Summary
本文提出了利用斑马鱼幼虫模型评价环境污染物神经行为毒性的详细实验方案，包括暴露过程和神经行为指标测试。
Abstract
近年来，越来越多的环境污染物被证明是神经毒性的，特别是在生物的早期发展阶段。斑马鱼幼虫是环境污染物神经行为研究的杰出模型。这里提供了详细的实验方案，用于评估使用斑马鱼幼虫的环境污染物的神经毒性，包括胚胎的采集、暴露过程、神经行为指标、测试过程和数据分析。此外，还讨论了培养环境、暴露过程和实验条件，以确保测定的成功。该方案已应用于精神病药物的开发、环境神经毒性污染物的研究，并可进行优化，进行相应的研究，或有助于力学研究。该协议演示了研究神经行为对斑马鱼幼虫影响的明确操作过程，并可以揭示各种神经毒性物质或污染物的影响。
Introduction
近年来，越来越多的环境污染物被证明为神经毒性1，2，3，4。然而，评估接触环境污染物后体内的神经毒性，不如对内分泌干扰或发育毒性的评估那么容易。此外，及早接触污染物，特别是与环境有关的剂量，在毒性研究5、6、7、8中已引起越来越多的关注。
斑马鱼被确立为一种动物模型，适合在接触环境污染物后的早期发育过程中进行神经毒性研究。斑马鱼是脊椎动物，在受精后比其他物种发育得更快。幼虫不需要喂食，因为幼虫中的营养物质足以维持它们7天的受精后（dpf）9。Larvae从#2 dpf的chorion出来，并发展行为，如游泳和转弯，可以观察到，跟踪，量化和分析自动使用行为工具10，11，12，13开始3-4dpf 14，15，16，17，18。此外，高通量测试也可以通过行为工具实现。因此，斑马鱼幼虫是环境污染物神经行为研究的杰出模型。本文提供了一种利用高通量监测来研究在轻刺激下斑马鱼幼虫的神经行为毒性的协议。
我们的实验室研究了2，2'，4，4'-四溴二苯醚（BDE-47）20，21，6'-羟基/甲氧基-2，2'，4'-四溴二苯醚的神经行为毒性 苯醚（6-OH/MeO-BDE-47）22，使用所提出的协议，使用二苯醚（BDE-209）、铅和商业氯化石蜡23。许多实验室也使用该协议来研究其他污染物对幼虫或成年鱼24、25、26、27的神经行为影响。这种神经行为方案用于帮助提供机械支持，表明低剂量接触双酚A和替代双酚S诱导胚胎斑马鱼过早下丘脑神经发生27。此外，一些研究人员优化了该协议以执行相应的研究。最近的一项研究使用酪蛋白涂层金纳米颗粒（μCas AuNPs）在简单、高通量的斑马鱼模型中消除了淀粉样贝塔（A+）的毒性。研究表明，全身循环中的βCas AuNPs在斑马鱼幼虫血脑屏障和固网内A+42中转移，以非特异性、伴松状的方式引起毒性，行为病理学28支持。
运动、路径角度和社会活动是三种神经行为指标，用于研究斑马鱼幼虫在暴露于污染物后的神经毒性影响。运动是通过幼虫的游泳距离测量的，在接触污染物后可能会损坏。路径角度和社会活动与大脑和中枢神经系统的功能更密切相关。路径角度是指动物运动路径相对于游泳方向30的角度。系统中设置了八个角度等级，从 [-180]-±180°。为了简化比较，根据我们先前的研究21、22，最终结果中的六个类被定义为常规转弯（-10°+0°，0°[10]），平均转弯（-10°+-90°，±10°+90°），以及响应式转弯（-180°~-90°，[90°][90°]）。双鱼社会活动是群体性活动的基本行为;在这里，两个有效幼虫之间的距离为<0.5cm，被定义为社会接触。
这里提出的协议展示了研究对斑马鱼幼虫的神经行为影响的明确过程，并提供了一种揭示各种物质或污染物的神经毒性影响的方法。该协议将有利于研究环境污染物神经毒性的研究人员。
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Protocol
该协议符合同济大学动物伦理委员会批准的准则。
1. 斑马鱼胚胎采集
- 在接触前一天晚上，将两对健康的成年图宾根斑马鱼放入产卵箱，使性别比例保持在1：1。
- 第二天天亮后30-60分钟将成年鱼移回系统。
- 将胚胎从产卵箱中取出。
- 用系统水冲洗胚胎。
- 将胚胎转移到玻璃培养皿（直径9厘米），并有足够的系统水。
- 在显微镜下观察胚胎，选择健康的胚胎供以后接触。
注：健康的胚胎通常是透明的，在显微镜下呈浅金色。不健康的胚胎通常是苍白的，在显微镜下观察到的结块在一起。
2. 暴露前的准备
- 根据斑马鱼书31的指南准备汉克斯的解决方案。
注： 汉克斯的解决方案包括 0.137 M NaCl， 5.4 mM KCl， 0.25 mM Na2HPO4， 0.44 mM KH2PO4， 1.3 mM CaCl2，1.0 mM MgSO4，和 4.2 mM NaHCO3。 - 使用无菌水将汉克斯溶液稀释至 10% 汉克斯溶液。
- 将 1 mL 的 DMSO 添加到 999 mL 的 10% 汉克斯解决方案中，以制造 10% 汉克斯解决方案的控制解决方案，包括 0.1% DMSO。
注： 后续步骤使用 BDE-47 作为暴露解决方案的示例。 - 将5毫克的整洁BDE-47溶解在100%DMSO的1mL中，使标准暴露溶液为5mg/mL。
- 涡旋5mg/mL溶液1分钟，完全溶解DMSO中的BDE-47。
- 将 10 μL 的 5 mg/mL 溶液转移到 12 mL 棕色玻璃瓶中。
- 将灭菌水加入10 mL的最终体积，使BDE-47暴露溶液的浓度为5mg/L，DMSO比为0.1%，然后涡旋1分钟。
- 将 5 mg/L 溶液的 10 μL 和 100 μL 分别转移到两个 100 mL 体积烧瓶中。
- 将 10% 汉克斯溶液（包括 0.1% DMSO（步骤 2.3 中准备）添加到 100 mL，使 BDE-47 暴露溶液的最终浓度分别为 5 μg/L 和 50 μg/L。
- 将溶液转移到100 mL棕色玻璃瓶中，并将其储存在 4°C。
3. 胚胎暴露
- 将 +50 个胚胎转移到三个玻璃培养皿（直径 6 厘米）中，在受精后 3-5 小时 （hpf）。
- 使用 1 mL 移液器尖端将系统水浸在胚胎周围。
- 使用移液器将控制和两个 BDE-47 暴露溶液（控制，5 μg/L，50 μg/L）分别转移到三个玻璃培养皿中。
- 轻轻摇动玻璃培养皿，使胚胎分散在板的底部。
- 将玻璃培养皿放入 28.5 °C 下的光培养箱中。
- 每 24 小时更新一半的暴露溶液，直到 5 dpf。
- 在1 dpf和2 dpf上检查每组死胚胎，并计算死亡率。
- 检查2 dpf和3 dpf上每组孵育的胚胎，并计算孵化能力。
- 每天检查幼虫从幼虫中出来后，并计算每组畸形率。
注：畸形指标包括包周囊肿、脊柱曲率、尾部曲率等32因素。
4. 行为测试的准备
- 准备一个48孔微孔板用于运动和路径角度测试，并准备3个6孔微孔板进行社会活动测试，在5日上午。
- 将 800 μL 的暴露溶液转移到 48 孔微孔板的每个孔中。
注：每组使用16口井（即控制溶液、5 μg/L和50 μg/L组）。 - 使用 1 mL 移液器尖端将 200 μL 的暴露溶液与一个幼虫从玻璃培养皿转移到 48 孔微孔板的一口孔中。
- 将 4 mL 的暴露溶液转移到 6 孔微孔板的每个孔中。
注：每组使用一个6孔微孔板。 - 使用 1 mL 移液器尖端将 200 μL 的暴露溶液与两个幼虫转移到 6 孔微孔板的每个孔中。
注：每个组有六个重复组。 - 在测试前，确保测试室的温度为 28°C 2 小时。
注意：行为测试通常在下午进行。
5. 行为测试
- 运动和路径角度测试
- 单击计算机桌面上的启动器图标以打开控制高通量监控存储模块的软件（参见材料表）以启动程序。
- 选择"跟踪、旋转、路径角度"模块进入操作界面。
- 将步骤 4.3 中准备的 48 孔微孔板移至记录平台，然后拉下盖。
- 依次单击软件中的"文件""生成协议"按钮，开始生成新协议。
- 在"位置计数"位置输入"48"并单击"确定"按钮。
- 依次单击软件中的"参数""协议参数""时间"按钮。将实验持续时间设置为 1 小时和 10 分钟，并将集成周期设置为 60 秒33。
- 绘制检测到的区域。
- 选择椭圆形，并围绕左上角井绘制第一个圆。
- 选择圆圈，依次单击"复制""右上标记""粘贴""选择"按钮，然后使用鼠标将复制的圆圈拖动到右上角。
- 选择圆圈，依次单击"复制""底部标记""粘贴""选择"按钮，然后使用鼠标将复制的圆圈拖动到右下角。
- 依次单击"生成""清除标记"按钮。
注：系统将自动绘制板的其他每个孔。新创建的区域应完美地适应实际鱼类和其在井边的反射之间的每口井。
- 单击"绘制刻度"按钮，在屏幕上绘制一条校准线（对角线路径或平行于微孔板的一侧），输入其长度并设置"单位"。然后单击"应用于分组"按钮。
- 在软件中将动物颜色设置为"黑色"。
- 将检测阈值设置为 16-18，以便检测动物。
- 输入非活动/小和小/大速度，分别为 0.5 厘米/s 和 2.5 厘米/s。
- 设置路径角度类。输入"-90、-30、-10、0、10、30和90"，使路径角度类从-180°-±180°。
- 设置照明条件
- 单击"参数""光驱动""使用以下 3 种触发方法之一"增强刺激"按钮依次设置光况。
- 选择"边缘"按钮，然后设置 10 分钟的黑暗周期，然后三个周期交替 10 分钟明暗周期。
- 保存协议并关闭测试室的指示灯。
- 在系统中使幼虫适应10分钟，然后依次点击"实验""执行"按钮，然后选择保存实验文件的文件夹并输入结果名称。
- 依次单击"背景""开始"按钮以开始测试。
- 单击"实验""停止"按钮，在测试结束时停止实验。
注： 系统显示系统停止时测试的数据。数据包括三个速度等级的跟踪距离和每分钟八个角度等级的路径角度数字。对于所展示的示例中的运动试验，计算了每个光周期（10分钟）的总距离，并比较了对照组与治疗组之间的差异。 - 将48孔微孔板移回光培养箱进行其他实验。
- 社会活动测试
- 单击计算机桌面上的启动器图标以打开控制高通量监控存储模块的软件以启动程序。
- 选择"社交交互"模块进入操作界面。
- 将步骤 4.4 中准备好的 6 孔微孔板（控制组）转移到记录平台，然后拉下盖。
- 依次单击软件中的"文件""生成协议"按钮，开始生成新协议。
- 输入"位置计数"位置中的"6"位置，然后单击"确定"按钮。
- 依次单击软件中的"参数""协议参数""时间"按钮。将实验持续时间设置为 1 小时和 10 分钟，并将集成周期设置为 60 秒。
- 绘制检测到的区域。
- 选择椭圆形，并围绕左上角井绘制第一个圆。
- 选择圆圈，依次单击"复制""右上标记""粘贴""选择"按钮，然后使用鼠标将复制的圆圈拖动到右上角。
- 选择圆圈，依次单击"复制""底部标记""粘贴""选择"按钮，然后使用鼠标将复制的圆圈拖动到右下角。
- 依次单击"生成""清除标记"按钮。
注：新创建的区域应完美地适合每个井，在实际幼虫和其在井侧的反射之间。
- 单击"绘制刻度"按钮，在屏幕上绘制一条校准线（对角线路径或平行于微孔板的一侧），输入其长度并设置"单位"。然后单击"应用于分组"按钮。
- 将检测阈值设置为 16-18，以便检测动物。
- 单击软件中的"黑动物"按钮。
- 选择"距离阈值"按钮并输入软件中的"5"。
- 设置光条件。
- 单击"参数""光驱动""使用以下 3 种触发方法之一"增强刺激"按钮依次设置光况。
- 选择"边缘"按钮，然后设置 10 分钟的黑暗周期，然后三个周期交替 10 分钟明暗周期。
- 保存协议并关闭房间的光线。
- 在系统中使幼虫适应10分钟，然后依次点击"实验""执行"按钮，然后选择保存实验文件的文件夹并输入结果名称。
- 依次单击"背景""开始"按钮以开始测试。
- 单击"实验""停止"按钮，在测试结束时停止软件中的实验。
注： 系统显示系统停止时测试的数据。 - 将6孔微孔板（对照组）移回光培养箱进行其他实验。
- 将 6 孔微孔板（5 μg/L 和 50 μg/L 组）依次转移到记录平台，按号号重复从 5.2.4 到 5.2.17 的步骤。
6. 数据分析
- 在运动和路径角度结果中打开电子表格文件。
- 选择三个距离列（不法主义者、斯姆迪斯特、拉迪斯特），然后把它们加起来。
注：非动态、斯拉姆迪斯特和幼虫的数据分别表示系统在不同速度等级（非活动/小/大）中记录的不同距离。 - 每10分钟的光周期总结每口井的距离，计算16口井的平均距离，并比较光刺激下三组的数据。
- 每10分钟的光周期依次总结从cl01到cl08每个光持续时间中每口井的角度数，并比较光刺激下三组的数据。
注：从 cl01到cl08的列的数据分别表示系统以不同的路径角度记录不同的路径角度数。 - 在社交活动结果中打开电子表格文件。
- 选择连续柱和连续柱，每 10 分钟光周期总结每个井的社交时间及其持续时间。
- 计算每个光持续时间中一组的平均社交时间和持续时间，并比较光刺激下三组的数据。
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Representative Results
在这里，我们描述了一个协议，用于研究在光刺激下使用斑马鱼幼虫的环境污染物的神经行为效应。在简介中定义了运动、路径角度和社交活动测试。运动和路径角度测试中微板的设置以及软件的图像如下所示。此外，我们自己的研究结果作为例子。两项研究提出了暴露于BDE-47和6-OH/MeO-BDE-47后的运动和路径角度效应。第三项研究介绍了四种商用氯化石蜡对社会行为的影响。
在运动和路径角度测试中设置48孔微孔板和幼虫的运动轨迹。
协议使用了三组，包括一个对照组和两个治疗组。由于每组可以有16只动物，该系统可用于在一个微孔板中执行运动和路径角度的高通量测试。图1显示了一个使用控制溶液处理的幼虫，第一、中、后两行每口井分别有5μg/L溶液和50μg/L溶液。
图1还显示了在运动和路径角度测试中幼虫的所有运动位点。该系统跟踪幼虫的运动，并计算不同速度等级的游泳距离。系统计算了不同路径角度等级的幼虫的路径角度数。研究人员可以用自己的方式分析系统记录的数据。
图1：在运动和路径角度测试中设置48孔微孔板和幼虫的运动位点。A1-A8、B1-B8 = 控制组;C1-C8、D1-D8 = 5 μg/L 组;E1-E8、F1-F8 = 50 μg/L 组。黑色跟踪线表示不活动或小运动;绿色跟踪线表示正常运动;红色跟踪线表示大运动。请点击此处查看此图的较大版本。
6孔微板在社会活动测试中。
图2显示了社会活动测试过程中的6孔微孔板。每口井都有两只幼虫，系统记录整个测试过程中两只幼虫之间的距离。系统在设定的测试时间内（此协议中为 1 分钟）记录了社交活动数和持续时间。
图2：6孔微板在社会活动测试中。每口井都有两只幼虫。黄线表示两种动物之间的距离为<0.5厘米;红线表示两只动物之间的距离为>0.5厘米。请点击此处查看此图的较大版本。
BDE-47接触影响斑马鱼幼虫在5dpf的loco运动。
如图3所示，BDE-47的最高浓度组在黑暗时期产生明显的低活性。然而，在光照期间，由于BDE-47的曝光，没有观察到的变化。
图3：BDE-47暴露对幼虫斑马鱼在5dpf处运动的影响。在黑暗和光交替的周期中记录运动（以厘米为单位的距离移动距离），总持续时间为70分钟。 底部的实心和开杆分别表示黑暗期和光期。数据以平均值 = SEM 表示（与对照组相比，*p < 0.05）。这个数字已被修改从赵等人17许可。请点击此处查看此图的较大版本。
6-OH/MeO-BDE-47暴露影响斑马鱼幼虫在5dpf的路径角度。
如图4所示，6-OH-BDE-47的高浓度组在5 dpf时执行较少的常规转弯和平均转弯。然而，6-MeO-BDE-47暴露组诱导反应更灵敏的转弯。
图4：6-OH/MeO-BDE-47对黑暗时期幼虫斑马鱼路径角的影响。数据以平均值 = SEM 表示（与控制值相比，*p < 0.05）。这个数字已被修改从张等人18许可。请点击此处查看此图的较大版本。
CPs接触影响斑马鱼幼虫在5dpf的社会活动。
如图5所示，斑马鱼幼虫的社会行为受到三种CP产品的影响。CP-70和短链CP-52b刺激了社会活动。长链CP-52a缩短了幼虫每次接触的持续时间。
图5：不同光/暗时期，CPs对每位接触者平均社交持续时间的影响。（A） CP-42， （B） CP-52a， （C） CP-52b， （D） CP-70.数据以平均值 = SEM 显示（与控件相比，p < 0.05）。经许可，这一数字已由杨等人19日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这项工作提供了一个详细的实验方案，以评估使用斑马鱼幼虫的环境污染物的神经毒性。斑马鱼在接触期间经历了从胚胎到幼虫的过程，这意味着对胚胎和幼虫的精心护理至关重要。任何影响胚胎和幼虫发育的东西都会影响最终结果。本文讨论了培养环境、暴露过程和实验条件，以确保整个测定的成功。
在养殖环境中，斑马鱼胚胎和幼虫生活在+28°C的稳定温度下。在这项工作中，一个光培养箱，可以自动设置光条件，并保持温度稳定用于容纳胚胎和幼虫。胚胎不会从1 dpf和2 dpf的胆囊中出来，因此在更新暴露溶液时应小心避免损坏未孵化的胚胎。此外，溶液中的DMSO比例应低于0.1%34，35，新的暴露溶液在用于更新之前应处于28°C。
在暴露前选择胚胎的过程也是实验成功的关键因素。为每个组同时发育的健康胚胎选择，保证了毒性评估的准确性。斑马鱼在受精后的头7天内可以不进食，因此最好在整个暴露期间不要喂养胚胎或幼虫，因为食物会影响最终结果。此外，最好在需要时新鲜准备曝光溶液。
在行为测试期间，必须为幼虫提供足够的时间来适应高通量监控机柜的环境。在测试之前，应仔细检查测试协议的每个步骤，包括光照条件、测试时间等。测试室应保持完全安静和黑暗，以免打扰动物。
提出的方案为研究环境污染物的神经行为毒性提供了基本框架。研究神经行为影响时，也有其他类型的行为，如颜色偏好测试36，底部居住测试37，光/暗偏好测试38，39等。然而，这些测试主要使用成人斑马鱼，它们不适合高通量测试。此外，Weichert等人对自发尾部运动的行为进行了录像，在24小时接触40小时后就可以量化。神经行为毒性评价还包括对大脑和中枢神经系统功能的机制研究。基本的神经行为指标在这里介绍，并可以形成使用其他行为工具更复杂的指标的基础。最终，新的神经行为指标的发展与这项研究机制可以用于未来的研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢国家自然科学基金（21876135和21876136），中国国家重大科技项目（2017ZX07502003-03，2018ZX7701001-22），教育部-上海基金会的资助。儿童环境卫生重点实验室（CEH201807-5）和瑞典研究理事会（第639-2013-6913号）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
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