 (nm) | フィルタ セット (名前) での検出が期待されます。 |
| アレクサ・フルーオール 488 | 488 | 519 | Fitc |
| アレクサ・フルーオール 555 | 555 | 580 | サイ3とテキサスレッド |
| アレクサ・フルーオール 594 | 590 | 617 | テキサスレッド |
| アレクサ・フルーオール 647 | 650 | 668 | テキサスレッドとサイ5 |
| ダピス | 350 | 470 | ダピス |
| パーCP-サイ 5.5 | 482 | 690 | Cy3、テキサスレッド、サイ5 |
表1:最大励起波長と発光波長を有する蛍光体のリストと、適切なフィルタセットにおける検出が期待される。
| 冷凍マウス脾臓 | |||
| 抗体/染料 | クローン | 濃度(μg/mL) | |
| アレクサフルオール594抗マウスCD8a | 53-6.7 | 10 | |
| アレクサフルオール488抗マウスCD3 | 17A2 | 20 | |
| アレクサ・フルオール 647 アンチマウス CD4 | GK1.5 | 10 | |
| パーCP-サイ5.5ラットアンチCD11b | M1/70 | 2 | |
| アレクサフルオール555マウス抗Ki-67 | B56 | 10 | |
| ダピス | 0.1 | ||
| 凍結マウス腫瘍 | |||
| 抗体/染料 | クローン | 濃度(μg/mL) | |
| アレクサフルオール594抗マウスCD8a | 53-6.7 | 20 | |
| アレクサフルオール488抗マウスCD3 | 17A2 | 20 | |
| アレクサ・フルーオール 647 アンチマウス CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5ラット抗CD11b | M1/70 | 1 | |
| アレクサフルオール555マウス抗Ki-67 | B56 | 0.25 | |
| ダピス | 0.1 | ||
| 冷凍ヒト扁桃腺 | |||
| 抗体/染料 | クローン | 濃度(μg/mL) | |
| アレクサ・フルーオール 594 抗ヒト CD3 | UCHT1 | 10 | |
| パーCP/シアニン5.5抗ヒトCD4 | RPA-T4 | 4 | |
| アレクサ・フルーオール 647 抗ヒト CD8a | C8/144B | 10 | |
| アレクサ・フルーオール488、eバイオサイエンスアンチヒューマンCD20 | L26 | 10 | |
| アレクサフルオール555マウス抗Ki-67 | B56 | 1 | |
| ダピス | 0.1 | ||
表2:使用する抗体、クローン、および濃度のリスト。
補足図1:スペクトル非混合後の凍結HLF16腫瘍の個々の染色パターン。スケールバー= 20 μmこの図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
凍結組織は、従来から直接的および間接的な方法32を用いて組織上の3〜4個のマーカー31を検出するmIFイメージングに広く使用されてきた。直接法では、抗体は組織を標識するために蛍光色素または量子ドット33に結合し、一方、間接的な方法では、組織に対して一次抗体を特異的に認識するフルオロフォア共役二次抗体が続く組織を標識するために使用される。先に説明した最近の同時多重染色法のいくつかは、凍結組織を染色し、4つ以上のマーカーを検出するためにも使用することができる。しかし、試薬のコストと染色にかかる時間は、検出されるマーカーの数に応じて集中的になります。凍結組織に対するもう1つの多重技術は、マルチエピトープリガンド-カートグラフィ(MELC)34である。この技術は、フッ素色ホスフェート抗体でサンプルを染色し、蛍光色素のイメージングおよび光漂白を含む。この技術の主な注意点は、組織の1つのフィールドまたは領域のみを多重化することができるということです。他のフィールドや領域を多重化するには、この手法を手動で実行する必要があり、これは時間がかかるか、自動化が必要で、コストがかかります。1つのグループ35は、直接、間接、およびTSA染色の組み合わせを使用して凍結組織上の6色を検出することができた。しかし、組織染色には2日かかりました。それに比べて、我々の方法論は、5つの直接共役抗体とDAPIのカクテルを90分以内に凍結組織を染色するための適用を含む同時多重染色法を使用する。さらに、半自動多スペクトル蛍光イメージングシステムを用いて、この単純化された多重染色法を用いて、凍結した脾臓、扁桃、腫瘍組織の6つのマーカーをスペクトル的に分離し、検出することができました。Cy3、テキサスレッド、および顕微鏡で利用可能なCy5フィルターセットは、追加のフルオロフォアを検出する機会を提供し、それによって凍結組織で同時に検出できるマーカーの数を増やす可能性があります。
FFPE組織にTSAアプローチを用いた多重染色では、抗原検索ステップに続いて、順次標識、洗浄、およびストリッピングステップが必要です。この処置を行うのは、抗体6に使用されるインキュベーション時間に応じて1~2日の範囲である。最近、マイクロ流体組織プロセッサを用いて、TSAアプローチを用いた4プレックス染色を90分以内のFFPE組織に対して行った。FFPE組織の他の多重技術は、自動染色剤を使用して4〜5時間下で行うことができます。しかし、抗体36のエピトープの入手可能性を確保するために適切な抗原検索ステップを最適化する必要があり、これは抗体クローンの慎重な検討と検出されるマーカーの順序に依存する。例えば、CD3の一部の抗体クローンは、その後CD4およびCD8抗体が検出されない37を用いることができない。同様に、利用可能な抗体クローン17,18,18の間で抗原検出のばらつきがある。したがって、FFPE組織の多重染色には、抗体クローンの最適化、それらの濃度、およびそれらが染色される順序が必要であり、そのすべてが時間のかかる。対照的に、凍結組織の広範な組織処理の欠如は、高い特異性を有する様々な抗体クローンの使用を可能にする。さらに、凍結組織に利用可能な抗体クローンは、フローサイトメトリーおよびELISAにも使用することができ、様々なアッセイで同時に検証することができます。組織アーキテクチャは凍結組織38においても懸念される。凍結組織に示されている多重染色は、TSAアプローチよりも大幅に高速です。フルオロフォアの組み合わせは、特に同じ細胞の場所で発現する異なる抗原が検出された場合に、抗体が互いに滅菌的に妨げ合わないことを確実にするために、マーカーを慎重に選択する必要があります。スペクトル的に分離した蛍光体に異なる細胞を染色するマーカーを選択し、より良い検出を可能にしました。抗体濃度も最適化を必要としますが、染色プロトコルが速いため、最適化にかかる全体的な時間は時間がかかりません。我々の方法の注意点は、組織中の低発現マーカーを検出できないことである可能性があります。FFPE組織の多重染色法の中には、低発現マーカーを検出するのに有用なシグナル増幅ステップを伴うものもあります。しかし、二次抗体および第三次抗体の使用は、シグナルを増強するために使用することができる。このような場合、結果の誤った解釈を防ぐために、パネル内の抗体に対する交差反応性を避けるべきである。
免疫細胞に富んだマウス脾臓やヒト扁桃組織に加えて、凍結組織の多種蛍光イメージングの例として腫瘍組織を用いた。腫瘍におけるマルチスペクトル蛍光イメージングは、腫瘍微小環境(TME)39の特徴付け、悪性黒色腫40における導入T細胞転移の成功を予測する、および腫瘍シグナル伝達経路におけるタンパク質の特徴付けなどの貴重な情報を提供している。39腫瘍に一般的に見られる免疫細胞に特異的なマーカーを用いて、今回の研究で使用されたHLF16腫瘍組織中の浸潤性CD8 T細胞およびTAMを検出することができた。機械学習ソフトウェアを使用して、細胞をセグメント化し、表現型に成功しました。FFPE組織の多重染色は、信号増幅ステップを採用して、画像処理および定量化を助ける信号対雑音(SNR)比を増強する42,43,43を用いる。機械学習ソフトウェアは、信号増幅2で染色されたFFPE組織の分析に使用されています。ここで紹介する方法論はシグナル増幅を用いず、ソフトウェアを用いて細胞をセグメント化し表現型に成功させることができた。さらなる分析(表現型の共式と空間的関係)と定量の正確な解釈のために、ソフトウェアトレーニングではトレーニングセット、テストセット、検証セットを使用した検証が必要です。反復プロセスでは、1セットの画像(すなわち、トレーニングセット)を用い、別の画像セット(すなわち、テストセット)に対するモデルの予測が正確になるまで、特性を識別するための機械学習ソフトウェアを訓練する。トレーニングが完了すると、最終的なセットアサイドの画像(検証セット)が分析され、過度にフィットしたかどうかが確認されます。
結論として、ここで提示される方法論は、凍結組織を用いたマルチスペクトル蛍光イメージングを迅速に行う方法である。この方法は、いずれかの抗体が利用できないか、FFPE組織で検出できないマーカーを検出するのに有用である。機械学習ソフトウェアと組み合わせて、定量的分析を行うためにかかる時間は、迅速な前臨床診断および臨床診断を著しく促進し、凍結組織44を利用する高解像度の空間転写法の分野で適用され得る。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
イメージングと分析のガイダンスは、イリノイ大学シカゴ校の研究資料研究センター、研究組織イメージングコアによって提供され、研究担当副首相の事務所の支援を受けて設立されました。この研究は、NIH/NCI RO1CA191317からCLP、NIH/NIAMS(SBDRCはA.パラー博士に対して1P30AR075049-01)、ロバート・H・ルーリー総合がんセンターのノースウェスタン大学免疫療法評価コアの支援によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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