Summary
在此协议中，我们描述了一种稳定、高效的分化策略，用于从人类多能干细胞生成后强感致感神经元。此模型将使神经元可用于多个自主障碍的研究。
Abstract
人类多能干细胞（hPSCs）已成为疾病建模和体外人类胚胎发育研究的有力工具。我们之前提出了一种分化协议，用于具有交感特性的自主神经元的衍生，该特性已应用于自主神经病变患者。然而，该协议建立在敲出血清替代（KSR）和基于饲料的培养条件之上，为了确保高分化效率，细胞分拣是必要的。这些因素导致高可变性、高成本和低可重复性。此外，成熟的寄感特性，包括电活动，尚未得到证实。在这里，我们提出了一个优化的协议，其中PSC培养和分化是在无馈料和化学定义的培养条件下进行的。识别躯干神经峰的基因标记被识别。在20天后实现进一步分化成后刚体交感神经元，无需细胞分拣。电生理记录进一步显示功能神经元身份。从我们分化的神经元检测到的激发可以通过尼古丁增强，并抑制由肾上腺素受体拮抗剂蛋白醇。该协议中的中间交感神经祖生可以作为神经球体维持长达2周，这允许培养物的扩展。总之，与以前的版本相比，我们更新的交感神经元分化协议表现出高分化效率、更好的可重复性、更大的灵活性和更好的神经成熟度。该协议将为研究人员提供研究影响自主神经系统的人类疾病所需的细胞。
Introduction
后刚体交感神经元（symNs）属于自主神经系统（ANS），在独立于意识的个体的反应和调节平衡方面具有多重重要作用。例如，压力刺激symN，并唤起战斗或逃跑的反应，导致心率，血压和出汗的增加。SymNs 因遗传、毒性/伤害或其他疾病的同伴而在多种人类疾病中受到影响。遗传神经病变的一个例子是儿童疾病家庭性肌瘤（FD），其中，严重的调节调节的共生导致反乌托邦危机，明显的出汗，皮肤斑点，呕吐发作，高血压和焦虑1。毒性的一个例子是化疗治疗，据报道，它对自主神经元有毒副作用2。众所周知，自主变性和超内侧病既可导致或伴随，如帕金森病或高血压肾病33，4。4因此，能够进行研究，了解symN生物学的机制和疾病背景下的缺陷，有利于寻找新颖有效的治疗方法。
解剖
外围神经系统分支成感官和自主的分裂。感觉神经系统的发泡神经负责疼痛和触觉的感觉，而ANS负责将信息从所有器官中继到大脑。ANS分为肠神经系统，内化胃肠道，寄生神经系统，这是放松的重要，和寄分神经系统（SNS），这是重要的激活/调节器官。SNS 调整双神经元系统5。前刚利感神经斧头在脊髓第一个项目到交感性神经神经神经斧子，其中后刚体symN细胞体的位置。然后，这些神经元发送长投影，以内化身体中每个器官的目标组织。由前江柱神经元传输的信号是胆碱化的，而后江脂符号是可德雷纳的，因此表达去甲肾上腺素（NE）作为其主要神经递质。很少有明显的例外，后血管，同情神经元是胆碱化，包括那些内化血管。腺素后神经神经元表达酶酪氨酸羟基酶（TH），芳香L-氨基酸脱氧血脂酶（AAAD），多巴胺β-羟基酶（DBH），和单胺氧化酶（MAO-A），所有负责产生和代谢NE。此外，它们还表达NE回收运输机和/或受体β-肾上腺素受体（ADRA2）、β-肾上腺素受体（ADR2B）、去甲肾上腺素输送器（NET1）和光体单胺输送器（VMAT1/2）。
发展
在胚胎发育过程中，符号来自神经峰（NC），神经管和覆盖的ectoderm6之间出现，可以分化成多个细胞谱系，包括黑色素细胞、骨细胞、副细胞、胶质、肠神经元、感觉神经元和自主神经元7。神经峰细胞（NCCs）是高度迁移的细胞，通过胚胎走几条途径。在NC发育的早期阶段，细胞表示标记SNAIL1/2、FOXD3和SOX1088、9、10、11。9,10,11迁移路线以及它们采用的轴向位置决定了它们将发展到的 NC 子类型。这些NC亚型可以通过其特定的HOX基因表达来区分：颅内NCC不表达HOX基因，vagal NCC表达HOX1+5，中继NCCs表达HOX6+9，以及食质NCC表达HOX10~1112。其中，中继NcC被公认为是符号的主要来源。SymN 前体表示转录因子 MASH1/ASCL113，它促进 PHOX2B14和 INSM115的表达。《国家与加体刑部》的转录因子家族在晚期同情发展期间表达。GATA2 和 GATA3 表示在符号中，然后激活 DBH16。转录因子HAND2对DBH和TH17的表达和维护也很重要。
HPSC（例如胚胎和诱导多能干细胞）是一个强大的工具18，用于概括发展范式并生成符号，然后可用于各种人类疾病的疾病建模。因此，在从 hPSC 生成符号的同时，必须遵循发展准则，并评估在差别化过程中表达适当的标记。
以前的 symN 协议
很少有研究小组以前曾报告过hPSC19、20、21,20,21的共生生成。最近22年，我们审查了这些协议与彼此的直接比较。2016年23月，我们发布了一种分化协议，用于生成具有symN字符的自主神经元（图1A）。该协议使用基于KSR的介质，用于维持无差别的hPSCs和细胞分化。此外，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF馈送细胞）上维持hPSCs。我们使用这个协议和PSC从FD患者建模紊乱23。在2019年，我们描述了这个旧协议24的更详细的版本。综上所述，神经命运是由双SMAD抑制25在前2天阻止TGF-β和BMP信号诱导的。使用CHIR99021进行WNT激活促进神经祖细胞成为NC细胞。第11天，通过FACS对CD49D+或+SOX10=种群26，23,23的细胞进行排序，产生了约40%的NC生成效率。+因此，需要分拣以确保下一步差异化的效率和纯度。通过FGF2和CHIR的组合处理，将NCC作为球体进行维护和放大。4天后，对维护的NC球体进行镀层，并给予BDNF、GDNF和NGF，以完成symN成熟。虽然这些符号表示强烈的symN标记，如ASCL1，TH，DBH和PHOX2A，更成熟的符号，包括尼古丁乙酰胆碱受体（CHRNA3/CHRNB4）和囊泡运输器（VMAT1/2）的表达，即使在70天的分化后，也很低。该协议中的HOX基因没有经过正式测试，成熟的神经特性，包括细胞的电生理活性，未经验证。
在这里，我们提出了一个优化的协议来生成符号（图1B）。HPSC 在无馈送条件下保持，在体外内他丁 （VTN） 涂层的菜肴上，使用基本 8 （E8） 介质27。分化介质的公式在每个阶段都进行了修改，从而增加了NC人口28的百分比。symN 成熟可以在 CD49D+/SOX10=排序或未排序的散装 NCC 种群上完成。两者都显示第 30 天的高级别 symN 标记表达式。此外，使用该协议生成的符号对电生理记录和使用symN活化剂和抑制剂化合物的处理有反应。
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Protocol
注：H9 PHOX2B：GFP记者专线由Oh等人提供。本文中使用的一些qPCR引物来自OriGene技术公司，而一些序列则从Frith等人20、30.,30
1. 设置用于盘涂、介质制备和 hPSC 维护
- 碟涂层
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体外内他 （VTN） 涂层
- 将 VTN 小瓶放入 37 °C 水浴中，直到完全解冻，然后彻底混合。
- 对于 100 mm 的 Petri 盘，将 7 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与 0.5 mg/mL VTN 混合，在盘中加入 VTN 溶液，并在室温 （RT） 下孵育 1 小时。
-
地下室膜基质涂层
- 在4°C的冰上解冻基底膜基质的瓶（见材料表）。
- 对于 6 口板的一口井，将 2 mL 的 DMEM/F12 与 20 μL 的 100x 基底膜基质混合，在盘中加入基底膜基质溶液，用石蜡薄膜包裹盘子，并在 4°C 过夜时存放在干净的容器中。尽快工作。涂层菜肴可在4°C下储存长达2周。
-
聚苯乙烯 （PO）/拉米宁 （LM）/纤维素 （FN） 涂层
- 第一天，对于24孔板的一口井，将15μg/mL的PO与1 mL的1xPBS混合，在37°C孵育，5%CO2过夜。在 -20°C 下解冻 LM 和 FN 过夜，储存在 4 °C，直到完全解冻。
- 第二天，吸气PO溶液，用1xPBS清洗2倍，加入1 mL的1xPBS，含有2μg/mL的LM和2μg/mL的FN，并在5%CO2过夜以37°C孵育。此时，带有 LM/FN 溶液的菜肴可以保存在培养箱中数月，只要它不干燥。添加更多 1x PBS，防止盘子干燥。
-
体外内他 （VTN） 涂层
- 媒体准备
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在4°C过夜时解冻一瓶E8补充剂，准备基本8介质（E8）。如果需要，将补充剂与 500 mL E8 介质和抗生素混合。
注：工作 E8 解决方案应在 2 周内使用。 - 通过将 90 mL 的完整 E8 介质与 10 mL 的 DMSO 混合，总体积为 100 mL，从而制备 hPSC 冷冻介质。过滤器消毒。
- 通过将 100 mL 的基本 6 （E6） 介质与 10 μM SB431542、1 ng/mL BMP4、300 nM CHIR99021 和 10 μM Y27632 混合，制备 0 至第 1 天分化介质，总体积为 100 mL。
- 通过将 100 mL E6 介质与 10 μM SB 和 0.75 μM CHIR99021 混合，总体积为 100 mL，准备第 2 天至第 10 天的分化介质。
- 通过混合具有 2 mL B27 （50x）、1 mL N2 （100x）、2 mM L-谷氨酸、3 μM CHIR99021 和 10 ng/mL FGF2 的神经底质介质，准备第10 天至第 14 天球体介质，总体积为 100 mL。
-
通过每次喂食将 0.5 μM 的新鲜 RA 添加到第 10 天至第 14 天球形介质，为球形长期维护准备第 14 天至 28天。
注： 始终将 RA 保持在 -80 °C。 - 通过将神经底介质与 2 mL B27 （50x）、1 mL N2 （100x）、2 mM L-谷氨酸、25 ng/mL GDNF、25 ng/mL BDNF、25 ng/mL NGF、200 μM 抗坏血酸和 0.2 mm dbcAMP 混合，总体积为 100 mL，从而制备 SymN 成熟介质。该解决方案应在 2 周内使用。每次进料前，加入0.125μM新鲜RA。此解决方案从第 14 天（选项 1）或第 28 天（选项 2）开始使用。
- 准备FACS缓冲，混合DMEM与2%FBS，2 mM L-谷氨酸和抗生素，如果需要总体积100 mL。
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在4°C过夜时解冻一瓶E8补充剂，准备基本8介质（E8）。如果需要，将补充剂与 500 mL E8 介质和抗生素混合。
- hPSC 维护
- 解冻并保留 hPSC
- 准备一个 VTN 涂层 100 毫米的盘子。
- 要直接从液氮中解冻一小瓶hPSC，将小瓶放入37°C的水浴中，小心地将管子在水中摆动，直到解冻。将解冻的 hPSC 转移到包含 10 mL 1x PBS 的 15 mL 管的 15 mL 管中，并在 200 x g 下以 200 x g的离心机进行 4 分钟。
- 丢弃上清液，向管中加入 1 mL E8 介质。移液几次完全重新悬浮颗粒，然后再加入9 mL的E8介质，达到10 mL总。
- 从 100 mm 盘中吸气 VTN 溶液。
- 将 hPSC 转移到 100 mm 的盘，轻轻摇动（上下和向左，而不是圆圈），以确保细胞均匀地分布在盘中
- 在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。
- 第二天，吸进所有介质，用10 mL E8进气。
- 在接下来的3⁄4天里，每天以这种方式喂食，然后准备拆分。
- 拆分 hPsC
注：分裂处的hPSC应为80%~90%的汇。应观察边缘光滑明亮的大菌落。但是，应避免每个殖民地之间的接触（图 2B、第 0 天和图 6B）。- 根据需要准备 VTN 涂层 100 mm 的菜肴。
- 吸气 E8 并洗须用 1x PBS 拆分 1 倍的菜肴。
- 吸气 1x PBS 并添加 4 mL 0.25 M EDTA。在37°C孵育2分钟，CO25% 。
注：hPSCs 应拆分/重新镀为小菌落。不要使用 EDTA 治疗超过 2 分钟，以防止分离到单个细胞中。2分钟治疗后，细胞仍应附着在盘面上。 - 吸气EDTA，通过将10 mL的E8介质强力移液分离到盘面，并将所有介质和细胞收集在15 mL管中。
- hPSCs 在 80%~90% 的汇合度下，按 1：15-1：20 分割菌落。例如，将 hPSC 的 1：20 拆分为一个 100 mm 盘中，采用 500 μL 的 E8/hPSC 溶液，并与 9.5 mL 的新鲜 E8 介质混合。
- VTN 涂层 100 mm 菜肴中的板 hPSC。
注：建议分别为每个研究人员和细胞系建立理想的分割比。
- 冷冻 hPSC
- 对于准备分裂的 100 mm hPSC，准备三个冷冻剂和 3.5 mL 冷冻介质。
注：介质和小瓶应保存在 4 °C 或冰上，直到使用为止。 - 吸气 E8，用 1x PBS 洗 2 倍的菜肴。
- 吸气1x PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37°C孵育2分钟，在5%CO2中孵育。
注：hPSCs应该被冷冻为小菌落时，他们将被分割。不要将EDTA超过2分钟的细胞治疗，以防止分离成单细胞。2分钟治疗后，细胞仍应附着在菜的表面上。 - 吸气EDTA，通过在盘子表面通过强移液10 mL的1x PBS分离菌落，并在50 mL管中收集所有介质和细胞。
- 在 200 x g下加入 20 mL 的 1x PBS 和离心机 4 分钟，以洗掉剩余的 EDTA。
- 丢弃上清液，在 3 mL 的冷冻介质中重新悬浮颗粒。
- 均匀地将 hPSC 均匀地分布到三个低温中，每个 1 mL。
- 在 -80°C 下储存在受控冷冻盒或发泡胶三明治中过夜，以确保缓慢下降的温度，然后转移到液氮罐进行长期储存。
- 对于准备分裂的 100 mm hPSC，准备三个冷冻剂和 3.5 mL 冷冻介质。
- 解冻并保留 hPSC
2. 播种 hPSC 以开始分化（第 0 天）
注：hPSC在稳定后应做好分化的准备（即解冻后分裂2~3倍）。确保菌落是健康的，光滑，有光泽的边缘，最小的分化（图2B）。
- 根据需要，在0天前一天准备地下室膜基质涂层菜肴（24个井或6个井菜）。在区分开始时将菜肴带到 RT。
- 根据需要使一天 0+1 分化介质。
- 从汇物中吸出 E8，准备分块 hPCS，用 1x PBS 洗 2 倍的菜肴。
- 每100毫米菜加入7 mL 0.25 M EDTA，在37°C孵育，5%CO2孵化15分钟。
注：此时，EDTA治疗被延长以分散到单个细胞中。 - 从所有 hPSC（它们应浮动）上移出，并转移到 50 mL 管。加入与 EDTA 溶液相同或更多的 1 倍 PBS 以稀释 EDTA。
- 在 200 x g下离心 4 分钟。
- 丢弃上清液，加入1 mL的第0~1天分化介质，并移液液化细胞。接着加入更多的介质，然后混合，将细胞溶液稀释到理想的浓度中，以计数细胞。
注：请勿过度稀释细胞溶液。一个完整的100毫米菜的细胞应稀释在5 mL的中等开始。 - 使用自动细胞计数器或血细胞计计数细胞编号。
- 稀释细胞溶液，根据需要达到125，000细胞/cm2的低最终体积（例如，6口井菜每口2 mL或24口井每口500μL）。
注： 低音量有助于细胞连接更快。 - 将所有基底膜基质溶液从涂层的盘子中吸进，将细胞溶液板入井中。
- 在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。
3. 神经峰细胞诱导（第1天至第10天，图2A）
- 在第1天，用第0⁄1天分化介质（6口菜每口3 mL，24个井菜每口1mL）喂细胞。
- 在第2天，用第2天10分分化介质（6口菜每口3米L，24口井菜每口1mL）喂细胞。
- 从现在起，细胞应每隔一天喂食一次，直到第10天（即下一个喂食日是第4天）。
注：从第6天开始，应检测NC脊（图2B）。为了检查是否发生分化，建议在较小的井（即24口井）中携带平行分化培养，这种培养可以染色用于SOX10/AP2a，并沿分化时间用于标记基因表达（图2B，C）。C - 如果对单元格进行排序，请继续执行第 4 节。否则，请继续执行第 5 节。
4. 用于神经峰标记CD49D的荧光激活细胞分选（FACS）和球状物中的NC细胞聚合
注：对于FACS分拣，样品应保存在冰上，在染色后不要暴露在光线下，直到分拣。
- 如果对单元格进行排序，请准备 FACS 缓冲区。
- 准备第10~14天球形介质。
- 第 10 天，取出介质，用 1x PBS 洗 1x。
- 将分离溶液（参见材料表）以每口2米L为6口井菜或每口1米L，用于24口井，并在37°C孵育，5%CO2孵育20分钟。
- 从所有 hPSC 上移出并转移到 50 mL 管。
- 在 200 x g下将管的其余部分加注 FACS 缓冲液和离心机 4 分钟。
注：每个 50 mL 管可以容纳高达 20 mL 或更少的电池溶液。FACS 缓冲液的体积应足够高，以中和分离溶液。 - 丢弃上清液，用适当数量的FACS缓冲液重新悬浮细胞（6孔板每孔±2 mL），然后计数以确定细胞数。
- 准备以下示例。
- 样品 1（未染色控制）：1 x 106细胞，位于 FACS 缓冲液的 400 μL 中。通过 20 μm 滤网盖过滤细胞，并将管留在冰上。
- 样品2（仅限DAPI控制）：1 x 106细胞在400μL的FACS缓冲液中含有0.5微克/mL DAPI。用滤网盖通过 FACS 管过滤细胞，并将管子保持在冰上。
- 样品3（CD49d标签）：将含有PE/Cy7偶联CD49D抗体的FACS缓冲液的其余部分悬浮在15 mL管中，并在冰上孵育20分钟。6
- 在 200 x g时将管子加注 FACS 缓冲液和离心机 4 分钟。
- 根据制造商的说明，在含有 0.5 微克/mL DAPI 的 1 mL FACS 缓冲液中丢弃上清液并每 5×10 x 106个单元重新悬浮。
- 用滤网盖过滤通过 FACS 管的细胞，并将管子保持在冰上。
- 准备收集FACS管，含有2 mL的FACS缓冲液。
- 使用激光对 FACS 机器进行排序，这些激光可以检测 DAPI 和 PE-Cy7，以隔离 CD49D+填充。
- 排序后，对已排序的单元格进行计数。
- 离心所有分类的细胞，并在第10-14天球形介质中重新悬浮，最终浓度为每500 μL的介质0.5 x 106细胞。
- 板 0.5 x 106细胞每孔进入超低附件 24 孔板。
- 在37°C下孵育细胞，在5%的CO2中孵育。
5. 在球形中聚合NC细胞
- 如果不使用 FACS 分离 NC 细胞，而是直接将它们聚合到球体中，请首先准备步骤 4.2–4.5 中所述的细胞。
- 用 1x PBS 填充管的其余部分，在 200 x g下将离心机装满 4 分钟。
- 丢弃上清液，用适量的第10-14天球体介质重新悬浮细胞（例如，6孔板每孔2 mL的介质），并计数以确定细胞数。
- 在第10-14天球形介质中稀释细胞，每500 μL的介质0.5 x106细胞。
- 在超低附件 24 孔板中，每个孔的细胞悬浮液板 500 μL。
- 在37°C下孵育细胞，在5%的CO2中孵育。
6. NC球菌维护和交感后代诱导（第10天至第14天，图4A）
-
选项 1：最小球形培养
- 在第 11 天，将第 10~14 天球体介质的 500 μL 添加到 NC 球形中，而不从第 10 天开始吸气现有介质。在37°C孵育，在5%的CO2中孵育。
- 第12天，倾斜板以积累井一侧的NC球体。小心吸气并丢弃尽可能多的介质，并喂食1 mL第10~14天球形介质。
- 每天继续喂食细胞，直到第14天。
- 可选：如果球形聚合并产生大团块，请使用移液器将球形团分解。这也确保单个球形不会变得太大。
注：理想的球体尺寸范围应约为 100~500 μm。在这一范围内，单个球体的大小并不重要。但是，形态学（如平滑和清晰的边（图 3和图 6）对于进一步的成功非常重要。在第 14 天，每个 24 个孔板理想地包含上述尺寸范围内约 50-60 个不同尺寸的球类。
-
选项 2：扩展的球体培养
- 第15天，为了保持NC球体，饲料与1.5mL的第10~14天球体介质含有0.5μM RA。在37°C孵育，5%CO2。
注：每次进料应加新鲜RA，并始终储存在-80°C。 - 从现在开始，每隔一天喂一次，第28天，然后继续电镀球体（第7.1节）。
注：生长的球体每周分裂约1倍，用1 mL移液器移液以将其分解。它们以 1：2-1：4 的近似比率进行拆分。在2周的膨胀期内，细胞的数量应该大约翻两番。
- 第15天，为了保持NC球体，饲料与1.5mL的第10~14天球体介质含有0.5μM RA。在37°C孵育，5%CO2。
7. SymN 分化和成熟（备选方案1：第14天之后;选项 2：第 28 天后）
- 在常规菜肴中镀出球体
- 准备 PO/LM/FM 涂层 24 个孔板。
- 制备含有 0.125 μM RA 的 symN 介质（每进给添加新鲜和 10 μM Y27632（仅限第 14 天）。
- 第14天，倾斜板以积累孔的一侧NC球体。小心吸气并丢弃尽可能多的介质，并随 1 mL 的 symN 介质进给。
- 从涂层板上拆下 LM/FN。
- 将每个井从24个井板分割成4口新井，涂布24孔板。每个原始井将有1 mL，包含+50~60球形。这会产生250μL，新板上每口孔含有约10~15个球类。
- 每口井加250μL的附加介质。
注：这是 1：4 的拆分;这是 1：4 的拆分。确保球形在溶液中正确分布，以便分裂相对均匀。球形数不计算，因为最终数量不会影响生成符号的成功。 - 在37°C孵育，5%CO2。
- 第 15 天（或选项 2 的第 29 天），通过更换所有介质，将含有 0.125 μM RA 的 1 mL symN 介质替换进给。从现在开始，神经元应每2天喂食一次，直到第20天（或选项2的第35天）。
- 第20天（或选项2的第35天）后，神经元应谨慎更换现有介质的一半（500 μL）。从现在开始，每周喂食，除非介质迅速变成黄色。
- 保持每周喂食，直到所需的时间点。
注：符号倾向于聚合在类似帮派的结构中，并且容易从培养皿中分离出来。为了防止这种情况，建议进行半进料和最少的处理。
- 电生理记录的电镀细胞
- 准备PO/LM/FM涂层96井电生理板。
- 制备含有 0.125 μM RA 的 symN 介质（每进给添加新鲜和 10 μM Y27632（仅限第 14 天）。
- 第14天，收集所有球体，然后以200 x g离心4分钟。
- 丢弃上清液，加入2 mL分离溶液，并将混合物传回超低附着板的孔中。在37°C孵育，在5%的CO2中孵育20~45分钟。
注：根据球体的大小，分离期可以超过20分钟。每10分钟检查一次细胞分离，长达45分钟。这是此协议中的可选方案，因为球形在完全分离后不会聚合。 - 管道完全分离球体，然后在200 x g下离心4分钟。
- 丢弃上清液，重新挂起具有适当数量的symN介质的细胞，并计算细胞数。
- 以100，000/cm2在PO/LM/FN涂层电生理学井中，以每口井总体积200μL的体积对细胞进行板。
- 在第 15 天（或选项 2 的第 29 天），遵循与第 7.1 节中相同的进料过程。第 15 天后的总交易量（或选项 2 的第 29 天）每口井应为 300 μL。
- 在第 20 天（或选项 2 的第 35 天）后使用多电极阵列机器测量电信号。
注：在选项 2 中，球形可在第 14 天-第 28 天之间随时镀。第一次电信号测量可以在电镀球体后1周进行。
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Representative Results
在此协议中，我们将给出有关如何从 hPSC 生成符号的说明。这里演示的培养条件从先前公布的协议23、24（图1A）到无馈送和化学定义的条件（图1B）都得到了改善。23,提供了两个选项，一个在 20 天内生成符号，另一个选项可以扩展 NcC 2 周以生成更多的单元格，然后可以分化为符号（图 1B、选项 1 和 2）。
为了正确监测分化细胞的symN特性，PHOX2B-eGFP WA09报告器行和父WA09 PSCs线路19。所有分化都至少进行三次生物重复，定义为在至少一次通过和/或从新解冻的细胞小瓶中提取的独立分化实验。当无分化hPSCs的共性达到80%-90%时，诱导分化。hPSC 菌落是圆形的，有光泽、光滑的边缘，几乎没有差别。殖民地不应相互接触（图2B，第0天）。TGF-β 抑制与WNT和BMP4信号结合，而不是典型的双SMAD抑制25，以前用于神经峰诱导，导致早期神经峰标记AP2a的稳健表达。神经峰标记SOX10从第4天到第10天（图2B）表示。从第6天起，NCC就出现在密密麻麻的山脊上。这些山脊表示SOX10（图2B，箭头）。此前显示，NCC阶段的SOX10与细胞表面标记CD49D23、26,26相关，因此CD49D可用于对未报告SOX10位点任何荧光的NC细胞进行排序。图2C显示了NCC标记基因随时间的表达。图 2D表明我们的差别化效率超过 80%。为了确定剩余细胞的身份，qRT-PCR 用于测试污染细胞类型，包括 BryT 表达中皮、SOX17 表达内皮和 PAX6 表达神经分理;发现所有人员均处于非常低的水平（未显示数据;所有引素见补充表1）。但是，检测到某些 SIX1/EYA1= placode（未显示数据），这些代码可能是剩余细胞类型的来源。此外，剩余的细胞类型可能是已经进一步分化的 NCC 衍生物。在现阶段评估了NCC的HOX代码（图2E）。然而，在这个早期阶段，HOX信号非常低（注意比例），这表明这些NCC要么是颅NC字符，要么还没有采用任何NCC子类型字符。
第10天，可以使用FACS纯化NCC，它产生了大约80%的CD49D+NCC（图2D）。+图2D中指明了典型浇注策略的示例。排序后，细胞被聚合为NC球形（图3A）。为了扩大NCC并诱导中继-NC样特性，细胞被FGF2和CHIR的组合处理。我们测试了 CD49D+总体的排序是否在以后产生了更好或更纯净的符号区域性。图 3B比较未排序的 CD49D+排序与 CD49D-排序的单元格群。在左边，可以看到正排序和未排序的种群以类似的方式使NC球形，而负排序细胞没有正确聚合，没有使圆，光滑，健康外观球体，并在3⁄4天内死亡。此外，当第14天通过用于NC和symN祖代标记的qRT-PCR对NC球体进行比较时，无法检测到排序细胞和未排序细胞之间的显著差异。值得注意的是，此时，交感祖标记的表达仍然较低，SOX10 水平仍然很高，这表明球形仍由具有 NC 属性的细胞组成。电镀后一天（第15天），可以清楚地观察到未排序和CD49D+球形与PO/LM/FN菜肴和中性粒体外生长（图3B，D15和+图3C，D29）。未排序和排序的区域性平行地延续到第35天，但未发现重大差异（未显示数据）。因此，可以得出结论，排序步骤对于生成 symN 来说并非必不可少，因此它是此协议中的可选步骤。但是，对于不产生 80% CD49D+细胞的低效分化，我们建议进行分拣过程。
接下来，我们测试了是否可以在不丢失 NC 标识的情况下保持这些 NC 球形（图 3A，选项 2）。NcC被培养为球体长达2周（图3C）。与选项1中的第14天和第15天相比，第28天球体和镀层细胞的形态与第29天相似。在第28天，SOX10表达式维持在与第14天相似的水平。然而，早期交感前代标记（即ASCL1、PHOX2B和GATA3）的表达增加（图3C，右图），表明FGF2、WNT和RA信令中的扩展区域性导致成熟和后化（图4C和F）。基里诺等人21日曾报道过类似的影响。
NC膨胀（选项1或选项2）后，球体在PO/LM/FN涂层盘上镀，并随附多种神经因子以使符号成熟（图4A）。在第20天和第35天（分别在选项1和2电镀后1周），在从附加的球体延伸的径向图案中观察到神经质（图4A，右图）。此外，还表达了与去甲肾上腺素（NE）合成和运输有关的标记（即TH、AAAD、DBH）（图4B）。这里再次检查了污染细胞类型的存在，并发现了ChAT的表达，它能指示寄生神经元（图4B，E）。E然而，ChAT也用胆碱性符号表示。检测到的 VIP（另一个寄生标记）水平非常低（未显示数据）。此外，检测到低浓度的BRN3A、ISL1和RUNX1（图4B，E），这可能表示感觉神经元或三角神经元，即placode的衍生物。E检测到最小EDNRB（标记肠神经元）和OLIG2（标记运动神经元）（未显示数据）。非神经元细胞的身份仍不清楚。然而，根据我们以前的symN协议23的结果，他们最有可能是βSMA和肌纤维细胞。HOX基因的表达被重新检查，结果发现HOX5-9被表达，表明一个树干身份。HOX10（指示性-NC）未表示（图4C，F）。 F最后，表达成熟标记，包括尼古丁乙酰胆碱受体（CHRNA3/4）和与NE相关的受体，包括抗氧化受体（ADRA2A/B2）NE运输机（NET，SCL6A2）和囊泡运输器（VMAT1）（图4D，G）。G与选项1相比，这些基因在与选项2一起衍生的细胞中的表达没有显著差异（图4E+G）。
我们在 H9-PHOX2B：GFP 报告器行上执行此协议（图 5），进一步证实了我们的结果。到了第20天，这些细胞形成了密集的神经元草坪，并聚合在密度更高的簇中，表明分化效率非常高（图5A，上排）。染色表明，这些集群中大多数的符号团块，使得整体分化效率的评估和量化变得困难。为了突出特定 symN 标记的染色和共定位，我们重点关注群集外围密度较低的区域（参见图 5A中的黄色框，右图）。这也是大多数污染细胞的位置，因此它不是判断整体效率的好领域。尽管如此，典型的符号N标记;包括外围素 （PRPH）、ASCL1、TH、PHOX2B、TUJ1（泛神经元）、DBH 和 NET1（沿 symN 实体和斧子以点表示，图 5A、底部）;检测到。采用多电极阵列（MEA）方法测量电活动，发现当天20个符号发射速度约为每秒3-5个峰值，而未分化的hPSCs的负控制（图5B）。重要的是，细胞均匀地分布在井中，以便每个电极（图5B中的黑点，明亮的场）正确记录。第20至第30天，还用1μM尼古丁刺激，它模仿体内符号的预位信号，提高了细胞的平均发射率。还测量了神经元的抑制。β2-肾上腺素受体（ADRB2），位于symN斧子端子上，为NE分泌29创建一个正反馈回路。用1μM丙诺醇（β2-肾上腺素受体拮抗剂）治疗symN抑制其活性（图5C，右图）。这些结果表明，此协议生成的符号在功能上处于活动状态。
图1：symN区分协议的原理图图和比较。（A） 泽尔特纳等人先前的协议23.（B） 优化的协议。选项 1 长 20 天，仅包含 4 天的 NC 球形培养。选项 2 长 35 天，包含 2 周 NC 球形膨胀阶段，允许生产更多 NC 细胞。VTN = 体外甲素，PO = 多L-奥尼丁，LM = 拉米宁，FN = 纤维素，SB = SB 431542，CHIR = CHIR 99021，RA = 视网膜酸，AA = 抗坏血酸，NF = NGF_BDNF_GDNF。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：NC感应。（A） NC 诱导的时间表和治疗从第 0 天到第 10 天。（B） 通过明亮的场显微镜每 2 天监测一次 NC 山脊的形态和形成。第 2 天之后每个时间点的单元格被共染色，用于 AP2A（红色）和 SOX10（绿色）。所有免疫荧光图片都带有DAPI的反面。红色箭头表示山脊的结构。（C） qRT-PCR 分析，用于第 2-10 天 NC 标记的表达式配置文件。（D） 第 10 天用于 CD49D+ NC 种群的 FACS 排序代表性图（左图）。前四个图中指示了典型的浇注策略和等值型控制。还进行了CD49D+第10天的细胞百分比量化。（E） qRT-PCR 分析 HOX 基因的表达配置文件从第 2-10 天开始。NC = 神经波峰。误差条源于n = 3生物重复的数据，定义为在与PSC培养体分开的单独日进行的独立分化实验，至少一次分裂。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：神经峰的维护和扩展。（A） 第 10 天至第 14 天 NC 扩展的时间表和治疗选项 1 或第 10 天到第 28 天区域性的选件 2。（B） 从第 11 天（球体形成后 1 天）到第 14 天（即电镀日），通过明亮场显微镜监测 NC 球体形成。比较了未排序的 CD49D+和 CD49D-种群。还显示了第 15 天的镀层细胞。细胞在CD49D组中未能正确形成球体，在电镀后死亡.第14天细胞通过qRT-PCR分析（右）检查了symN祖祖的表达轮廓。对未排序和CD49D+种群进行了比较（n = 3）。（C） NC 球形可维持长达 2 周。从第15天到28日（着陆日），光场显微镜对球样进行了监测。还显示了第29天的镀层细胞。第28天球体通过qRT-PCR分析检查了symN祖体的表达轮廓（右）。未排序和 CD49D+种群被汇集（n = 3）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：SymN 分化和成熟。（A） 第 14 天电镀后的时间轴和治疗选项 1 或选项 22 的第 28 天。明亮场显微镜照片（右图）分别显示第 20 天和第 35 天（两个选项在电镀后 1 周）显示符号。（B=D）选项 1 qRT-PCR 分析，用于第 20-30 天之间 symN 属性的表达式配置文件。未分类和 CD49D+人群被汇集在一起。（E+G）选项 2 qRT-PCR 分析，用于第 35 天之后 symN 属性的表达式配置文件。未排序和 CD49D+种群被汇集（n = 3）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 5：符号的功能特征。（A， 顶行）第20天symN簇的明亮场图像和彩色图像显示PRPH和TH双正细胞大多位于簇中。（A， 底部）第20天通过免疫荧光染色验证了多个symN标记（分离通道）。去甲肾上腺素运输器（NET1）既位于细胞体表面，也位于斧子和树突上。它在这个放大倍率上以点显示。所有免疫荧光图片都带有DAPI的反面。（B） 多电极阵列 （MEA） 分析的代表性热图，用于第 20 天（顶部）的符号。明亮的场图（底部）显示符号的密度和电极（八个黑点）的分布。未排序和 CD49D+人口汇集在这里。（C） 在治疗1μM尼古丁和1μM丙丙醇的情况下，第20~30天的平均燃烧率分别量化5分钟（右）。来自未排序和CD49d阳性种群的结果被汇集（n = 3）。未配对的双尾 t 测试，带有韦尔奇的修正，p 值：\lt;0.05。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 6：在不适合进行分化的条件下的单元格示例。（A） 与单元格形态的每个检查点的区分时间轴，如B+E所示。（B） hPSCs （a） 具有健康的菌落和大量分化细胞，以及 （b） 第 0 天某些殖民地之间的合并和分化边界。红色箭头指示合并区域。（C） 第 10 天的 NCC，山脊上有气泡状的水泡。红色箭头指示顶行中的水泡。下一行表示更高的放大倍率。我们未能识别水泡的细胞身份。但是，更多的水泡的存在似乎与较低的 SOX10/CD49D 表达式相关。（D） 第 14 天，不规则的球形缺乏光滑的边缘和圆形。（E） 第 20 天不健康且死亡。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
我们最近发表了两篇评论，一篇讨论使用hPSC衍生的symN进行疾病建模31，以及深入比较现有的分化协议22。因此，在这里，我们重点对当前协议进行故障排除，以帮助感兴趣的研究人员成功创建 symN。在整个分化过程中，为了获得一致的数据以及健康的分化细胞，应仔细控制各个阶段的污染。在常规 hPSC 维护中，支原体测试应每两周或每月执行一次。如果在第10天进行细胞分拣，强烈建议向任何介质添加抗生素。在开始分化之前和之后检查细胞形态也很重要。在这里，我们建议几个关键检查点（图6A）。首先，理想的hPSC菌落准备分化应该有明亮和光滑的边缘与微小的尖峰。具有齿轮状尖峰的殖民地已开始分化，不应使用。强烈建议在最佳时间点使用细胞，因为形态可以在几小时内改变。仅仅推迟一天可能会崩溃细胞（图6B，a），或导致菌落之间的接触（图6B，b），这刺激b在hPSCs的分化。在一种文化中，去除每个分化细胞是具有挑战性的，但是种群应该被控制在少于5%的坏菌落中。遵循此协议时，区分期间的第二个检查点在第 2 天和第 10 天之间。在这个阶段，应在明亮的场显微镜下清楚地观察到黑暗的NC脊（图2C）。山脊的厚度和分布可以用作NC效率的指标：由于NCC主要来自形成山脊的细胞，山脊中较薄或较不普遍的山脊和水泡可能表示NC产量低，因此在结果不一致的情况下应进行标记或丢弃（图6C）。强烈建议在第 10 天进行 RNA 采样，以检查上述 NC 标记。第三个检查点是在 NC 球形阶段，因为球形可能聚合。最好定期移移介质以分解并重新挂起聚合（细胞不会分散回单个细胞，而只能分散到小球形）。如果球形膨胀过快，将它们分成1：2或1：4，以留出足够的空间和营养，使细胞生长。如果球形没有平滑和圆形的形状（图6D），它可能表明第10天的NC效率不够高，从而可能破坏最终的分化。测试表达式配置文件以检查 symN 祖代属性建议在所需的球形电镀日进行。第四个检查点是镀出球体后。神经中应清晰可见，捆绑应在第 20 天后开始形成。没有广泛神经质和束的细胞应被视为污染（图6E）。在这一点上，重要的是通过替换只有一半的现有介质来喂养神经元，以保持稳定的神经元创造的营养环境。喂食细胞时要小心，因为成熟的符号是脆弱的，并且很容易分离。这里描述的每种不好的形态的原因还没有完全理解。然而，它确实提供了对hPSCs和体外分化的敏感性的洞察。这种违规行为的一个来源可能是来自不同供应商的试剂。例如，使用不同品牌的 BMP4 时，带有水泡的薄脊会显示。
对于使用MEA的电生理分析，为了均匀地在电极井中分配符号，球体被Accutase分离。治疗时间应为 20 分钟开始。然而，由于球形高度压缩，分离时间可以增加到45分钟，以确保球体完全分离。通常，MEA 板上的每个实验组都需要以至少 6 倍的倍数运行，以获得一致的结果。值得注意的是，由于我们的重镀密度远低于制造商的建议32（约500~700，000/cm2），油井重复至关重要。在我们的结果中，大量的symN标记表达和稳定活动从第20天到第30天都显示。我们建议这样做作为开始记录选择变量的最佳时间点。对于每种差别化，应尽快使介质焕然一新，并尽快使用（不超过一个月）。
此处介绍的 symN 差异化协议无馈送、化学定义、高效、可扩展，并在第 20 天生成功能符号。这种定义的symN分化方案可用于研究人类的交感神经系统疾病，作为药物筛选的平台，用于肿瘤成生研究，如神经母细胞瘤/同色细胞瘤，或用于静位调节的基础研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢海蒂·乌尔里希斯对手稿的批判性阅读和编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| DAPI dye | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
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