नई अनुक्रम विशिष्टता के साथ प्रतिबंध एंनोन्यूकपट्ट्स को आंशिक रूप से पतित अनुक्रम को पहचानने वाले एंजाइमों से विकसित किया जा सकता है। यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हम सफलतापूर्वक एनएलएआईवी एंजाइम की अनुक्रम विशिष्टता को बदलने के लिए करते थे। प्रोटोकॉल के प्रमुख तत्व प्रतिलेखन/अनुवाद प्रतिक्रिया और नए अनुक्रम विशिष्टताओं के साथ वेरिएंट के चयन के इन विट्रो विभाजक हैं ।
प्रतिबंध एंटॉन्यूकलीज (REase) विशिष्टता इंजीनियरिंग बेहद मुश्किल है। यहां हम एक मल्टीस्टेप प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो आरईईवे का उत्पादन करने में मदद करता है जिसमें माता-पिता के एंजाइम की तुलना में अधिक कठोर विशिष्टता होती है। प्रोटोकॉल के लिए आरएनई के वेरिएंट के लिए अभिव्यक्ति चयन कैसेट (ईएससीएस) की लाइब्रेरी बनाने की आवश्यकता होती है, आदर्श रूप से डीएनए बाध्यकारी को प्रभावित करने की संभावना वाली स्थितियों में परिवर्तनशीलता के साथ। ईएससी को प्रतिबंध साइट गतिविधि वांछित और बायोटिन टैग के लिए एक अनुक्रम द्वारा एक तरफ और दूसरी तरफ अवांछित गतिविधि और एक प्राइमर एनिंग साइट के लिए प्रतिबंध साइट द्वारा फ्लैंक किया जाता है। ईएससीएस को पानी में तेल पायस में लिखित और अनुवादित किया जाता है, ऐसी स्थितियों में जो प्रति बूंद एक से अधिक डीएनए अणु की उपस्थिति की संभावना नहीं है । इसलिए, प्रत्येक कैसेट अणु में डीएनए केवल अनुवादित, एन्कोडेड एंजाइम की गतिविधि के अधीन होता है। वांछित विशिष्टता के REase वेरिएंट बायोटिन टैग को हटा दें लेकिन प्राइमर एनिंग साइट नहीं। पायस को तोड़ने के बाद, डीएनए अणुओं को बायोटिन पुलडाउन के अधीन किया जाता है, और केवल अधिनेत में उन लोगों को बनाए रखा जाता है। यह कदम आश्वस्त करता है कि केवल उन वेरिएंट के लिए ईएससी जो वांछित गतिविधि नहीं खो चुके हैं, बनाए रखे गए हैं। इन डीएनए अणुओं को पहले पीसीआर प्रतिक्रिया के अधीन किया जाता है । अवांछित अनुक्रम में दरार प्राइमर में से एक के लिए प्राइमर बाध्यकारी साइट को काटदेता है। इसलिए, पीसीआर अवांछित गतिविधि के बिना बूंदों से केवल ईएससीएस को बढ़ाती है। इसके बाद वांछित विशिष्टता और बायोटिन टैग के लिए प्रतिबंध स्थल को फिर से शुरू करने के लिए एक दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया की जाती है, ताकि चयन कदम दोहराया जा सके। चयनित खुले पढ़ने के फ्रेम बैक्टीरियल कोशिकाओं में अधिक व्यक्त किए जा सकते हैं जो माता-पिता की रेज़ के कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज़ को भी व्यक्त करते हैं, क्योंकि नए विकसित आरईईएस केवल मिथाइलट्रांसफरेज़ लक्ष्य साइटों के सबसेट को लक्षित करता है।
अनुक्रम विशिष्टता इंजीनियरिंग कक्षा द्वितीय REases के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है । एंनोन्यूकपट्टों के इस वर्ग में, अनुक्रम मान्यता और उत्प्रेरक बारीकी से जुड़े हुए हैं, सबसे शायद अपने कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज की तुलना में व्यापक विशिष्टता के एंड्रोन्कलीज के निर्माण के खिलाफ एक विकासवादी सुरक्षा के रूप में, जो मेजबान डीएनए को नुकसान पहुंचाएगा। कोशिकाओं में नई विशिष्टताओं के निर्देशित विकास और नव इंजीनियर एंनोन्यूलीज गतिविधि के खिलाफ मेजबान डीएनए की रक्षा की जरूरत से जटिल है । इसलिए, आरएनई इंजीनियरिंग के कुछ सफल प्रयास ों की सूचना दी गई है और वे सभी एक विशेष एंजाइम,,1,2,,3,4,,55,6,,7की अनूठी विशेषताओं का दोहन करते हैं।
यहां हम विशिष्टता इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसका उपयोग एंटोन्यूलीज वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जिसमें माता-पिता के एंजाइम की तुलना में संकीर्ण विशिष्टता होती है जो एनएलआईवी एंनोन्यूलीज8की हमारी सफल इंजीनियरिंग पर आधारित है। एक मनमाने ढंग से मान्यता अनुक्रम के साथ ऐसे किसी भी एंजाइम के लिए, अतिरिक्त विशिष्टता flanks में ठिकानों के लिए शुरू किया जा सकता है । माता-पिता के एंजाइमों के लिए जो आंशिक रूप से पतित दृश्यों (जैसे अपने जीजीएनएनसीसी लक्ष्य के साथ NlaIV) को पहचानते हैं, मान्यता अनुक्रम के भीतर अतिरिक्त विशिष्टता भी पेश की जा सकती है। के रूप में अतिरिक्त विशिष्टता की संभावना प्रोटीन डीएनए संपर्कों की आवश्यकता होगी, नए मांयता प्राप्त ठिकानों डीएनए पर माता पिता के एंनोटुकपट्टे के पदचिह्न के भीतर झूठ होना चाहिए । सैद्धांतिक रूप से मान्यता क्रम की किसी भी वांछित विशेषज्ञता के लिए चयन योजनाएं स्थापित की जा सकती हैं । हालांकि, अधिकांश REases जो पालिनड्रोमिक और लगभग पैलंड्रोमिक लक्ष्य दृश्यों को पहचानते हैं, कार्यात्मक डिमर हैं जो पैलिनड्रोम की केवल आधी साइट को पहचानते हैं। इसलिए, प्रोटीन न्यूक्लिक इंटरैक्शन की समरूपता का उल्लंघन करने वाली नई विशिष्टताओं का चयन काम करने की संभावना नहीं है। उदाहरण के लिए, डिमेरिक NlaIV के लिए, जीजीएनएनसीसी अनुक्रम को सैद्धांतिक रूप से जीजीएटी सीजीटीसी तक संकुचित किया जा सकता है लेकिन जीएजीएसीसी के नीचे विशिष्टता को कम करने के लिए और अधिक कठिन होने की उम्मीद है। हमारी योजना में सकारात्मक और नकारात्मक चयन दोनों शामिल हैं।
यह प्रक्रिया अधिक कुशल होती है जब नकारात्मक चयन का उपयोग पसंदीदा संकरा विशिष्टता के अलावा अन्य सभी दृश्यों को क्लीव करने में सक्षम विशिष्टताओं को हटाने के लिए भी किया जाता है। उदाहरण के लिए, जीजीएटीसीसी के लिए चयन को जीजीबीवीसीसी के खिलाफ एंटीसेलेक्शन के साथ जोड़ा जा सकता है (जहां बी ए के अलावा कोई आधार है, और वी टी के अलावा कोई आधार है)। जब कुछ संभावित लक्ष्य दृश्यों को कवर नहीं किया जाता है, तो चयन प्रयोग का परिणाम सकारात्मक और नकारात्मक चयन की प्रभावशीलता पर निर्भर करता है। हमारे NlaIV काम में, हम GGATCC के लिए चयनित है, और GGSSCC के खिलाफ (जहां एस जी या सी है), और एक विशिष्टता है कि, समरूपता तोड़ने लक्ष्यों की अनदेखी, GGWWCC के रूप में वर्णित किया जा सकता है प्राप्त (जहां डब्ल्यू एक या टी है), सुझाव है कि इस विशेष मामले में, नकारात्मक चयन अधिक था सकारात्मक चयन से महत्वपूर्ण है।
हमारा दृष्टिकोण अभिव्यक्ति चयन कैसेट (ईएससी) के निर्माण से शुरू होता है। ईएससी को अनुभागों में संरचित किया गया है। अंदर कोर सेक्शन पर टी7 प्रमोटर कंट्रोल के तहत आरईई ईके के ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) के वेरिएंट हैं । ईएससी के इस कोर सेक्शन में इंजीनियर आरईई ईज के लिए कोई कॉग्नेट साइट नहीं हो सकती है। कोर जंगली प्रकार REase के लिए दो कॉग्नेट साइटों के बीच सैंडविच है: अवांछित गतिविधि के लिए एक दरार साइट (काउंटर चयनित अनुक्रम, इस उदाहरण में GGएसएससीसी) और वांछित गतिविधि के लिए एक दरार साइट (चयनित अनुक्रम, उदाहरण में GGएटीसीसी) । पीसीआर में ईएससी की तैयारी का अंतिम चरण 5 के अंत में वांछित गतिविधि के करीब बायोटिन जोड़ता है और विभिन्न प्रकार के काउंटर चयनित दृश्यों (उदाहरण में जीजीएसएससी) बनाता है। चयन रणनीति एक इन विट्रो प्रतिलेखन/अनुवाद/चयन प्रोटोकॉल(चित्रा 1ए)के बाद ईएससी पुनर्प्रवर्धन प्रोटोकॉल में सावधानीपूर्वक डिजाइन किए गए प्राइमर के उपयोग पर निर्भर करती है । ईएससी लाइब्रेरी को इन विट्रो कंपार्टमेंटल ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसक्रिप्शन वाटर-इन-ऑयल पायस9,10,11में व्यक्त किया गया है। प्रत्येक बूंद के भीतर, व्यक्त एंजाइम की विशिष्टता ईएससी(चित्रा 1बी,स्टेप आई) की स्थिति को प्रभावित करती है। वर्णित व्यवस्था के लिए, अनुवादित प्रोटीन की वांछित दरार गतिविधि डीएनए के बायोटिन टैग को हटा देती है लेकिन काउंटर चयनित अनुक्रम के साथ अन्य ईएससी अंत को प्रभावित नहीं करती है। जब पायस टूट जाता है, तो स्ट्रेपेविडिन एफ़िनिटी पुलडाउन द्वारा बायोटिनी के टुकड़ों को हटा दिया जाता है, ताकि वांछित गतिविधि के साथ बूंदों से केवल टुकड़े बने रहें(चित्रा 1बी,चरण II)। यह स्टेप निष्क्रिय रिज़ वेरिएंट को हटा देता है। पुल-डाउन कदम का अलौकिक अंश फिर पीसीआर द्वारा परिलक्षित होता है। पहली पीसीआर प्रतिक्रिया प्राइमर F2 और R1 में इस्तेमाल किया जाता है(चित्रा 1ए, बी,कदम III) । प्राइमर F2 काउंटर चयनित अनुक्रम और अणु अंत के बीच ईएससी अनुभाग को बांधता है। इसलिए, ईएससी उन वेरिएंट को व्यक्त करते हैं जो काउंटर चयनित अनुक्रम को छोड़ने में सक्षम हैं (और इसलिए, प्राइमर एफ 2 और आर 1 के लिए बाध्यकारी साइटों को दो अलग-अलग डीएनए अणुओं में अलग करें) परिलक्षित नहीं होते हैं और इस प्रकार पुस्तकालय से हटा दिए जाते हैं। प्राइमर आर 1 चयनित साइट और ईएससी के मूल के बीच बांधता है ताकि यह चयनित साइट की दरार स्थिति से प्रभावित न हो और वांछित गतिविधि (जीजीएटीसीसी) के लिए दरार साइट को पुनर्स्थापित करे। चक्र एक दूसरी पीसीआर (प्राइमर F1 और R2 के साथ) द्वारा बंद कर दिया गया है जो चयनित साइट के करीब 5 ‘ अंत में बायोटिन जोड़ता है और ईएससी(चित्रा 1बी,चरण IV) के विपरीत छोर के करीब काउंटर चयनित साइट पर डिजाइन किए गए भिन्नता को पुनर्स्थापित करता है। परिणामस्वरूप डीएनए मिश्रण चयन के एक और दौर के लिए तैयार है।
चयन प्रोटोकॉल की सफलता नए, अधिक कठोर लक्ष्य मान्यता अनुक्रम के उचित विकल्प और मुतजेनेसिस रणनीति और इसके प्रभावी कार्यान्वयन के सावधानीपूर्वक डिजाइन पर दृढ़ता से निर्भर करती है। क्योंकि उन्हें दूर करने की तुलना में आरईई की मामूली पहले से मौजूद प्राथमिकताओं में सुधार करना बहुत आसान है, हम किसी भी पहले से मौजूद प्राथमिकताओं के गतिज अध्ययन के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं। सावधान म्यूटाजेनेसिस डिजाइन की आवश्यकता एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय के सीमित आकार से परिणाम देती है जिसे प्रस्तुत प्रोटोकॉल (एक ही प्रयोग में 109 क्लोन) द्वारा संसाधित किया जा सकता है। इसलिए सभी 20 संभव अमीनो एसिड प्रतिस्थापन प्रभावी ढंग से केवल कुछ पदों में परीक्षण किया जा सकता है (चर्चा देखें) । एक वैकल्पिक विधि के रूप में प्रस्तुत त्रुटि-प्रवण पीसीआर (ईपी-पीसीआर) जैसे यादृच्छिक म्यूटाजेनेसिस, मौजूदा जटिलता का गहन अंडरसैंपलिंग करने के लिए नेतृत्व करेंगे। यदि डीएनए के संपर्कों में शामिल संभावित अमीनो एसिड पदों से संबंधित कोई भी जानकारी (या यहां तक कि कॉग्नेट अनुक्रम में पतित न्यूक्लियोटाइड्स के करीब निकटता में स्थित) उपलब्ध है, तो निश्चित रूप से इसका उपयोग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड गाइडेड संतृप्ति म्यूटाजेनेसिस (प्रोटोकॉल चरण 1.6-3.10) के लिए कुछ अमीनो एसिड का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए।
यहां वर्णित चयन प्रोटोकॉल NlaIV8,एक मंदपीडी-(D/E) XK गुना मांयता अनुक्रम है कि केंद्रीय NN ठिकानों के साथ एक palindromic लक्ष्य साइट को पहचानता है और एनएन ठिकानों के बीच एक कुंद अंत कटौती उत्प्रेरक के लिए परीक्षण किया गया था । NlaIV उठाया गया था क्योंकि एनएन ठिकानों के बीच दरार पता चलता है कि इन ठिकानों परिसर में प्रोटीन के करीब हैं । सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अनुक्रम विशिष्ट प्रतिबंध एंनोन्यूस्लीज, मोनोमेरिक या डिमेरिक, किसी भी गुना समूह के लिए किया जा सकता है, किसी भी चौंका देने वाले के डबल स्ट्रैंड ब्रेक को उत्प्रेरित करता है, चाहे उत्प्रेरक और विशिष्ट डोमेन (NlaIV उदाहरण में) मेल खाते हैं या अलग (जैसे, फोकी) हैं। इसके अलावा, सिद्धांत रूप में प्रोटोकॉल न केवल नए, अधिक संकीर्ण एंजाइम विशिष्टता की पीढ़ी के लिए उपयोगी है, बल्कि इसका उपयोग स्टार गतिविधियों को खत्म करने या उच्च निष्ठा एंडोन्यूक्स बनाने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि अभी तक इस सबका परीक्षण नहीं किया गया है। विशेष रूप से, स्टार गतिविधि का लक्षित उन्मूलन जटिल हो सकता है, क्योंकि एक ही अमीनो एसिड अवशेष वांछित और अवांछित ठिकानों के लिए बाध्यकारी में शामिल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो चरण संकुचित विशिष्टताओं के चयन तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन अन्यथा परिवर्तित विशिष्टताओं का चयन करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, तब वैरिएंट एंनोन्यूकलीज के साथ एक समस्या है: यदि सब्सट्रेट्स के स्पेक्ट्रम में माता-पिता के एंनोटुकलीज द्वारा क्लीव ्ड नहीं उपन्यास लक्ष्य शामिल हैं, तो सामान्य रूप से इस गतिविधि के हानिकारक प्रभावों से कोशिकाओं की रक्षा करने का कोई अच्छा तरीका नहीं है। इसके विपरीत, यदि एंनोन्यूलीज विशिष्टता केवल संकुचित है, तो लक्ष्य जंगली प्रकार के लक्ष्यों का सबसेट है, और इसलिए पहले से उपलब्ध कॉग्नेट मिथाइलट्रांसफरेज पूरी तरह से सुरक्षात्मक होना चाहिए।
हमारा प्रोटोकॉल कई निर्देशित विकास प्रोटोकॉल से कई मामलों में अलग है। ओपन रीडिंग फ्रेम विविधता प्रयोग की शुरुआत में एक बार उत्पन्न होती है, हर पुनरावृत्ति में नहीं। इसके अलावा, यह ईपी-पीसीआर के बजाय स्प्लिट-एंड-मिक्स संश्लेषण द्वारा बनाया गया है। कोडन के एनएनएस प्रतिस्थापन के लिए, जैसा कि इस काम में उपयोग किया जाता है, छह पदों के लिए (4 x 4 x 2)6 ~ 1.07 x 109 संयोजन हैं। इसलिए, कोई भी संस्करण ईएससी के 1.7 फ़ोमोल में औसतन एक बार मौजूद होता है। इस क्षमता को 20 ट्रिन्यूक्लियोटाइड अग्रदूतों के मिश्रण के साथ संश्लेषण का उपयोग करके सात पदों पर बढ़ाया जा सकता है जो ग्लेन रिसर्च द्वारा पेश किए जाते हैं या विभाजन और मिश्रण ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के साथ कम आशाजनक पदों में उत्परिवर्तन आवृत्ति को कम करके। यदि संभव हो, तो भिन्नता की सीमा को छह पदों तक सीमित करने की सिफारिश की जाती है। जाहिर है, इस तरह के म्यूटाजेनेसिस लक्ष्यीकरण के बारे में कुछ पहले से मौजूद ज्ञान की आवश्यकता है कम से कम सब्सट्रेट बाध्यकारी में शामिल REase के क्षेत्रों । विविधता पैदा करने के लिए स्प्लिट-एंड-मिक्स प्रोटोकॉल के ईपी-पीसीआर की तुलना में स्पष्ट फायदे हैं । ईपी-पीसीआर का उपयोग करके, हमने एक ही ईपी-पीसीआर(टेबल 4)में एनएलआईवी ईएससी के लिए आठ प्रतिस्थापन ले जाने वाले अपरिवर्तित वेरिएंट और दृश्यों को प्राप्त किया। ईपी-पीसीआर से पुस्तकालय क्लोन का एक पर्याप्त अंश है कि से बचा जाना चाहिए (जंगली प्रकार के दृश्यों, कई प्रतिस्थापन, फ्रेमशिफ्ट और बकवास उत्परिवर्तन, और स्थानों में उत्परिवर्तन अनुक्रम विशिष्टता को प्रभावित करने की संभावना नहीं है) ।
हमारा प्रोटोकॉल दो अनुक्रमिक चयन चरणों की उपस्थिति से कई अन्य निर्देशित विकास प्रोटोकॉल से भी अलग है। सकारात्मक चयन यह सुनिश्चित करता है कि वांछित गतिविधि को बनाए रखा जाए, अन्यथा बायोटिन टैग को हटाया नहीं जाता है, और कोडिंग अनुक्रम को पुल-डाउन द्वारा हटाया जा सकता है। यह तकनीकी रूप से संभव है कि एक उपन्यास का आकस्मिक उद्भव, गैर-ओवरलैपिंग विशिष्टता (उदाहरण के लिए, GCATGC) बायोटिन टैग को भी तोड़ने का कारण बन सकता है, यदि एक उपयुक्त दरार साइट वांछित दरार के पास मौजूद है, लेकिन कहीं और नहीं। हालांकि, यह बहुत संभावना नहीं होनी चाहिए । नकारात्मक चयन खुले पढ़ने के फ्रेम को हटा देता है जो एंजाइमों के लिए कोड करते हैं जिनमें अभी भी अवांछित गतिविधि है। यह कदम कड़ाई से अनिवार्य नहीं है, क्योंकि प्रोटोकॉल अभी भी उन वेरिएंट के साथ आउटपुट लाइब्रेरी को समृद्ध करेगा जो चयन अनुक्रम को क्लीव करने में सक्षम हैं, लेकिन ईएससी में कहीं और क्लीव करने में सक्षम नहीं हैं, इसलिए इसे पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुपयुक्त प्रदान करते हैं। हालांकि, चयन प्रभावशीलता कम होने की उम्मीद है क्योंकि मूल अनुक्रम विशिष्टता वाले एंजाइमों को आउटपुट से नहीं हटाया जाएगा और वे परिवर्तित विशिष्टता के साथ आशाजनक वेरिएंट से आगे निकल जाएंगे लेकिन एंजाइमीय गतिविधि में भी कमी आएगी। ध्यान दें कि जनसंख्या के स्तर पर, वांछित और अवांछित लक्ष्य दृश्य ों दोनों कर सकते हैं, लेकिन होने की जरूरत नहीं है, पतित । NlaIV उदाहरण में, विरोधी लक्ष्य पतित और लक्ष्य गैर पतित था । यहां तक कि जब जनसंख्या के स्तर पर अपक्षय ी होती है, तो एक बूंद में केवल एक (गैर-पतित) लक्ष्य या विरोधी लक्ष्य मौजूद होता है। हमारे प्रोटोकॉल में, लक्ष्य और विरोधी लक्ष्य दृश्यों चयन कदम की हर पुनरावृत्ति पर फिर से शुरू कर रहे हैं । इसलिए, एक खुले पढ़ने के फ्रेम को सभी संभावित लक्ष्यों को छोड़ने में सक्षम एंजाइम को एन्कोड करना चाहिए, और कई चयन दौरों से बचने के लिए किसी भी विरोधी लक्ष्य को क्लीव करने में असमर्थ होना चाहिए। ध्यान दें कि प्रोटोकॉल के प्रत्येक पुनरावृत्ति पर एंटीसेलेक्शन लक्ष्य को फिर से शुरू करने की आवश्यकता दो अनुक्रमिक पीसीआरएस को लागू करती है। पहली पीसीआर एक प्राइमर का उपयोग करती है जो एंटी-टारगेट के बाहर एनियल्स करता है, ताकि एंटी-टारगेट का क्लीवेज पीसीआर रिएक्शन को रोकता है । दूसरी पीसीआर को एक प्राइमर की आवश्यकता होती है जो विरोधी लक्ष्य से परे पहुंचता है, और विरोधी लक्ष्य को फिर से पेश करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि चयन के कई दौरों के दौरान, प्रत्येक ओपन रीडिंग फ्रेम का परीक्षण एंटी-टारगेट के सभी वेरिएंट के खिलाफ किया जाता है।
चिपचिपा सिरों उत्पन्न करने वाले एंजाइमों के लिए, REase ORF10 के अलगाव के लिए पहले वर्णित विधि के आधार पर एक संबंधित वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले बायोटिन कैप्चर द्वारा निष्क्रिय वेरिएंट की कमी को वैकल्पिक प्रोटोकॉल में एक अनुक्रम के साथ संगत एडाप्टर के लिगेशन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है जिसे चयनात्मक पीसीआर(चित्र 9)में प्राइमर बाध्यकारी साइट के रूप में उपयोग किया जाता है। केवल ईएससी जो चयनित विशिष्टता के साथ एंजाइमों का उत्पादन करते हैं, लिगेशन-सक्षम सिरों को उत्पन्न करते हैं और इसलिए इसका चयन किया जाएगा। काउंटर एचुनिंदा अनुक्रम के चिपचिपा अंत के अनुक्रम को इस तरह से डिजाइन किया जाना चाहिए कि यह एडाप्टर के साथ लिगेशन में भाग नहीं ले सकता है। चयन प्रक्रिया का पुनरावृत्ति दो अलग-अलग एडाप्टर के बीच स्विच करके आसानी से हासिल किया जा सकता है और इसके परिणामस्वरूप चयनात्मक पीसीआर में दो अलग-अलग रिवर्स प्राइमर।
नए प्रोटोकॉल के साथ भी, विट्रो में इंजीनियरिंग उपन्यास विशिष्टताओं का कार्य अभी भी बहुत चुनौतीपूर्ण है। विशिष्ट प्रकार II REases के लिए, अनुक्रम विशिष्टता और एंडॉन्यूक्लियोलिटिक गतिविधि एक ही प्रोटीन क्षेत्रों पर निर्भर करती है। इसलिए दूसरे को प्रभावित किए बिना एक को बदलना मुश्किल है । सफलता एक रणनीति है कि खाते में एंजाइम के पदचिह्न लेता है द्वारा और अधिक होने की संभावना है, प्रोटीन-डीएनए बातचीत की समरूपता का संमान करता है, और पहले से मौजूद एंजाइमैटिक वरीयताओं पर बनाता है, जो जैव रासायनिक प्रयोगों में अग्रिम निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में NlaIV उदाहरण8के लिए किया गया था ।
The authors have nothing to disclose.
पोलिश नेशनल साइंस सेंटर (यूएमओ-2011/02/ए/एनजेड1/00052) से विज्ञान एवं उच्च शिक्षा मंत्रालय (0295/बी/पीओ1/2008/34 से एमबी और एन301 100 31/3043 से केएस तक) से अनुदान ों का समर्थन किया गया। UMO-2014/13/B/NZ1/03991 और UMO-2014/14/M/NZ5/00558 से एमबी) और अल्पकालिक EMBO फैलोशिप द्वारा केएस (ATSF 277.00-05) ।
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) | Biosset | 45-1000-050 | Other vendors can be used as well |
ASM-800 DNA/RNA | Biosset | 800-001-000 | |
GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | Any other kit can be used |
Glen-Pak DNA purification cartridge | Glen Research | 60-5200 | |
HIS-Select Nickel Affinity Gel | Sigma | P6611 | |
pET 28a vector | Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead | ||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead |
Porous steel foil | Biosset | 40-063 | |
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit |
Roche | 3 186 148 | |
Restriction endonucleases | Thermo Scientific | Obviously other vendors, enzymes can be used | |
Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma |
Synthesis chemicals including phosphoramidities | Carl Roth | Other vendors can be used as well | |
Synthesis columns (different sizes) | Biosset | ||
T4 DNA ligase | Thermo Scientific | EL0011 | Any other ligase can be used |