Summary

Studere neurobehavioral effekter av miljøforurensende stoffer på sebrafisk larver

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

En detaljert eksperimentell protokoll presenteres i dette papiret for evaluering av nevroatferdstoksisitet av miljøgifter ved hjelp av en sebrafisk larvermodell, inkludert eksponeringsprosessen og tester for nevroatferdsindikatorer.

Abstract

De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk, spesielt i de tidlige utviklingsstadiene av organismer. Sebrafisk larver er en fremtredende modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter. Her er det gitt en detaljert eksperimentell protokoll for evaluering av nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver, inkludert samlingen av embryoene, eksponeringsprosessen, nevroatferdsindikatorer, testprosessen og dataanalyse. Også kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold diskuteres for å sikre analysens suksess. Protokollen har blitt brukt i utviklingen av psykopatiske legemidler, forskning på miljømessige nevrotoksiske forurensende stoffer, og kan optimaliseres for å gjøre tilsvarende studier eller være nyttig for mekanistiske studier. Protokollen demonstrerer en klar operasjonsprosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisklarver og kan avsløre effekten av ulike nevrotoksiske stoffer eller forurensende stoffer.

Introduction

De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk1,2,3,4. Vurderingen av nevrotoksisitet in vivo etter eksponering for miljøgifter er imidlertid ikke så lett som endokrinforstyrrelse eller utviklingstoksisitet. I tillegg har tidlig eksponering for forurensende stoffer, spesielt ved miljørelevante doser, tiltrukket seg økende oppmerksomhet itoksisitetsstudier5,6,7,8.

Sebrafisk etableres som en dyremodell som passer for nevrotoksisitetsstudier under tidlig utvikling etter eksponering for miljøgifter. Sebrafisk er virveldyr som utvikler seg raskere enn andre arter etter befruktning. Larvene trenger ikke å bli matet fordi næringsstoffene i koret er nok til å opprettholde dem i 7 dager etterfertilisering (dpf)9. Larver kommer ut fra koret på ~ 2 dpf og utvikle atferd som svømming og snu som kan observeres, spores, kvantifiseres, og analyseres automatisk ved hjelp av atferdsinstrumenter10,11,12,13 starter på 3-4 dpf14,15,16,17,18. I tillegg kan tester med høy gjennomstrømning også realiseres av atferdsinstrumenter. Sebrafisk larver er dermed en enestående modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter19. Her tilbys en protokoll ved hjelp av høy gjennomstrømningsovervåking for å studere nevroatferdstoksisiteten til miljøgifter på sebrafisklarver under lette stimuli.

Vårt laboratorium har studert nevroatferdstoksisiteten til 2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl eter (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/ Methoxy-2,2′,4,4′-tetrabro modiphenyl eter (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-brominert diphenyl eter (BDE-209), bly, og kommersielle klorerte parafiner23 ved hjelp av den presenterte protokollen. Mange laboratorier bruker også protokollen til å studere de nevroatferdsmessige effektene av andre forurensende stoffer på larver eller voksen fisk24,25,26,27. Denne neurobehavioral protokollen ble brukt til å gi mekanistisk støtte som viser at lavdose eksponering for bisfenol A og erstatning bisfenol S indusert for tidlig hypothalamus nevrogenese i embryonale sebrafisk27. I tillegg optimaliserte noen forskere protokollen for å utføre tilsvarende studier. En fersk studie eliminert toksisitet av amyloid beta (Aβ) i en enkel, høy gjennomstrømning sebrafisk modell ved hjelp av kasein-belagt gull nanopartikler (βCas AuNPs). Det viste at βCas AuNPs i systemisk sirkulasjon translocated over blod-hjernebarrieren av sebrafisk larver og sequestered intracerebral Aβ42, eliciting toksisitet på en uspesifikk, chaperone-lignende måte, som ble støttet av atferdspatologi28.

Bevegelse, banevinkel og sosial aktivitet er tre nevroatferdsindikatorer som brukes til å studere nevrotoksisitetseffektene av sebrafisklarver etter eksponering for forurensende stoffer i den presenterte protokollen. Bevegelse måles ved svømmeavstand av larver og kan bli skadet etter eksponering for forurensende stoffer. Banevinkel og sosial aktivitet er tettere knyttet til hjernens funksjon og sentralnervesystemet29. Banevinkelen refererer til vinkelen på banen til dyrebevegelse i forhold til svømmeretningen30. Åtte vinkelklasser fra ~-180°-~+180° er angitt i systemet. For å forenkle sammenligningen defineres seks klasser i det endelige resultatet som rutinemessige svinger (-10° ~0°, 0° ~+10°), gjennomsnittlige svinger (-10° ~-90°, +10° ~+90°), og responsive svinger (-180° ~-90°, +90° ~+180°) i henhold til våre tidligere studier21,22. To-fisk sosial aktivitet er grunnleggende for gruppe shoaling atferd; her er en avstand på < 0,5 cm mellom to larver gyldig definert som sosial kontakt.

Protokollen som presenteres her viser en klar prosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisk larver og gir en måte å avsløre nevrotoksisitetseffektene av ulike stoffer eller forurensende stoffer. Protokollen vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere nevrotoksisiteten til miljøgifter.

Protocol

Protokollen er i samsvar med retningslinjer godkjent av Dyreetikkkomiteen ved Tongji Universitet. 1. Sebrafisk embryo samling Sett to par sunn voksen Tubingen sebrafisk inn i gyteboksen på natten før eksponering, og hold sexforholdet på 1:1. Fjern den voksne fisken tilbake til systemet 30-60 min etter dagslys neste morgen. Fjern embryoene ut av gyteboksen. Skyll embryoene med systemvann. Overfør embryoene til en glass Petriskål (9 cm diame…

Representative Results

Her beskriver vi en protokoll for å studere de nevroatferdsmessige effektene av miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver under lette stimuli. Bevegelses-, banevinkel- og sosiale aktivitetstester defineres i innledningen. Oppsettet av mikroplatene i bevegelses- og banevinkeltestene og bildene av programvaren vises nedenfor. I tillegg presenteres våre egne forskningsresultater som eksempler. To studier presenterer bevegelses- og banevinkeleffektene etter eksponering for BDE-47 og 6-OH/Me…

Discussion

Dette arbeidet gir en detaljert eksperimentell protokoll for å evaluere nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver. Sebrafisk går gjennom prosessen fra embryoer til larver i eksponeringsperioden, noe som betyr at god omsorg for embryoer og larver er avgjørende. Alt som påvirker utviklingen av embryoer og larver kan påvirke sluttresultatet. Her diskuteres kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold for å sikre at hele analysen lykkes.

For kulturmi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlige for den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (21876135 og 21876136), National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Stiftelsen av MOE-Shanghai Hovedlaboratorium for barns miljøhelse (CEH201807-5) og Svensk forskningsråd (nr. 639-2013-6913).

Materials

48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

View Video