Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

לימוד השפעות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגי הזאב

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60818
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2,4, 2,4
1State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling, WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

Summary

פרוטוקול ניסיוני מפורט מוצג במאמר זה להערכת רעילות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים באמצעות מודל הזחלים דג זברה, כולל תהליך החשיפה ובדיקות אינדיקטורים נוירוהתנהגותית.

Abstract

השנים האחרונות יותר ויותר מזהמים סביבתיים הוכחו נוירוטוקסינים, במיוחד בשלבי הפיתוח המוקדמים של אורגניזמים. הזחלים מדגים הם מודל בראש המחקר הנוירותנהגותי של מזהמים סביבתיים. כאן, פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק להערכת רעילות נוירומזהמים סביבתיים באמצעות הזחלים דג זברה, כולל אוסף של העוברים, תהליך החשיפה, אינדיקטורים נוירוהתנהגותית, תהליך הבדיקה, ו . ניתוח נתונים כמו כן, הסביבה התרבותית, תהליך החשיפה והתנאים הניסיוניים נדונים על מנת להבטיח את הצלחת התהליך. הפרוטוקול נעשה שימוש בפיתוח של תרופות פסיכוסטיות, מחקר על מזהמים עצביים סביבתיים, והוא יכול להיות ממוטב כדי לבצע מחקרים מתאימים או להועיל למחקרים מכניסטיים. הפרוטוקול ממחיש תהליך פעולה ברור לחקר השפעות נוירוהתנהגותיות על הזחלים דג זברה יכול לחשוף את ההשפעות של חומרים נוירורעילים שונים או מזהמים.

Introduction

בשנים האחרונות יותר ויותר מזהמים סביבתיים הוכחונוירוטוקסי1,2,3,4. עם זאת, הערכה של רעילות נוירוvivo לאחר החשיפה למזהמים סביבתיים אינו קל כמו זה של הפרעה אנדוקרינית או רעילות התפתחותית. בנוסף, חשיפה מוקדמת למזהמים, בעיקר במינונים הרלוונטיים לסביבה, משכה תשומת לב גוברת ללימודי רעילות5,6,7,8.

Zebrafish הוא הוקם כמודל בעלי חיים עבור מחקרים נוירורעילות במהלך ההתפתחות המוקדמת לאחר חשיפה למזהמים סביבתיים. דג הזבראפיש הינו החוליות המתפתחות מהר יותר ממינים אחרים לאחר ההפריה. הזחלים לא צריכים להיות מוזנים כי החומרים המזינים ב chorion הם מספיק לקיים אותם 7 ימים הפריה (dpf)9. הזחלים יוצאים מן chorion ב ~ 2 dpf ולפתח התנהגויות כגון שחייה והפעלה כי ניתן לצפות, מעקב, כימות, וניתח באופן אוטומטי באמצעות כלי התנהגות10,11,12,13 החל ב 3-4 dpf14,15,16,17,18. בנוסף, ניתן להבין בדיקות תפוקה גבוהה גם באמצעות כלי התנהגות. לפיכך, הזחלים דג זברה הם מודל מצטיין לחקר נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים19. כאן, פרוטוקול מוצע באמצעות ניטור תפוקה גבוהה כדי לחקור את הרעילות נוירולוגית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגים תחת גירויים אור.

המעבדה שלנו למדה רעילות נוירוהתנהגותית של 2, 2 ', 4, 4 '-tetrabromodiphenyl אתר (bde-47)20,21, 6 '-הידרוxy/מתקסי-2, 2 ', 4, 4 '-טטרארומאודיפנאל אתר (6-הו/מיאו-bde-47)22, deca-ברומיד diפניאיל אתר (bde-209), עופרת, ומסחרי כלוריד קבוקים23 באמצעות הפרוטוקול המוצג. מעבדות רבות משתמשות גם בפרוטוקול כדי ללמוד את ההשפעות הנוירותנהגותיות של מזהמים אחרים על הזחלים או דגים מבוגרים24,25,26,27. זה פרוטוקול נוירו התנהגותי שימש כדי לסייע לספק תמיכה מכניסטית מראה כי חשיפה במינון נמוך כדי בינתנול A והחלפת בינול המושרה מוקדם היפותלמי נוירוגנזה ב דג זברה העובריים27. בנוסף, חלק מהחוקרים ממוטבים את הפרוטוקול לביצוע מחקרים תואמים. מחקר שנערך לאחרונה ביטלה את הרעילות של ביתא עמילואיד (Aβ) במודל קל, תפוקה גבוהה מודל דג זברה באמצעות מצופה קזאין חלקיקי זהב (βCas אונפס). זה הראה כי βCas אונפס במחזור מערכתי ממוקם על פני מחסום הדם-מוח של הזחלים דג זברה ו מגרם aβ 42, מעורר רעילות באופן לא ספציפי, כמו המלווה, אשר נתמך על ידי פתולוגיה התנהגותית28.

תנועה, זווית הנתיב, והפעילות החברתית הם שלושה אינדיקטורים נוירוהתנהגותית המשמשים לחקר ההשפעות הנוירורעילות של הזחלים דג זברה לאחר חשיפה מזהמים בפרוטוקול המוצג. תנועה נמדד על-ידי המרחק השוחה של הזחלים ועלול להינזק לאחר חשיפה למזהמים מזהמים. זווית הנתיב והפעילות החברתית קשורים קשר הדוק יותר לתפקוד המוח ומערכת העצבים המרכזית29. זווית השביל מתייחסת לזווית הדרך של התנועה בעלי חיים ביחס לכיוון השחייה30. שמונה מחלקות זווית מ ~-180 °-~ + 180 ° מוגדרות במערכת. כדי לפשט את ההשוואה, שישה שיעורים בתוצאה הסופית מוגדרים כתורים שגרתיים ( -10 ° ~ 0 °, 0 ° ~ + 10 °), ממוצע פונה ( -10 ° ~-90 °, + 10 ° ~ + 90 °), והפניות מגיבות (-180 ° ~-90 °, + 90 ° ~ + 180 °) על פי המחקרים הקודמים שלנו21 הפעילות החברתית של שני הדגים היא בסיסית של התנהגות משוצבת הקבוצה; כאן מרחק של < 0.5 ס מ בין שני הזחלים התקפים מוגדר כאיש קשר חברתי.

הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש תהליך ברור לחקר השפעות נוירוהתנהגותיות על הזחלים דג זברה ומספק דרך לחשוף את ההשפעות הנוירורעילות של חומרים שונים או מזהמים. הפרוטוקול יועיל לחוקרים המעוניינים ללמוד את הרעילות העצבית של מזהמים סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הוא בהתאם להנחיות שאושרו על-ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת טונגג'י.

1. אוסף העובר של דג זברבפיש

  1. הכניסו שני זוגות של מבוגרים בריאים, שהיו בתוך תיבת השאיפה בלילה לפני החשיפה, ושמרו על יחס המין ב-1:1.
  2. להסיר את הדג המבוגר בחזרה למערכת 30-60 דקות אחרי אור היום למחרת בבוקר.
  3. הסר את העוברים מתוך תיבת ההשריץ.
  4. שטפו את העוברים במים מערכת.
  5. להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי זכוכית (9 ס"מ קוטר) עם מספיק מים במערכת.
  6. צפו בעוברים שמתחת למיקרוסקופ ובחרו עוברים בריאים לחשיפה מאוחרת יותר.
    הערה: עוברים בריאים הם בדרך כלל שקופים עם צבע זהוב בהיר מתחת למיקרוסקופ. העוברים בריאים בדרך כלל חיוורים ומצופפים יחד כפי שנצפו מתחת למיקרוסקופ.

2. הכנה לפני חשיפה

  1. הכינו את הפיתרון של הנקס לפי ההנחיות של ספר31.
    הערה: הפתרון של הנקס כולל 0.137 M הנאל, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2hpo4, 0.44 mM KH2פו4, 1.3 Mm Cacl2, 1.0 Mm mgso4, ו 4.2 mm נחקו3.
  2. לדלל את הפתרון של הנקס לפתרון 10% הנקס באמצעות מים סטריליים.
  3. Add 1 mL של DMSO לתוך 999 mL של 10% הנקס פתרון לעשות פתרון שליטה של 10% הנקס פתרון כולל 0.1% DMSO.
    הערה: השלבים הבאים משתמשים ב-BDE-47 כדוגמה לפתרון חשיפה.
  4. לפזר 5 מ ג מסודר BDE-47 ב 1 מ ל של 100% DMSO כדי ליצור פתרון חשיפה סטנדרטית של 5 מ"ג/mL.
  5. מערבולת הפתרון 5 מ"ג/mL עבור 1 דקות כדי לפזר לחלוטין את BDE-47 ב DMSO.
  6. העבר 10 μL של הפתרון 5 מ"ג/mL לבקבוק זכוכית חום 12 mL.
  7. הוסף מים מעוקר לנפח הסופי של 10 מ ל כדי להפוך את הריכוז של BDE-47 פתרון חשיפה 5 מ"ג/L ו DMSO יחס ב 0.1%, ואז מערבולת עבור 1 דקות.
  8. העברה 10 μL ו-100 μL של 5 מ"ג/L פתרון לתוך מבחנות נפח 2 100 mL בהתאמה.
  9. הוסף 10% הנקס פתרון כולל 0.1% DMSO (מוכן בשלב 2.3) כדי 100 mL כדי להפוך את הריכוזים הסופיים של BDE-47 פתרונות חשיפה 5 μg/L ו-50 μg/L, בהתאמה.
  10. העבר את הפתרונות לבקבוקי זכוכית בראון 100 mL ואחסן אותם ב -4 ° c.

3. חשיפת עוברים

  1. העברת ~ 50 עוברים לתוך כל אחת משלוש מנות פטרי (6 ס"מ קוטר) 3-5 שעות הפריה פוסט (hpf).
  2. השתמש בקצה הצינורות 1 מ"ל כדי למחוק את מי המערכת סביב העוברים.
  3. השתמש בפיפטה כדי להעביר את השליטה ושתי פתרונות חשיפה BDE-47 (שליטה, 5 μg/L, 50 μg/L) לתוך שלוש מנות פטרי מזכוכית, בהתאמה.
  4. לנער את הזכוכית מנות פטרי בעדינות אחד אחד כדי לגרום לעוברים להתפזר בתחתית הצלחת.
  5. שימו את הזכוכית מנות פטרי לתוך החממה הקלה מתחת 28.5 ° c.
  6. לחדש את המחצית של פתרונות החשיפה כל 24 h עד 5 dpf.
  7. בדוק את העוברים המתים של כל קבוצה ב-1 dpf ו 2 dpf ולחשב את שיעור התמותה.
  8. בדוק את העוברים המדמדניים של כל קבוצה על 2 dpf ו-3 dpf ולחשב את הצאצאים.
  9. לבדוק את העיוות של הזחלים כל יום לאחר שהם יוצאים מן chorion ולחשב את שיעור העיוות של כל קבוצה.
    הערה: מחווני עיוות כוללים ציסטה בחיוג, עקמומיות השדרה, עקמומיות זנב, בין השאר גורמים32.

4. הכנה למבחן ההתנהגות

  1. הכינו 48 היטב אימונולוגיה עבור בדיקת זווית הנתיב תנועה ושלושה 6 מיקרופלטות היטב עבור בדיקת פעילות חברתית בבוקר של 5 dpf.
  2. העברת 800 μL של פתרון חשיפה לתוך כל טוב של 48 מיקרוצלחת הטוב.
    הערה: השתמש 16 בארות עבור כל קבוצה (כלומר, פתרון הבקרה, 5 μg/L, ו-50 μg/L הקבוצה).
  3. השתמש בעצה אחת מ-mL כדי להעביר 200 μL של פתרון חשיפה עם זחל אחד מן הזכוכית צלחת פטרי לתוך הבאר אחד של 48 מיקרוצלחת היטב.
  4. העברה 4 מ ל של פתרון חשיפה לתוך כל טוב של 6 מיקרופלייט היטב.
    הערה: השתמש ב-6 מיקרופלייט היטב עבור כל קבוצה.
  5. השתמש בעצה אחת מ-mL כדי להעביר 200 μL של פתרון חשיפה עם שני הזחלים לתוך כל טוב של 6 מיקרוצלחת היטב.
    הערה: לכל קבוצה יש שש קבוצות חוזרות.
  6. ודא שטמפרטורת חדר הבחינה היא 28 ° צ' 2 h לפני המבחן.
    הערה: הבדיקות ההתנהגותית מתבצעות בדרך כלל אחר הצהריים.

5. מבחן התנהגותי

  1. תנועה וזווית מבחן
    1. לחץ על סמל משגר בשולחן המחשב כדי לפתוח את התוכנה (ראה טבלת חומרים) השולטת במארז ניטור התפוקה הגבוהה כדי להפעיל את התוכנית.
    2. בחר את המודול "מעקב, סיבובים, זוויות נתיב" כדי להיכנס לממשק ההפעלה.
    3. העבר את מיקרוצלחת 48 היטב מוכן בשלב 4.3 לפלטפורמת ההקלטה ומשוך את המכסה.
    4. לחץ על "קובץ" לחצן "צור פרוטוקול" בתורו של התוכנה כדי להתחיל ליצור פרוטוקול חדש.
    5. קלט "48" במיקום "ספירת מיקום" ולחץ על "אישור" כפתור.
    6. לחץעל "פרמטרים" פרמטרים "הפרוטוקול" "זמן" כפתור בתורו את התוכנה. הגדר את משך הניסוי עבור 1 h ו-10 דקות והגדר את תקופת האינטגרציה ל-60 s33.
    7. צייר את האזורים שזוהו.
      1. בחר את הצורה האליפטית וצייר את העיגול הראשון מסביב לראש הראשון שמאלה.
      2. בחר את המעגל, לחץ על "העתק" לחצן "הדבק"מימין"להדביק" "בחר" כפתור בתורו, ולהשתמש בעכבר כדי לגרור את המעגל המועתק למעלה בסדר הנכון.
      3. בחר את המעגל, לחץ על "העתק" "מארק התחתון" "הדבק" "לבחור" כפתור בתורו, ולהשתמש בעכבר כדי לגרור את המעגל המועתק למטה בסדר הנכון.
      4. לחץ על כפתור "לבנות"מארקבתורו.
        הערה: המערכת תצייר באופן אוטומטי את כל היתר של הצלחת. האזורים החדשים שנוצרו צריכים להתאים באופן מושלם בין הדג הממשי לבין ההשתקפות שלו בצד הבאר.
    8. לחץ על לחצן "צייר קנה מידה", צייר קו כיול על המסך (נתיב אלכסוני או במקביל לצד המיקרו-פלטה), הזן את אורכו והגדר את "היחידה". לאחר מכן לחץ על כפתור "להחיל על הקבוצה".
    9. הגדר את צבע החי ב "שחור" בתוכנה.
    10. הגדר את סף הזיהוי ב-16-18 כדי לאפשר זיהוי של בעלי החיים.
    11. קלט לא פעיל/קטן מהירות קטנה/גדולה ב 0.5 ס"מ/s ו 2.5 ס"מ/s בהתאמה.
    12. הגדר את מחלקות זווית הנתיב. קלט "-90, 30, 10, 0, 10, 30, ו 90" כדי להפוך את שיעורי זווית הנתיב מ-180 ° + 180 °.
    13. קבע את תנאי התאורה
      1. לחץ על "פרמטרים" "נהיגה באור" "משתמש באחת 3 שיטות המפעיל למטה" "גירויים משופרים" בתורו להגדיר את תנאי האור.
      2. בחר את "Edge" כפתור, ולאחר מכן להגדיר תקופה חשוכה של 10 דקות, ואחריו שלושה מחזורים של לסירוגין 10 דקות אור וכהים תקופות.
    14. שמור את הפרוטוקול והפוך את האור של חדר הבדיקות.
    15. Acclimate הזחלים במערכת עבור 10 דקות ולחץ על "ניסוי"לבצע"כפתור בתורו, ולאחר מכן בחר את התיקייה שבה קבצי הניסוי נשמרים ולהזין את שם התוצאה.
    16. לחץ על "רקע" כפתור "התחל" בתורו להתחיל את הבדיקה.
    17. לחץ על לחצן "הניסוי"לעצורבתורו כדי לעצור את הניסוי כאשר מסתיים הבדיקה.
      הערה: המערכת מציגה את הנתונים שנבדקו כאשר המערכת נעצרת. הנתונים כוללים את המרחק מסומנים בשלוש מחלקות מהירות ומספרי זווית של הנתיב בשמונה מחלקות זווית של כל דקה. עבור מבחן התנועה בדוגמה המוצגת, המרחק הכולל בכל תקופה קלה (10 דקות) מחושב וההפרש בין קבוצת הביקורת לבין קבוצות הטיפול בהשוואה.
    18. להעביר את מיקרוצלחת 48 היטב בחזרה לחממה אור עבור ניסויים אחרים.
  2. בדיקת פעילות חברתית
    1. לחץ על סמל משגר בשולחן המחשב כדי לפתוח את התוכנה השולטת במארז בקרת תפוקה גבוהה כדי להפעיל את התוכנית.
    2. בחר במודול "אינטראקציות חברתיות" כדי להיכנס לממשק ההפעלה.
    3. העבר את המוכן 6 מיקרופלייט (קבוצת בקרה) בשלב 4.4 לפלטפורמת ההקלטה ומשוך את המכסה.
    4. לחץ על "קובץ" לחצן "צור פרוטוקול" בתורו של התוכנה כדי להתחיל ליצור פרוטוקול חדש.
    5. קלט "6" במיקום "ספירת מיקום" ולחץ על כפתור "אישור".
    6. לחץעל "פרמטרים" פרמטרים "הפרוטוקול" "זמן" כפתור בתורו את התוכנה. הגדר את משך הניסוי עבור 1 h ו-10 דקות והגדר את תקופת האינטגרציה ל-60 s.
    7. צייר את האזורים שזוהו.
      1. בחר את הצורה האליפטית וצייר את העיגול הראשון מסביב לראש הראשון שמאלה.
      2. בחר את המעגל, לחץ על "העתק" לחצן "הדבק"מימין"להדביק" "לבחור" בתורו, ולהשתמש בעכבר כדי לגרור את המעגל המועתק למעלה הטוב הנכון.
      3. בחר את המעגל, לחץ על "העתק" "מארק התחתון" "הדבק" "לבחור" כפתור בתורו, ולהשתמש בעכבר כדי לגרור את המעגל המועתק למטה בסדר הנכון.
      4. לחץ על כפתור "לבנות"מארקבתורו.
        הערה: האזורים החדשים שנוצרו צריכים להתאים בצורה מושלמת ובין הזחלים הממשיים וההשתקפות שלו בצד הבאר.
    8. לחץ על לחצן "צייר קנה מידה", צייר קו כיול במסך (נתיב אלכסוני או במקביל לצד המיקרו-לוח), הזן את אורכו והגדר את "היחידה". לאחר מכן לחץ על כפתור "להחיל על הקבוצה".
    9. הגדר את סף הזיהוי ב-16-18 כדי לאפשר זיהוי של בעלי החיים.
    10. לחץ על כפתור "חיה שחורה" בתוכנה.
    11. בחר את "סף מרחק" לחצן וקלט "5" בתוכנה.
    12. הגדר את תנאי התאורה.
      1. לחץ על "פרמטרים" "נהיגה באור" "משתמש באחת 3 שיטות המפעיל למטה" "גירויים משופרים" בתורו להגדיר את תנאי האור.
      2. בחר את "Edge" כפתור, ולאחר מכן להגדיר תקופה חשוכה של 10 דקות, ואחריו שלושה מחזורים של לסירוגין 10 דקות אור וכהים תקופות.
    13. שמור את הפרוטוקול. והפנה את אור החדר
    14. Acclimate הזחלים במערכת עבור 10 דקות ולחץ על "ניסוי"לבצע"כפתור בתורו, ולאחר מכן בחר את התיקייה שבה קבצי הניסוי נשמרים ולהזין את שם התוצאה.
    15. לחץ על "רקע" כפתור "התחל" בתורו להתחיל את הבדיקה.
    16. לחץ על לחצן "הניסוי"לעצורבתורו כדי לעצור את הניסוי בתוכנה כאשר הבדיקה מסתיימת.
      הערה: המערכת מציגה את הנתונים שנבדקו כאשר המערכת נעצרת.
    17. להעביר את 6 הטוב אימונולוגיה (בקרת הקבוצה) בחזרה לחממה אור עבור ניסויים אחרים.
    18. העבר את 6 מיקרולוחות היטב (5 μg/L ו-50 μg/L) בתורו לפלטפורמת ההקלטה וחזור על הצעדים מ5.2.4 כדי ל5.2.17 על-ידי סודר.

6. ניתוח נתונים

  1. פתח את קובץ הגיליון האלקטרוני בתוצאות התנועה וזווית הנתיב.
  2. בחר את שלוש עמודות המרחק (inadist, smldist, lardist) ולהוסיף אותם.
    הערה: הנתונים של inadist, smldist, ו lardist הממוצע שונים שנרשמו על ידי המערכת בכיתות מהירות שונות (לא פעיל/קטן/גדול), בהתאמה.
  3. עבור כל 10 דקות האור מסכם את המרחק של כל באר, לחשב את המרחק הממוצע של 16 בארות, ולהשוות את הנתונים של שלוש הקבוצות תחת גירויים אור.
  4. עבור כל 10 דקות האור מסכם את מספר הזווית של כל טוב בכל משך האור מ cl01 כדי cl08 בתורו, ולהשוות את הנתונים של שלוש הקבוצות תחת גירויים אור.
    הערה: הנתונים של עמודות מ- cl01 to cl08 מתכוונים למספרים שונים של זווית נתיב שנרשמו על-ידי המערכת בזוויות נתיב שונות, בהתאמה.
  5. פתח את קובץ הגיליון האלקטרוני בתוצאות הפעילות החברתית.
  6. בחר את העמודות contct ו contct , ועבור כל 10 דקות אור הזמן לסכם את הזמנים החברתיים ואת המשך שלהם לכל הטוב.
  7. חשב את הזמנים החברתיים הממוצעים ואת משך הקבוצה האחת בכל משך האור והשווה את הנתונים של שלוש הקבוצות תחת גירוי קל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לחקר ההשפעות הנוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים באמצעות הזחלים של הדגים תחת גירויים באור. התנועה, זווית הנתיב ובדיקות הפעילות החברתית מוגדרות במבוא. הכיוונון של המיקרופלטות בבדיקות התנועה וזווית הנתיב והתמונות של התוכנה מוצגות להלן. בנוסף, תוצאות המחקר שלנו מוצגות כדוגמאות. שני מחקרים להציג את תנועה ואת התוצאות זווית הנתיב לאחר החשיפה BDE-47 ו 6-או/מיאו-BDE-47. המחקר השלישי מציג את ההשפעות של 4 קבוקים מסחריים כלור על התנהגות חברתית.

הכיוונון של 48 מיקרופלייט היטב ואת מקור התנועה של הזחלים במבחן זווית תנועה ו הנתיב.
שלוש קבוצות, כולל קבוצת שליטה אחת ושתי קבוצות טיפול, שימשו בפרוטוקול. בגלל שכל קבוצה יכולה להיות 16 בעלי חיים, המערכת יכולה לשמש לביצוע בדיקות תפוקה גבוהה של תנועה וזווית הנתיב במיקרו-צלחת אחת. איור 1 מציג זחל אחד מטופל עם פתרון הבקרה, 5 μg/l פתרון, ו 50 μg/l פתרון בכל באר של הראשון, האמצעי, והאחרון שתי שורות, בהתאמה.

איור 1 מראה גם את כל התנועה של הזחלים בבדיקות התנועה וזווית הנתיב. המערכת עקבה אחר התנועה של הזחלים וחישב את מרחק השחייה בכיתות מהירות שונות. המערכת חישב את מספרי זווית הנתיב של הזחלים במחלקות שונות של זווית הנתיב. חוקרים יכולים לנתח את הנתונים שנרשמו על ידי המערכת בדרכים שלהם.

Figure 1
איור 1: הכיוונון של 48 מיקרופלייט היטב והתנועה התנועה של הזחלים במבחן זווית הנתיב. A1-A8, B1-B8 = קבוצת הביקורת; C1-C8, D1-D8 = הקבוצה 5 μg/L; E1-E8, F1-F8 = הקבוצה 50 μg/L. קו המעקב אחר צבעים שחורים פירושו חוסר פעילות או תנועות קטנות; קו מעקב צבע ירוק פירושו תנועות נורמליות; ומעקב אחר צבע אדום פירושו תנועות גדולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6 מיקרופלייט היטב במבחן הפעילות החברתית.
איור 2 מראה 6 היטב מיקרופלייט בתהליך הבדיקה החברתית בדיקה. לכל באר היו שני זחלים, והמערכת הקליטה את המרחק בין שני הזחלים במהלך כל תהליך הבדיקה. המערכת רשמה את מספרי הפעילות החברתית והמשך בזמן הבדיקה הקבוע (1 דקות בפרוטוקול זה).

Figure 2
איור 2:6 מיקרופלייט היטב במבחן הפעילות החברתית. לכל באר היו שני זחלים. הקו הצהוב פירושו שהמרחק בין שני בעלי חיים הוא < 0.5 ס מ; הקו האדום פירושו שהמרחק בין שני בעלי חיים הוא > 0.5 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Bde-47 חשיפה מושפע תנועה הזחלים דג זברה ב 5 dpf.
כפי שמוצג באיור 3, קבוצת הריכוז הגבוהה ביותר של bde-47 הפיק היפופי פעילות במהלך התקופה האפלה. עם זאת, לא היו שינויים נצפו עקב חשיפה BDE-47 בתקופות האור.

Figure 3
איור 3: ההשפעות של BDE-47 חשיפה על תנועה של זחל דג ב 5 dpf. תנועה (מרחק הועבר נמדד ס"מ) נרשם בתקופות מתחלפים של חושך ואור למשך כולל של 70 דקות. ברים מוצקים ופתוחים בתחתית מציינים תקופות חשוכות ואור, בהתאמה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM (*p < 0.05 לעומת קבוצת הביקורת). הדמות הזאת השתנתה מזאו ואח '17 באישור אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6-או/מיאו-BDE-47 חשיפה השפיעו על זוויות הנתיב של הזחלים של זברפיש ב 5 dpf.
כפי שמוצג באיור 4, קבוצת הריכוז הגבוה של 6-OH-bde-47 ביצעו פחות הפניות שגרתיות והממוצע פונה 5 dpf. עם זאת, הפניות תגובה יותר המושרה על ידי קבוצות שישה-BDE-47 חשיפה.

Figure 4
איור 4: השפעות של 6-OH/מיאו-BDE-47 על זווית הנתיב של זחל צברפיש במהלך התקופה האפלה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM (*p < 0.05 לעומת שליטה). דמות זו שונתה מז ואח '18 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חשיפה לשירותי הרווחה מושפעת. מהפעילות החברתית של הזחלים ב-5 דפף
כפי שמוצג באיור 5, התנהגויות חברתיות של הזחלים דג זברה הושפעו על ידי שלושה מוצרי CP. הפעילות החברתית היתה מגורה על ידי CP-70 ושרשרת הקצר CP-52 b. השרשרת הארוכה CP-52a קיצרה את המשך לכל מגע של הזחלים.

Figure 5
איור 5: השפעות של השאל על המשך החברתי הממוצע לכל מגע בתקופות אור/כהות שונות. (A) cp-42, (ב) cp-52a, (ג) Cp-52 B, (ד) cp-70. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (*p < 0.05 לעומת הפקד). דמות זו שונתה מיאנג ואח '19 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבודה זו מספקת פרוטוקול ניסיוני מפורט להערכת הרעילות של מזהמים סביבתיים באמצעות הזחלים דג זברה. במהלך תקופת החשיפה, מגיע התהליך מעוברים אל הזחלים, כלומר הטיפול הטוב של העוברים והזחלים חיוני. כל דבר המשפיע על התפתחות העוברים והזחלים יכול להשפיע על התוצאה הסופית. כאן הסביבה התרבותית, תהליך החשיפה והתנאים הניסיוניים נדונים על מנת להבטיח את הצלחת כל שיטת העבודה.

עבור סביבת התרבות, עוברי הדגים והזחלים חיים בטמפרטורה יציבה של ~ 28 ° c. בעבודה זו, חממה קלה שיכולה לקבוע את תנאי האור באופן אוטומטי ולשמור על יציבות הטמפרטורה משמשת לבית העוברים והזחלים. העוברים לא יוצאים מן chorion ב 1 dpf ו 2 dpf, כל כך אכפת יש לנקוט כדי למנוע פגיעה העוברים בלתי מקווקו בעת חידוש פתרון החשיפה. כמו כן, היחס של dmso בפתרון צריך להיות תחת 0.1%34,35, ואת הפתרון חשיפה טרייה צריך להיות 28 ° c לפני שהוא משמש להתחדשות.

תהליך בחירת העוברים לפני החשיפה הוא גם גורם מפתח להצלחת הניסוי. בחירת עוברים בריאים המפתחים במקביל עבור כל קבוצה מבטיחה את הדיוק של הערכת רעילות. Zebrafish יכול לחיות ללא מזון במהלך הראשון 7 ימים אחרי הפריה, אז עדיף לא להאכיל את העוברים או הזחלים במהלך תקופת החשיפה כולה, כי המזון יכול להשפיע על התוצאה הסופית. כמו כן, מומלץ להכין את פתרון החשיפה טרי בעת הצורך.

במהלך בדיקת ההתנהגות, חיוני להציע לזחלים מספיק זמן כדי להסתגל לסביבה של מארז ניטור התפוקה הגבוהה. לפני המבחן, כל צעד של הפרוטוקול נבדק יש לבדוק בזהירות, כולל את תנאי האור, בדיקות זמן, וכו '. חדר הבדיקות צריך להישמר לחלוטין בשקט ובחושך כדי לא להפריע לבעלי החיים.

הפרוטוקול המוצג מציע מסגרת יסודית לחקר הרעילות הנוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים. ישנם גם סוגים אחרים של התנהגויות המשמשות בעת לימוד אפקטים נוירוהתנהגותית, כגון בדיקות צבע-העדפה36, בדיקות מגורים למטה37, אור/כהה בדיקות העדפה38,39, וכו '. עם זאת, בדיקות אלה משתמשות בעיקר בדגים מבוגרים, שאינם מתאימים לבדיקות בתפוקה גבוהה. בנוסף, Weichert et אל. מצולמת להתנהגות של תנועות זנב ספונטנית אשר ניתן לכמת רק אחרי 24 h חשיפה40. הערכת הרעילות הנוירוסטית כוללת גם לימודי מנגנון על תפקוד המוח ומערכת העצבים המרכזית. מחווני הנוירוהתנהגותיים הבסיסיים מוצגים כאן ויכולים ליצור את הבסיס לאינדיקטורים מורכבים יותר באמצעות כלי התנהגות אחרים. בסופו של דבר, התפתחות של אינדיקטורים נוירוהתנהגותית חדשה מלווה במנגנון המחקר הזה ניתן להשתמש במחקרים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים אסירי תודה על התמיכה הפיננסית על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (21876135 ו 21876136), הלאומית המדע והטכנולוגיה פרוייקט של סין (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), הבסיס של מו-שנגחאי מעבדת מפתח של בריאות הסביבה לילדים (CEH201807) ומועצת המחקר השבדית (מס ' 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. , John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. , Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 156 השפעות נוירוהתנהגותית מזהמים סביבתיים הזחלים מהרעילות הרעלת עצבים גירוי קל בדיקת התנהגות
לימוד השפעות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגי הזאב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu,… More

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter