En detaljert eksperimentell protokoll presenteres i dette papiret for evaluering av nevroatferdstoksisitet av miljøgifter ved hjelp av en sebrafisk larvermodell, inkludert eksponeringsprosessen og tester for nevroatferdsindikatorer.
De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk, spesielt i de tidlige utviklingsstadiene av organismer. Sebrafisk larver er en fremtredende modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter. Her er det gitt en detaljert eksperimentell protokoll for evaluering av nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver, inkludert samlingen av embryoene, eksponeringsprosessen, nevroatferdsindikatorer, testprosessen og dataanalyse. Også kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold diskuteres for å sikre analysens suksess. Protokollen har blitt brukt i utviklingen av psykopatiske legemidler, forskning på miljømessige nevrotoksiske forurensende stoffer, og kan optimaliseres for å gjøre tilsvarende studier eller være nyttig for mekanistiske studier. Protokollen demonstrerer en klar operasjonsprosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisklarver og kan avsløre effekten av ulike nevrotoksiske stoffer eller forurensende stoffer.
De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk1,2,3,4. Vurderingen av nevrotoksisitet in vivo etter eksponering for miljøgifter er imidlertid ikke så lett som endokrinforstyrrelse eller utviklingstoksisitet. I tillegg har tidlig eksponering for forurensende stoffer, spesielt ved miljørelevante doser, tiltrukket seg økende oppmerksomhet itoksisitetsstudier5,6,7,8.
Sebrafisk etableres som en dyremodell som passer for nevrotoksisitetsstudier under tidlig utvikling etter eksponering for miljøgifter. Sebrafisk er virveldyr som utvikler seg raskere enn andre arter etter befruktning. Larvene trenger ikke å bli matet fordi næringsstoffene i koret er nok til å opprettholde dem i 7 dager etterfertilisering (dpf)9. Larver kommer ut fra koret på ~ 2 dpf og utvikle atferd som svømming og snu som kan observeres, spores, kvantifiseres, og analyseres automatisk ved hjelp av atferdsinstrumenter10,11,12,13 starter på 3-4 dpf14,15,16,17,18. I tillegg kan tester med høy gjennomstrømning også realiseres av atferdsinstrumenter. Sebrafisk larver er dermed en enestående modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter19. Her tilbys en protokoll ved hjelp av høy gjennomstrømningsovervåking for å studere nevroatferdstoksisiteten til miljøgifter på sebrafisklarver under lette stimuli.
Vårt laboratorium har studert nevroatferdstoksisiteten til 2,2′,4,4′-tetrabromodiphenyl eter (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/ Methoxy-2,2′,4,4′-tetrabro modiphenyl eter (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-brominert diphenyl eter (BDE-209), bly, og kommersielle klorerte parafiner23 ved hjelp av den presenterte protokollen. Mange laboratorier bruker også protokollen til å studere de nevroatferdsmessige effektene av andre forurensende stoffer på larver eller voksen fisk24,25,26,27. Denne neurobehavioral protokollen ble brukt til å gi mekanistisk støtte som viser at lavdose eksponering for bisfenol A og erstatning bisfenol S indusert for tidlig hypothalamus nevrogenese i embryonale sebrafisk27. I tillegg optimaliserte noen forskere protokollen for å utføre tilsvarende studier. En fersk studie eliminert toksisitet av amyloid beta (Aβ) i en enkel, høy gjennomstrømning sebrafisk modell ved hjelp av kasein-belagt gull nanopartikler (βCas AuNPs). Det viste at βCas AuNPs i systemisk sirkulasjon translocated over blod-hjernebarrieren av sebrafisk larver og sequestered intracerebral Aβ42, eliciting toksisitet på en uspesifikk, chaperone-lignende måte, som ble støttet av atferdspatologi28.
Bevegelse, banevinkel og sosial aktivitet er tre nevroatferdsindikatorer som brukes til å studere nevrotoksisitetseffektene av sebrafisklarver etter eksponering for forurensende stoffer i den presenterte protokollen. Bevegelse måles ved svømmeavstand av larver og kan bli skadet etter eksponering for forurensende stoffer. Banevinkel og sosial aktivitet er tettere knyttet til hjernens funksjon og sentralnervesystemet29. Banevinkelen refererer til vinkelen på banen til dyrebevegelse i forhold til svømmeretningen30. Åtte vinkelklasser fra ~-180°-~+180° er angitt i systemet. For å forenkle sammenligningen defineres seks klasser i det endelige resultatet som rutinemessige svinger (-10° ~0°, 0° ~+10°), gjennomsnittlige svinger (-10° ~-90°, +10° ~+90°), og responsive svinger (-180° ~-90°, +90° ~+180°) i henhold til våre tidligere studier21,22. To-fisk sosial aktivitet er grunnleggende for gruppe shoaling atferd; her er en avstand på < 0,5 cm mellom to larver gyldig definert som sosial kontakt.
Protokollen som presenteres her viser en klar prosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisk larver og gir en måte å avsløre nevrotoksisitetseffektene av ulike stoffer eller forurensende stoffer. Protokollen vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere nevrotoksisiteten til miljøgifter.
Dette arbeidet gir en detaljert eksperimentell protokoll for å evaluere nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver. Sebrafisk går gjennom prosessen fra embryoer til larver i eksponeringsperioden, noe som betyr at god omsorg for embryoer og larver er avgjørende. Alt som påvirker utviklingen av embryoer og larver kan påvirke sluttresultatet. Her diskuteres kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold for å sikre at hele analysen lykkes.
For kulturmi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (21876135 og 21876136), National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Stiftelsen av MOE-Shanghai Hovedlaboratorium for barns miljøhelse (CEH201807-5) og Svensk forskningsråd (nr. 639-2013-6913).
48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |