Summary
Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.
Abstract
Las imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos de parafina incrustada en formalina (FFPE) permiten la detección de múltiples marcadores en una sola muestra de tejido que pueden proporcionar información sobre la coexpresión de antígenos y la distribución espacial de los marcadores. Sin embargo, la falta de anticuerpos adecuados para los tejidos fijados con formalina puede restringir la naturaleza de los marcadores que se pueden detectar. Además, el método de tinción consume mucho tiempo. Aquí describimos un método rápido para realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. El método incluye las combinaciones de fluoróforos utilizadas, pasos detallados para la tinción de tejidos congelados de ratón y humanos, y los procedimientos de escaneo, adquisición y análisis. Para el análisis de tinción, se utiliza un sistema de imágenes de fluorescencia multiespectral semiautomática disponible en el comercio. A través de este método, se teñen y detectaron hasta seis marcadores diferentes en una sola sección de tejido congelado. El software de análisis de aprendizaje automático puede fenotipo células que se pueden utilizar para el análisis cuantitativo. El método descrito aquí para los tejidos congelados es útil para la detección de marcadores que no se pueden detectar en tejidos FFPE o para los que los anticuerpos no están disponibles para los tejidos FFPE.
Introduction
Los avances recientes en las técnicas de imágenes microscópicas han mejorado significativamente nuestro conocimiento y comprensión de los procesos biológicos y los estados de las enfermedades. La detección in situ de proteínas en los tejidos a través de la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) se realiza rutinariamente en patología. Sin embargo, la detección de múltiples marcadores mediante la tinción cromogénica de IHC es un desafío1 y se están desarrollando métodos más recientes para utilizar enfoques de tinción de inmunofluorescencia múltiple (mIF), en los que se están desarrollando múltiples marcadores biológicos etiquetados en una sola muestra de tejido. La detección de múltiples marcadores biológicos es útil, ya que la información relacionada con la arquitectura tisular, la distribución espacial de las células y la coexpresión de antígenos se capturan en una sola muestra de tejido2. El uso de la tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia ha hecho posible la detección de múltiples marcadores biológicos. En esta tecnología, utilizando ópticas específicas, los espectros de fluorescencia de cada fluoróforo individual pueden separarse o "sin mezclar", permitiendo la detección de múltiples marcadores sin ninguna conversación cruzada espectral3. La fluorescencia multiespectral se está convirtiendo en un enfoque crítico en biología celular, desarrollo de fármacos preclínicos, patología clínica y perfilinmune tumoral4,,5,6. Es importante destacar que la distribución espacial de las células inmunitarias (específicamente células T CD8) puede servir como factor pronóstico para los pacientes con tumores existentes7.
Se han desarrollado varios enfoques para la tinción de fluorescencia multiplex y se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente. En el método de tinción simultánea, todos los anticuerpos se suman como un cóctel en un solo paso para etiquetar el tejido. La tecnología UltraPlex utiliza un cóctel de anticuerpos primarios conjugados con ya hapten seguido de un cóctel de anticuerpos secundarios anti-hapten conjugados con fluoróforos. La tecnología InSituPlex8 utiliza un cóctel de anticuerpos primarios únicos conjugados por EL ADN que se añaden simultáneamente al tejido seguido de un paso de amplificación y finalmente sondas conjugadas con fluoróforoque que son complementarias a cada secuencia de ADN única en el anticuerpo primario. Ambas tecnologías permiten la detección de cuatro marcadores más 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear. Otros dos enfoques para la tinción multiplexación simultánea se basan en espectrometría de masas iónquinassecundarias 9. El sistema de imágenes Hyperion utiliza citometría de masa de imágenes10 para detectar hasta 37 marcadores. Esta tecnología utiliza un cóctel de anticuerpos conjugados metálicos para manchar los tejidos, y áreas específicas de los tejidos son abladas por un láser y transferidas a un citómetro de masa donde se detectan los iones metálicos. Otra tecnología similar es la IONPath, que utiliza la tecnología de imágenes de haz iónico multiplexado11. Esta tecnología utiliza un instrumento de espectrometría de masas modificado y una fuente de iones de oxígeno en lugar de láser para ablar los anticuerpos conjugados de metal. Si bien todos estos enfoques simultáneos de tinción múltiple permiten la detección de múltiples marcadores, no se pueden subestimar los costos involucrados por la conjugación de ADN, hapens o metales a anticuerpos, la pérdida de tejido debido a la ablación y el procesamiento de imágenes extenso para la desmezcla. Además, los kits y los protocolos de tinción están actualmente disponibles sólo para los tejidos FFPE y el desarrollo de paneles personalizados implica tiempo y gastos adicionales.
El método de tinción múltiple secuencial, en cambio, incluye etiquetar el tejido con un anticuerpo en un marcador, desmontar para eliminar el anticuerpo, seguido de repeticiones secuenciales de este proceso para etiquetar múltiples marcadores12. La amplificación de señal de tiramida (TSA) es el método de multiplexación secuencial más utilizado. Otras dos tecnologías de multiplexación utilizan una combinación de métodos de tinción simultáneos y secuenciales. La plataformaCODEX 13 emplea un cóctel de anticuerpos conjugados con secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN que finalmente se etiquetan con un fluoróforo utilizando un paso de polimerización indexado seguido de imágenes, desmontaje y repetición del proceso para detectar hasta 50 marcadores. El enfoque de tinción múltiple MultiOmyx14 es una iteración de tinción con un cóctel de tres a cuatro anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes, temple los fluoróforos y repetición de este ciclo para detectar hasta 60 marcadores en una sola sección. Al igual que el método de tinción múltiple simultánea, mientras que se puede detectar una amplia gama de marcadores, el tiempo involucrado en la tinción, la adquisición de imágenes, el procesamiento y el análisis es extenso. El paso de desmontaje/enfriamiento implica calentar y/o blanquear la muestra de tejido y, por lo tanto, el enfoque secuencial de tinción multiplex a los tejidos FFPE que mantienen la integridad del tejido al calentarse o blanquear.
La fijación de formalina y la posterior incrustación de parafina se realiza fácilmente en un entorno clínico, los bloques de tejido son fáciles de almacenar y varios protocolos de tinción multiplex están disponibles. Sin embargo, el procesamiento, incrustación y desparafinación de los tejidos FFPE, así como la recuperación de antígeno15, un proceso por el cual los anticuerpos pueden acceder mejor a los epítopos, es lento. Además, el procesamiento implicado en los tejidos FFPE contribuye a la autofluorescencia16 y enmascara los epítopos diana, lo que resulta en la variabilidad y falta de clon de anticuerpos disponible para detectar antígenos en los tejidos FFPE17,,18,,19. Un ejemplo es el antígeno leucocito humano (HLA) clase I alelos20. Por el contrario, la congelación rápida de los tejidos no implica extensos pasos de procesamiento antes o después de la fijación, eludiendo la necesidad de recuperación de antígenos21,22, y lo que es beneficioso para detectar una gama más amplia de objetivos. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para la fluorescencia multiespectral puede ser valioso para detectar dianas para estudios preclínicos y clínicos.
Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente al usar tejidos FFPE, preguntamos si se pueden realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. Para abordar esta pregunta, probamos un método de tinción múltiple simultánea utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluoróforos para detectar múltiples antígenos y analizamos la tinción utilizando un sistema de imágenes multiespectrales semiautomáticos. Pudimos manchar simultáneamente hasta seis marcadores en una sola sección de tejido en un solo radio de 90 minutos.
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Protocol
El bazo de ratón y los tejidos tumorales de ratón HLF1623 se obtuvieron de nuestro laboratorio. El tejido de las amígdalas humanas fue comprado a un vendedor comercial. Los detalles se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Incorporación de tejidos
- Incruste tejido fresco en la solución OCT (temperatura de corte óptima) y congele a presión utilizando hielo seco o nitrógeno líquido.
- Conservar los tejidos a -80oC.
2. Criosección
- Cortar secciones de 8 m en un criostato con temperaturas fijas a -25 oC.
NOTA: El grosor de sección preferido se puede ajustar para generar imágenes más nítidas. - Coloque secciones en los portaobjetos de vidrio cargados.
- Secar al aire las secciones durante 1 h a temperatura ambiente (RT) antes de fijar las acetonas heladas de grado histológico durante 10 min.
NOTA: La acetona causa la coagulación de proteínas solubles en agua y extrae lípidos, pero no afecta a los componentes que contienen carbohidratos. Por el contrario, la formalina preserva la mayoría de los lípidos y tiene poco impacto en los carbohidratos24. La elección del fijador es importante dependiendo de la elección del marcador que se detecte. - Almacene las diapositivas a -20 oC.
3. Selección de anticuerpos y fluoróforos
NOTA: Antes de la tinción tisular, los clones de anticuerpos que mancharán de forma robusta y específica sus antígenos de interés dentro de las secciones secuenciales del tejido fijo de acetona deben ser validados. Algunos anticuerpos pueden requerir un fijador diferente, y su compatibilidad con otros anticuerpos en el panel también tendrá que ser determinada empíricamente. El objetivo también es identificar fluoróforos con una superposición mínima que se pueden detectar con los filtros de epifluorescencia para DAPI, FITC, Cy3, Texas Red y Cy5.
- Confirmar la tinción por IHC convencional o detección de inmunofluorescencia (IF) en secciones de tejido con antígeno diana de expresión conocida.
- Utilizando los conjuntos de filtros de excitación y emisión disponibles en el sistema de imágenes semiautomatizadas y después de probar varias combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos, prepare fluoróforos para ser utilizados que tengan una superposición espectral mínima (por ejemplo, ver Tabla 1).
4. Tinción
NOTA: La rehidratación tisular y los lavados por diapositivas se realizaron en un frasco de Coplin. Los pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos se realizaron en una caja de diapositivas humidificada.
- Deje que las diapositivas se calienten a RT durante 5-10 min.
- Rehidratar en solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante 5 min.
- Realice un paso de bloqueo antes de manchar los tejidos con anticuerpos. Para las secciones del ratón, utilice la solución de bloqueo especializada (ver Tabla de materiales)durante 10 minutos en RT. Para las secciones humanas, utilice un 10% de suero humano agrupado normal (NHS) diluido en PBS durante 15 minutos a RT.
NOTA: Se pueden probar diferentes búferes de bloqueo según sea necesario para conservar las propiedades específicas de las secciones en función de los procedimientos de seguimiento que se utilizarán. - Lave los portaobjetos durante 5 minutos en PBS después del bloqueo.
- Para la tinción múltiple, prepare un cóctel de anticuerpos con fluoróforos compatibles en diluciones óptimas predeterminadas.
- Añade el cóctel de anticuerpos conjugados con fluoróforoa a las diapositivas. Para la tinción de un solo marcador, agregue solo el anticuerpo conjugado primario a la diapositiva.
- Incluya una diapositiva de control sin manchar que se someta al mismo procedimiento de tinción sin la adición de ningún anticuerpo conjugado primario.
- Incubar los portaobjetos durante 1 h a RT en la oscuridad y luego lavar los portaobjetos 2x con PBS durante 5 minutos cada uno. A partir de ahora, la diapositiva resultante se conoce como multiplex-tainedtained.
- Para contramancha, agregue DAPI a la diapositiva teñida de multiplex, incubar durante 7 minutos en la oscuridad en RT, y lavar las diapositivas 2x con PBS durante 5 minutos cada uno. No contrarreste las diapositivas de un solo mancha y sin manchas.
- Para cubrir, agregue una gota del medio de montaje y coloque suavemente el cubreobjetos de vidrio sobre el tejido.
5. Preparación de una biblioteca espectral
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Adquisición de imágenes
- Ajuste la potencia de la lámpara al 100%. Por lo general, la potencia se establece en 10% porque la detección de fluorescencia en los tejidos FFPE incluye un paso de amplificación de señal.
- Comience abriendo el software operativo del microscopio (ver Tabla de Materiales).
- Seleccione Editar protocolo y, a continuación, Nuevo protocolo.
- Proporcione un "Nombre de protocolo" y seleccione Fluorescencia en el modo de imageny proporcione un "Nombre de estudio".
- Coloque las diapositivas de un solo punto en el escenario y examine cada marcador en su canal de fluorescencia correspondiente para asegurar la tinción. Elija una región en el tejido que exprese la señal más fuerte para el marcador.
- Ajuste los tiempos de exposición con las opciones Enfoque automático y Autoexponer.
- Adquiera instantáneas para las diapositivas de un solo mancha dote y sin manchas y guarde el protocolo.
NOTA: Los siguientes pasos se realizan en el software de aprendizaje automático (consulte Tabla de materiales),utilizando las diapositivas individuales manchadas y no manchadas para verificar manchas específicas, así como para determinar la conversación cruzada de anticuerpos. - En la pestaña Build Libraries del software, cargue cada imagen de diapositiva de un solo mancha, elija el Fluor adecuado y haga clic en Extraer. El software extraerá automáticamente la señal de fluorescencia elegida en el Fluor.
- Para guardar el color extraído, haga clic en Guardar en tienda. Se puede crear un "Nuevo grupo" o el color extraído se puede almacenar en un grupo existente.
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Verificación de la biblioteca espectral
- Compruebe la ventana de curva espectral de emisión, situada a la derecha de la imagen extraída, para cada conjunto de filtros.
NOTA: La señal extraída es correcta si la curva espectral sólo se observa en los conjuntos de filtros donde se detecta el fluoróforo. Si se observa una curva espectral en el conjunto de filtros incorrecto, puede significar que la señal primaria esperada en el conjunto de filtros no es lo suficientemente fuerte, o el software está detectando otra señal que es demasiado alta, posiblemente debido a la superposición espectral. En este caso, primero intente utilizar la herramienta Dibujar regiones de procesamiento para dibujar regiones alrededor de áreas que expresan el marcador fluorescente y la autofluorescencia en la imagen. Esto entrena el software para detectar la señal verdadera y eliminar cualquier señal que interfiera. Si esto no funciona, repita el proceso de tinción de la diapositiva de un solo mancha para probar diferentes valoraciones de anticuerpos.
- Compruebe la ventana de curva espectral de emisión, situada a la derecha de la imagen extraída, para cada conjunto de filtros.
6. Imágenes multiespectrales
NOTA: Una vez creada y verificada la biblioteca espectral, realice los pasos siguientes para la diapositiva manchada de multiplex.
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Escaneo de diapositivas enteras
- Ajuste los tiempos de enfoque y exposición en la diapositiva teñida de múltiplex como se menciona en la sección 5.1.
- En Escanear diapositivas, cree una nueva tarea y elija el protocolo guardado anteriormente.
- Realice un escaneo de diapositivas completo en la diapositiva con punto multiplex.
- Con todo el software de escaneo de diapositivas, abra toda la imagen de escaneo de diapositivas. Esta imagen no se ha desmezclado espectralmente.
- Seleccione regiones de interés (ROI) en toda la imagen de escaneado de diapositivas utilizando la herramienta Sello o ROI. Estos ROI se analizarán utilizando los tiempos de exposición establecidos en 6.1.1 para ser utilizados para la desmezcla espectral y el análisis.
- Haga clic en Procesar diapositiva para adquirir ROI con aumento de 20x
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Desmezcla espectral
- Una vez adquiridos los ROI, en el software de aprendizaje automático, en la pestaña Análisis manual, cargue las imágenes manchadas multiplex haciendo clic en Abrir en Archivo.
- En el menú desplegable Fuente de la biblioteca espectral, haga clic en Seleccionar fluores.
- Se abrirá una nueva ventana. Aquí, elija la biblioteca espectral o el grupo creado anteriormente.
- Cargue la imagen de diapositiva sin conservar. Haga clic en el icono del marcador de tinta AF situado encima de la biblioteca espectral seleccionada y dibuje una línea o región en la diapositiva no manchada para identificar la autofluorescencia en el tejido.
- En la pestaña Editar marcadores y colores, asigne nombres para cada marcador. Los pseudocolores se pueden asignar en este paso.
NOTA: El color de la imagen Autofluorescence se establece de forma predeterminada en DarkSlateGray. Cambia esto a Negro. - Haga clic en Preparar todo.
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Verificación de imágenes espectralmente no mezcladas
NOTA: Cuando se completa el paso de desmezcla espectral, se crea una imagen compuesta que consta de todos los colores.- Haga clic en el icono Editar el ojo de vista. Aquí, cada color de la "Visualización de componentes" se puede desactivar o activar para ver la tinción de cada marcador individual.
- Inspeccione visualmente la tinción y la morfología de las células para asegurarse de que no hay superposición de marcador, a menos que sea biológicamente relevante. Un patólogo también puede ayudar a verificar la tinción.
NOTA: La tinción en la diapositiva multiplexada debe validarse dejando fuera un fluoróforo a la vez y revisando el patrón de tinción. Además, la validación también ayudará a identificar fluoróforos fuertes que aparecen en espectros adyacentes debido a la conversación cruzada de anticuerpos o sangrado. - Para Vistas de patología, que simulan imágenes de campo brillante para cada marcador fluorescente, haga clic en el botón Seleccionar una imagen de componente. Aquí, elija un marcador para ver una imagen de campo brillante simulada.
7. Análisis de imágenes multiespectrales a través de la segmentación celular y la fenotipación
NOTA: Después de verificar la imagen espectralmente no mezclada, la segmentación de celdas se puede realizar utilizando el software de aprendizaje automático, que proporcionará instrucciones paso a paso. La segmentación de tejidos no se realizó aquí. Si el panel incluye uno o más marcadores específicos de tejido y especialmente si el tejido es desordenado, se debe realizar la segmentación del tejido.
- Seleccione"Citoplasma"y"Membrana"bajo la opción "Segmento".
NOTA: "Nuclei" se elige por defecto. - Seleccione un marcador en el panel. Configure el marcador para detectar núcleos, citoplasma o membrana. Por ejemplo, se puede seleccionar DAPI para detectar núcleos y CD3 para membrana.
- Haga clic en el botón de puntos suspensivos ('...') para seleccionar una opción en"utilizar esta señal para encontrar". Por ejemplo, 'núcleos' para DAPI. Se pueden seleccionar varios marcadores del panel para la segmentación.
NOTA: Para marcadores citoplasmas mifósicos o de membrana, seleccione la opción "Utilice esta señal para ayudar en lasegmentación nuclear". - El software detecta y crea automáticamente una máscara para el núcleo, el citoplasma y la membrana en la imagen.
- Asegúrese de que todas las celdas estén 'enmascaradas' para la segmentación. Para ajustar, cambie a la vista Patología para el marcador específico elegido en 7.3. y utilizar las opciones de configuración en el software.
- Haga clic en "Segmentar todo" para segmentar celdas.
- Después de la segmentación celular, proceda con las células de fenotipado. En este paso, elija los marcadores necesarios para el fenotipado y seleccione manualmente al menos cinco celdas que estén claramente teñidas con el marcador elegido. Esto entrena el software para detectar automáticamente todas las celdas manchadas con el marcador elegido en la imagen.
- Se crea un mapa de fenotipo. Analice para asegurarse de que la célula manchada con el marcador está correctamente fenoticada.
NOTA: El fenotipado celular puede ser un proceso iterativo. Si el software no puede fenotipo de las células correctamente, significa que el entrenamiento es inadecuado o incorrecto. En este caso, el usuario tiene que seleccionar manualmente más celdas y volver a entrenar el software y repetir este paso hasta que el usuario esté satisfecho con el entrenamiento. - Cree un grupo denominado "Otros" e incluya celdas que no estén manchadas para ninguno de los marcadores.
NOTA: Este paso es importante para entrenar el software para excluir todas las células no retenidas de la fenotipación.
8. Exportación de imágenes y tablas de análisis
- Haga clic en el botón Exportar para ver el panel Configuración de exportación.
- En el "Directorio de exportación", haga clic en Examinar para seleccionar una ubicación para exportar las imágenes.
- En "Opciones de exportación de imagen", elija Formato de salidade imagen .
- En la lista "Imágenes para exportar", seleccione las imágenes que desea exportar. "Imagen compuesta" es la imagen final sin mezclar pseudocolor. "Vistas patológicos" son las imágenes de campo brillante simuladas individuales y las "Imágenes de componentes (TIFF multiimagen)" es un archivo TIFF de varias imágenes de datos de componentes que puede ser utilizado por software de análisis de terceros.
- Haga clic en el botón"Exportar para todos"para exportar las imágenes.
NOTA: Las tablas del análisis también se pueden seleccionar y exportar en este paso.
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Representative Results
Detección de marcadores de un solo mancha en secciones de bazo congelado
Como el sistema de imágenes semiautomatizadautiliza un sistema de filtro ajustable de cristal líquido (LCTF) que permite una gama más amplia de detección de longitud de onda25,y debido a que no se realizaron pasos de amplificación de señal aquí, primero optimizamos la detección de nuestros anticuerpos conjugados primarios para cada marcador en el microscopio. Un ejemplo se muestra en la Figura 1,donde cada marcador teñido uno es de color rojo pseudocolor. Los anticuerpos conjugados Alexa Fluor utilizados aquí han sido validados por las empresas para la inmunofluorescencia y la citometría de flujo. Sin embargo, el fluoróforo Per-CP-Cy5.5 solo se valida para la citometría de flujo. Pudimos detectar este color en nuestras diapositivas de un solo mancha, apoyando la idoneidad de anticuerpos validados por citometría de flujo para su uso en imágenes multiespectrales y proporcionando el beneficio de utilizar dichos anticuerpos para validar observaciones utilizando dos técnicas diferentes (es decir, citometría de flujo e imágenes multiespectrales). Luego procedimos a realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.
Detección de fluorescencia multicolor en el bazo congelado del ratón
Para probar el método de tinción multiplex y las imágenes espectrales, utilizamos tejido de bazo congelado con ratón, que tiene una abundancia de células inmunitarias. La Figura 2 muestra una imagen espectralmente no mezclada de diferentes marcadores en una sección del bazo congelado del ratón. Los anticuerpos, clones y concentraciones utilizados para la tinción se describen en la Tabla 2. La imagen capturada muestra una porción de la zona de células T identificada por la presencia de marcadores CD3, CD4 y CD8, rodeados de células mieloides que expresan CD11b observadas principalmente en la zona marginal. Las regiones de células proliferantes que expresan Ki67 se observan principalmente en centros germinales. La opción "Vistas patopatologías" para cada marcador mostró su patrón de tinción individual dentro del tejido. Se observaron patrones de tinción distintos para los marcadores CD11b, Ki67 y CD3, CD4 y CD8, lo que sugiere que el método de tinción multiplex a las imágenes espectrales funcionó en el tejido congelado.
Detección de fluorescencia multicolor en amígdalas humanas congeladas
Después de probar un panel de tinción adecuado para el tejido del ratón, a continuación evaluamos un panel separado para el tejido de amígdala congelado. La Figura 3 muestra una imagen espectralmente no mezclada de los diferentes marcadores utilizados. Los anticuerpos, clones y concentraciones utilizados para la tinción se describen en la Tabla 2. La imagen capturada muestra un centro germinal folicular26 que expresa células B identificadas por el marcador CD20. Ki67 identificó las células proliferantes en el centro germinal folicular. Algunas de estas células proliferantes se coperecieron con CD20 y pueden ser centroblasts27,células B ingenuas que sufren hipermutación somática activa. Los centros germinales foliculares estaban rodeados por la región de células T interfoliculares identificada por la expresión de CD3, CD4 y CD8. Una vez más, aquí se observaron patrones de tinción distintos, lo que confirma que la metodología funcionó en un tejido congelado.
Aplicación de imágenes multiespectrales de fluorescencia en tejido tumoral de ratón congelado
La imagen multiespectral es una herramienta útil para controlar la infiltración de células inmunitarias en tumores como pronóstico de inmunoterapias. Con este fin, nos propusimos manchar una muestra de tejido tumoral de ratón congelado y detectar infiltrados de células inmunitarias. La línea celular HLF16 se utiliza como virus del papiloma humano (VPH)+ modelo tumoral de cáncer de cuello uterino en ratones transgénicos HLA-A*020128. La línea celular transgénica fue desarrollada transfectando fibroblastos pulmonares cardíacos de HLA-A*0201 con oncogenes HPV16 E6 y E7 y H-Ras V1228. Los células T y los macrófagos asociados a tumores son los infiltrados inmunes más comunes presentes en los tumores29. La Figura 4 muestra una imagen espectralmente no mezclada en una sección de tumor HLF16 congelada junto con las vistas patopatologías; los patrones de tinción individuales se muestran en la Figura Suplementaria 1. Los anticuerpos, clones y concentraciones utilizados para la tinción se describen en la Tabla 2. La imagen capturada muestra regiones de células T infiltrantes tumorales identificadas por los marcadores CD3 y CD8 junto con la presencia de otros linajes celulares mieloides identificados por el marcador CD11b. La región capturada también muestra macrófagos asociados a tumores (TAC), posiblemente del fenotipo M2, detectado por el marcador CD20630,que está estrechamente asociado a varias células que proliferan detectadas como Ki67+.
El software de aprendizaje automático2 viene con características como análisis de tejidos y células. Estos análisis se realizan comúnmente en tejidos FFPE manchados con amplificación de señal. Como nuestra metodología no utiliza amplificación de señal, queríamos probar si el software podría ser utilizado para analizar la tinción en los tejidos congelados. Usando la característica adaptativa del software, pudimos segmentar las células en función de un marcador nuclear y de membrana y de las células fenotipos basadas en los marcadores utilizados para la tinción. La Figura 5 muestra la segmentación celular y los mapas de fenotipo y el número de células manchadas para cada marcador analizado por el software, demostrando que el software se puede utilizar para la cuantificación de la tinción multiespectral en tejidos congelados.
Figura 1: Detectar anticuerpos conjugados primarios mediante un microscopio de filtro ajustable de cristal líquido. Los anticuerpos conjugados primarios con los marcadores indicados se teñían en un bazo de ratón congelado y se detectaban utilizando el sistema de imágenes multiespectrales Vectra 3.0 bajo objetivos de 20x. CD3 en Alexa Fluor 488, CD8 en Alexa Fluor 594, CD11b en Per-CP Cy5.5, CD206 en Alexa Fluor 647 y Ki67 en Alexa Fluor 555 fueron utilizados. Cada marcador es de color rojo pseudocolor. No se usó contramancha en estas diapositivas. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes multiespectrales en un bazo de ratón congelado. (A) Escaneo de diapositivas completo de la diapositiva manchada multiplexada tomada bajo objetivos 4x. Se eligió un sello de 2 x 2 en diferentes regiones del tejido para la toma de imágenes multiespectrales. Barra de escala a 100 m. (B) Imagen compuesta tomada bajo un objetivo 20x después de la desmezcla espectral. Se indican los marcadores pseudocolores y se muestra una imagen magnificada dentro del cuadro rojo junto a la imagen. Barra de escala a 20 m. (C) Vistas patogales para cada marcador individual. Una imagen ampliada para cada marcador dentro del cuadro rojo se muestra junto a la imagen. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes multiespectrales en una amígdala humana congelada. (A) Escaneo de diapositivas completo de la diapositiva manchada multiplexada tomada bajo un objetivo 4x. Se eligió un sello de 1 x 1 (669 m x 500 m) en diferentes regiones del tejido para la toma de imágenes multiespectrales. Barra de escala a 100 m. (B) Imagen compuesta después de la desmezcla espectral tomada bajo un objetivo de 20x. Se indican los marcadores pseudocolores y se muestra una imagen magnificada dentro del cuadro rojo junto a la imagen. Barra de escala a 20 m. (C) Vistas patogales para cada marcador individual. Una imagen ampliada para cada marcador dentro del cuadro rojo se muestra junto a la imagen. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes multiespectrales en un tumor de ratón congelado. Las imágenes multiespectrales se realizaron en una región de 1 x 1 de un tumor HLF16 de ratón congelado tomado bajo un objetivo de 20x. La imagen compuesta (arriba). Se indican los marcadores pseudocolores y se representan las vistas patopatologías (abajo) para cada marcador individual. Una imagen ampliada para cada marcador dentro del cuadro rojo se muestra junto a la imagen original. Barra de escala de 20 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de una sección de tumor de ratón congelado. (A) Mapa de segmentación de celdas. Se realizó la segmentación de celdas adaptable mediante inForm. El software fue entrenado para identificar núcleos (verde) y membrana (rojo). (B) Mapas de fenotipo para cada marcador manchado. El software fue entrenado para identificar fenotipos basados en la tinción. El punto de color representa el marcador indicado. "Otros" (negro) se refiere a las celdas que no se mancharon para el marcador indicado. (C) Gráfica de barras (media de STDEV) que representa el número de celdas teñidas para cada marcador en dos imágenes multiespectrales. El número indica las células fenotipo en cada imagen, pero no indica si los marcadores están coexpresados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fluoróforo | Máximo de excitación (nm) | Máximo de emisión (nm) | Detección esperada en el conjunto de filtros (nombre) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | Fitc |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 y Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Texas Red |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Red y Cy5 |
| Dapi | 350 | 470 | Dapi |
| PerCP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Red y Cy5 |
Tabla 1: Lista de fluoróforos con sus máximas longitudes de onda de excitación y emisión y detección esperada en conjuntos de filtros adecuados.
| Bazo de ratón congelado | |||
| Anticuerpo/Dye | Clon | Concentración (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 antiratón CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 antiratón CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 antiratón CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Ratón anti-Ki-67 | B56 | 10 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Tumor de ratón congelado | |||
| Anticuerpo/Dye | Clon | Concentración (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 antiratón CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 antiratón CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 antiratón CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Rata Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Ratón anti-Ki-67 | B56 | 0.25 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Tonsil humano congelado | |||
| Anticuerpo/Dye | Clon | Concentración (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 CD3 antihumano | UCHT1 | 10 | |
| PerCP/Cyanine5.5 CD4 antihumano | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 CD8a antihumano | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humano CD20 | L26 | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Ratón anti-Ki-67 | B56 | 1 | |
| Dapi | 0.1 | ||
Tabla 2: Lista de anticuerpos, clones y concentraciones utilizadas.
Figura suplementaria 1: Patrones de tinción individuales del tumor congelado HLF16 después de la desmezcla espectral. Barra de escala de 20 m Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Los tejidos congelados se han utilizado ampliamente para la toma de imágenes mIF para detectar tradicionalmente de tres a cuatro marcadores31 en un tejido utilizando el método directo e indirecto32. En el método directo, los anticuerpos se conjugan con los tintes fluoresciosos o los puntos cuánticos33 para etiquetar el tejido, mientras que en el método indirecto, se utiliza un anticuerpo primario no conjugado para etiquetar el tejido seguido de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo que reconoce específicamente el anticuerpo primario. Algunos de los recientes enfoques simultáneos de tinción múltiple x discutidos anteriormente también se pueden utilizar para manchar tejidos congelados y detectar más de cuatro marcadores. Pero el costo de los reactivos y el tiempo necesario para la tinción se vuelven intensivos dependiendo del número de marcadores que se detectan. Otra técnica multiplex para tejidos congelados es la cartografía multiepitopé-ligand (MELC)34. La técnica consiste en manchar la muestra con anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes y fotoblanqueo del fluoróforo. Una advertencia importante de esta técnica es que sólo un campo o región del tejido puede ser multiplexado. Para multiplexar otros campos o regiones, la técnica debe realizarse manualmente, lo que consume mucho tiempo o requiere automatización, lo que es costoso. Un grupo35 fue capaz de detectar seis colores en los tejidos congelados utilizando una combinación de tinción directa, indirecta y TSA. Sin embargo, la tinción de tejido tomó 2 días. En comparación, nuestra metodología utiliza un método de tinción múltiple simultánea que implica la aplicación de un cóctel de cinco anticuerpos directamente conjugados más DAPI para manchar tejidos congelados en un plazo de 90 minutos. Además, utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia multiespectral semiautomática, pudimos separar espectralmente y detectar seis marcadores en bazo congelado, amígdalas y tejidos tumorales utilizando esta técnica de tinción múltiple simplificada. Los conjuntos de filtros Cy3, Texas Red y Cy5 disponibles en el microscopio proporcionan oportunidades para detectar fluoróforos adicionales, lo que potencialmente aumenta el número de marcadores que se pueden detectar simultáneamente en tejidos congelados.
La tinción múltiple utilizando el enfoque TSA en los tejidos FFPE requiere un paso de recuperación de antígenos seguido de pasos secuenciales de etiquetado, lavado y desmontaje. La realización del procedimiento oscila entre 1-2 días dependiendo de los tiempos de incubación utilizados para los anticuerpos6. Recientemente, utilizando un procesador de tejido microfluídico, se realizó una tinción de cuatro plénes utilizando el enfoque TSA en tejidos FFPE de menos de 90 minutos. Otras técnicas de multiplexación para los tejidos FFPE se pueden realizar bajo 4-5 h usando una tinción automatizada. Sin embargo, es necesario optimizar los pasos adecuados de recuperación de antígenos para garantizar la disponibilidad de epítopos para los anticuerpos36,lo que a su vez se basa en la cuidadosa consideración de los clones de anticuerpos, así como en el orden de los marcadores que se detectan. Por ejemplo, algunos clones de anticuerpos de CD3 no se pueden utilizar, ya que posteriormente los anticuerpos CD4 y CD8 no se detectan37. Del mismo modo, existe variabilidad de la detección de antígenos entre los clones de anticuerpos disponibles17,18. Por lo tanto, la tinción múltiple x de los tejidos FFPE requiere la optimización de los clones de anticuerpos, sus concentraciones y el orden en que están manchados, todo lo cual consume mucho tiempo. Por el contrario, la falta de procesamiento extenso de tejidos de tejidos congelados permite el uso de varios clones de anticuerpos con alta especificidad. Además, los clones de anticuerpos disponibles para tejidos congelados también se pueden utilizar en citometría de flujo y ELISA, lo que permite la validación simultánea en varios ensayos. La arquitectura de tejidos también es una preocupación en los tejidos congelados38. La tinción múltiple que se muestra aquí en los tejidos congelados es significativamente más rápida que el enfoque de la TSA. Las combinaciones de fluoróforos requieren una cuidadosa selección de marcadores para garantizar que los anticuerpos no se obstraculicen entre sí, especialmente cuando se detectan diferentes antígenos expresados en la misma ubicación celular. Elegimos marcadores que manchan diferentes células en fluoróforos que están separados espectralmente, lo que permite una mejor detección. Las concentraciones de anticuerpos también requieren optimización, pero debido a que el protocolo de tinción es rápido, el tiempo total necesario para la optimización no consume mucho tiempo. Una advertencia a nuestro método puede ser la incapacidad de detectar marcadores de baja expresión en los tejidos. Algunos de los enfoques de tinción multiplex en los tejidos FFPE implican un paso de amplificación de señal que es útil para detectar marcadores de expresión bajos. Sin embargo, se puede emplear el uso de anticuerpos secundarios y terciarios para aumentar la señal. En tales casos, debe evitarse la reactividad cruzada de los anticuerpos en el panel para evitar una interpretación incorrecta de los resultados.
Además del bazo de ratón y los tejidos de amígdalas humanas, que son ricos en células inmunitarias, hemos utilizado el tejido tumoral como ejemplo para la imagen de fluorescencia multiespectral propuesta de tejidos congelados. Las imágenes multiespectrales de fluorescencia en tumores han proporcionado información valiosa, como la caracterización del microambiente tumoral (TME)39,la predicción del éxito de las transferencias adoptivas de células T en el melanoma maligno40y la caracterización de proteínas en las vías de transducción de señales tumorales41. Usando marcadores específicos de las células inmunitarias que se encuentran comúnmente en los tumores, pudimos detectar células T CD8 infiltrantes y TAM en el tejido tumoral HLF16 utilizado en este estudio. Utilizamos el software de aprendizaje automático para segmentar con éxito y células de fenotipo. La tinción múltiple x para tejidos FFPE emplea un paso de amplificación de señal para mejorar la relación señal-ruido (SNR) que ayuda al procesamiento de imágenes y la cuantificación42,,43. El software de aprendizaje automático se ha utilizado para análisis en tejidos FFPE manchados con amplificación de señal2. La metodología presente aquí no utiliza amplificación de señal, pero pudimos segmentar con éxito y fenotipo de células utilizando el software. Para un análisis posterior (por ejemplo, coexpresión de fenotipo y relaciones espaciales) e interpretación precisa de la cuantificación, el entrenamiento de software requiere validación mediante un conjunto de entrenamiento, un conjunto de pruebas y un conjunto de validación. En un proceso iterativo, se utiliza un conjunto de imágenes (es decir, el conjunto de entrenamiento) para entrenar el software de aprendizaje automático para identificar los fenotipos hasta que las predicciones del modelo para un conjunto separado de imágenes (es decir, el conjunto de pruebas) sean precisas. Una vez completado el entrenamiento, se analiza un lote final de imágenes de retirada de tierras (es decir, el conjunto de validación) para ver si ha habido un exceso de ajuste.
En conclusión, la metodología presentada aquí es una forma rápida de realizar imágenes de fluorescencia multiespectral utilizando tejidos congelados. El método es útil para detectar marcadores en los que los anticuerpos no están disponibles o no se pueden detectar en tejidos FFPE. Junto con el software de aprendizaje automático, el tiempo necesario para realizar análisis cuantitativos puede facilitar significativamente diagnósticos preclínicos y clínicos rápidos y puede aplicarse en el campo de la transcriptomica espacial de alta resolución que utiliza tejidos congelados44.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
La guía de imágenes y análisis fue proporcionada por el Centro de Recursos de Investigación – Investigación histológica y núcleo de imágenes de tejidos en la Universidad de Illinois en Chicago establecido con el apoyo de la oficina del Vicecanciller de Investigación. El trabajo fue apoyado por NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, por NIH/NIAMS (SBDRC otorgan 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, y por el apoyo del Centro Integral del Cáncer Robert H. Lurie al Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia en la Universidad Northwestern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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