Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv differentiering af postganglioniske sympatiske neuroner ved hjælp af humane pluripotente stamceller under Feeder-fri og kemisk definerede kulturbetingelser

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

I denne protokol beskriver vi en stabil, yderst effektiv differentieringsstrategi for generering af postganglioniske sympatiske neuroner fra menneskelige pluripotente stamceller. Denne model vil gøre neuroner til rådighed for brug af undersøgelser af flere autonome lidelser.

Abstract

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er blevet et effektivt redskab til sygdomsmodellering og studiet af menneskelig embryonal ebiotionisk udvikling in vitro. Vi har tidligere præsenteret en differentieringsprotokol for afledning af autonome neuroner med sympatisk karakter, der er blevet anvendt på patienter med autonom neuropati. Men protokollen blev bygget på Knock Out Serum Replacement (KSR) og feeder-baserede dyrkningbetingelser, og for at sikre høj differentieringeffektivitet var cellesortering nødvendig. Disse faktorer forårsager høj variation, høje omkostninger, og lav reproducerbarhed. Desuden er modne sympatiske egenskaber, herunder elektrisk aktivitet, ikke blevet verificeret. Her præsenterer vi en optimeret protokol, hvor PSC-kultur og differentiering udføres i feeder-fri og kemisk definerede dyrkningsbetingelser. Genetiske markører, der identificerer stammenneuralt våbenskjold, er identificeret. Yderligere differentiering i postganglionic sympatiske neuroner opnås efter 20 dage uden behov for cellesortering. Elektrofysiologisk optagelse viser yderligere den funktionelle neuron identitet. Fyring opdaget fra vores differentierede neuroner kan forbedres ved nikotin og undertrykt af adrenerge receptor antagonist propranolol. Mellemliggende sympatiske neurale sformere i denne protokol kan opretholdes som neurale sfæroider i op til 2 uger, som giver mulighed for udvidelse af kulturerne. Sammenfattende, vores opdaterede sympatiske neuron differentiering protokol viser høj differentiering effektivitet, bedre reproducerbarhed, mere fleksibilitet, og bedre neurale modning i forhold til den tidligere version. Denne protokol vil give forskerne de celler, der er nødvendige for at studere menneskelige lidelser, der påvirker det autonome nervesystem.

Introduction

Postganglionic sympatiske neuroner (symNs) hører til det autonome nervesystem (ANS) og har flere vigtige roller i at reagere og regulere homøostase i kroppen uafhængigt af bevidsthed. For eksempel stimulerer stress symNs og fremkalder kampen-eller-flugt reaktion, der fører til en stigning i puls, blodtryk, og svedtendens. SymNs er påvirket i flere menneskelige lidelser på grund af genetik, toksicitet / skade, eller som ledsagere til andre sygdomme. Et eksempel på en genetisk neuropati er børnesygdommen Familiær Dysautonomi (FD), hvor en alvorlig dysregulering af symNs forårsager dysautonomisk krise, tydeligt ved svedtendens, blotching af huden, opkastning sangreb, hypertension, og angst1. Et eksempel på toksicitet er kemoterapi behandling, som er blevet rapporteret at have toksiske bivirkninger på autonome neuroner2. Det er kendt, at autonome denervation og hyper-innervation både kan føre til, eller ledsage, sygdomme som Parkinsons sygdom eller hypertensive nyresygdom3,4. Således er det gavnligt for søgningen af nye og effektive behandlinger at være i stand til at forske og forstå mekanismerne i symNbiologi og defekter i forbindelse med sygdom.

Anatomi
Det perifere nervesystem grene i sensoriske og autonome divisioner. De afferente nerver i det sensoriske nervesystem er ansvarlige for følelse af smerte og berøring, mens ANS er ansvarlig for at formidle oplysninger fra alle organer til hjernen. ANS er opdelt i det enteriske nervesystem, innervating mave-tarmkanalen, det parasympatiske nervesystem, som er vigtigt for afslapning, og det sympatiske nervesystem (SNS), som er vigtigt for aktivering / regulering af organer. SNS tilpasser et to-neuron system5. Preganglionic sympatiske neurale axoner i rygmarven første projekt til den sympatiske ganglier, hvor postganglionic symN celle organer er placeret. Disse neuroner derefter sende lange fremskrivninger til innervate målet væv af hvert organ i kroppen. Signaler, der transmitteres af præganglioniske neuroner er kolinerge, mens postganglionic symNs er adrenerge og dermed udtrykke noradrenalin (NE) som deres vigtigste neurotransmitter. Der er få bemærkelsesværdige undtagelser fra postganglionic, sympatiske neuroner, der er kolinerge, herunder dem innervating blodkar. Adrenerge postganglioniske neuroner udtrykker enzymerne tyrosin hydroxylase (TH), aromatisk L-aminosyre decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroxylase (DBH) og monoaminoxidase (MAO-A), alle ansvarlige for at generere og metabolisere NE. Endvidere udtrykker de NE-genbrugstransportører og/eller receptorer α-adrenerge receptorer (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalintransporter (NET1) og vesikulær monoamintransportør (VMAT1/2).

Udvikling
Under embryonale udvikling symNs er afledt af neurale crest (NC), som opstår mellem neuralrørssystemet og overliggende ektoderm6, og kan differentiere i flere celle slægter, herunder melanocytter, osteoblaster, adipocytter, glia, enteriske neuroner, sensoriske neuroner, og autonome neuroner7. Neurale crest celler (NCC) er stærkt vandrende celler, der tager flere ruter gennem fosteret. På dette tidlige stadium af NC udvikling, cellerne udtrykke markører SNAIL1/2, FOXD3, og SOX108,9,10,11. Migrationsruten sammen med den aksiale placering, de vedtager, bestemmer den nc-undertype, som de vil udvikle sig i. Disse NC-undertyper kan skelnes ved deres specifikke HOX-genekspression: Kranie-NCC'er udtrykker ikke HOX-gener, vagus-NCC'er udtrykker HOX 1-5, trunk-NCC'er udtrykker HOX 6-9, og sakrale NCC'er udtrykker HOX 10-1112. Blandt dem, trunk NCC'er er anerkendt som den vigtigste kilde til symNs. SymN prækursorer udtrykke transskription faktor MASH1/ASCL113, som fremmer udtryk for PHOX2B14 og INSM115. GATA familie af transskription faktorer kommer til udtryk i slutningen af sympatisk udvikling. GATA2 og GATA3 udtrykkes i symNs, som igen aktiverer DBH16. Transskriptionsfaktoren HAND2 er også vigtig for dbh'ens og TH17'sudtryk og vedligeholdelse .

HPSCs (f.eks embryonale og inducerede pluripotente stamceller) er et kraftfuldt værktøj18 til at opsummere udviklingsmæssige paradigmer og generere symNs, der derefter kan anvendes til sygdommodellering af forskellige menneskelige lidelser. Samtidig med at der genereres symNs fra hPSCs, er det derfor afgørende at følge udviklingsretningslinjerne og vurdere udtryk for passende markører langs differentieringsprocessen.

Forrige symN-protokol
Kun få forskergrupper har tidligere rapporteret om generering af symNs fra HPSCs19,20,21. Den direkte sammenligning af disse protokoller til hinanden og vores blev gennemgået for nylig22. I 201623offentliggjorde vi en differentieringsprotokol for generering af autonome neuroner med symN-karakter (Figur 1A). Denne protokol anvendte KSR-baseret medium, som blev brugt til både vedligeholdelse af udifferentierede HPSC'er og celledifferentiering. Desuden blev hPSCs opretholdt på mus embryonale fibroblaster (MEF feeder celler). Vi anvendte denne protokol og KPC'er fra patienter med FD til at modellere lidelsen23. I 2019 beskrev vi en mere detaljeret version af denne ældre protokol24. Sammenfattende blev den neurale skæbne induceret af dobbelt SMAD-hæmning25 for at blokere TGF-β og BMP-signalering i de første 2 dage. WNT aktivering ved hjælp af CHIR99021 fremmes neurale sformere til at blive NC celler. På dag 11 blev cellerne sorteret efter FACS for CD49D+ eller SOX10+ populationer26,23, hvilket gav omkring 40% NC generation effektivitet. Sortering var således nødvendig for at sikre effektivitet og renhed for de næste trin i differentieringen. NCC'erne blev opretholdt og forstærket som sfæroider med kombineret behandling af FGF2 og CHIR. Efter 4 dage blev NC sfæroider af vedligeholdelse belagt og givet BDNF, GDNF, og NGF at afslutte symN modning. Selv om disse symNs udtrykt stærke symN markører såsom ASCL1, TH, DBH, og PHOX2A, markører for mere modne symNs, herunder udtryk for den nicotiniske acetylcholin receptor (CHRNA3/CHRNB4) og vesikel transportør (VMAT1/2), var lav, selv efter 70 dages differentiering. HOX gener i denne protokol blev ikke formelt testet, og modne neurale egenskaber, herunder elektrofysiologisk aktivitet af cellerne, blev ikke verificeret.

Her præsenterer vi en optimeret protokol til at generere symNs (Figur 1B). HPSC'er vedligeholdes under foderautomatfrie forhold på vitronectin (VTN)-belagte retter ved hjælp af Essential 8 (E8) media27. Formlen for differentieringsmediet er blevet ændret på hvert trin, hvorved procentdelen af NC's befolkninger steget 28. Den symN modning kan gøres på CD49D+/ SOX10+ sorteret eller usorteret bulk NCC populationer. Begge viser høje niveauer af symN markør udtryk ved dag 30. Desuden er symNs genereret med denne protokol reagerer på elektrofysiologisk optagelse og til behandlinger med symN aktivator og inhibitor forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: H9 PHOX2B:GFP reporter linjen blev leveret af Oh et al.19. Nogle qPCR primere, der anvendes i dette papir blev fremstillet af OriGene Technologies, mens et par sekvenser er fremstillet af Frith et al.20,30.

1. Opsætning til overfladebehandling af fad, medieforberedelse og hPSC-vedligeholdelse

  1. Skål belægning
    1. Vitronectin (VTN) belægning
      1. Hætteglas med VTN anbringes i et 37 °C vandbad, indtil det er helt optøet, og derefter blandes grundigt.
      2. For en 100 mm petriskål blandes 7 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) med 0,5 mg/ml VTN, skålen tilsættes VTN-opløsning og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 1 time.
    2. Kælder membran matrix belægning
      1. Optø hætteglas med kældermembranmatrix (se Materialetabel) på is ved 4 °C natten over.
      2. For en brønd af en 6 brøndplade blandes 2 ml DMEM/F12 med 20 μL 100x kældermembranmatrix, der tilsættes kældermembranmatrixopløsning til skålen, skålen pakkes med paraffinfilm og opbevares i en ren beholder ved 4 °C natten over. Arbejd så hurtigt som muligt. Belagte retter kan opbevares i 4 °C i op til 2 uger.
    3. Polyornithin (PO)/laminin (LM)/fibronectin (FN) belægning
      1. På den første dag blandes 15 μg/ml PO med 1 ml 1x PBS, der inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 natten over for en brønd af en brøndplade. Tø både LM og FN op ved -20 °C natten over og opbevares ved 4 °C, indtil de er helt optøet.
      2. På den anden dag, aspirate PO opløsning, vaskebrønde 2x med 1x PBS, tilsættes 1 ml 1x PBS indeholder 2 μg/ml LM og 2 μg/ml FN og inkubere ved 37 °C i 5% CO2 natten over. På dette tidspunkt kan skålen med LM/FN-opløsningen opbevares i kuvøsen i flere måneder, så længe den ikke tørrer ud. Tilsæt mere 1x PBS for at forhindre, at skålen tørrer ud.
  2. Forberedelse af medier
    1. Essential 8-mediet (E8) fremstilles ved optøning af en flaske E8-tillæg ved 4 °C natten over. Bland tillægget med 500 ml E8 medium og antibiotika, hvis det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Arbejdsopløsning E8 skal bruges op inden for 2 uger.
    2. HPSC-frysemediet klargør ved at blande 90 ml komplet E8-medium med 10 ml DMSO til et samlet volumen på 100 ml. Filter steriliseres.
    3. Dag 0 til dag 1 differentieringsmedium fremstilles ved at blande 100 ml essentielt 6 (E6) medium med 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 og 10 μM Y27632 for et samlet volumen på 100 ml.
    4. Dag 2 til dag 10 differentieringsmedium fremstilles ved at blande 100 ml E6-medium med 10 μM SB og 0,75 μM CHIR99021 for et samlet volumen på 100 ml.
    5. Der tilberedes dag 10 til dag 14 sfæide medium ved at blande neurobasalmedium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 3 μM CHIR99021 og 10 ng/mL FGF2 for et samlet volumen på 100 ml.
    6. Der fremstilles dag 14 til dag 28 medium til sfællelang langtidsvedligeholdelse ved at tilføje 0,5 μM frisk RA til dag 10 til dag 14 sfæroide medium for hver fodring.
      BEMÆRK: Hold altid RA ved -80 °C.
    7. Der tilberedes SymN-modningsmediet ved at blande neurobasalt medium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM ascorbinsyre og 0,2 mM dbcAMP for et samlet volumen på 100 ml. Opløsningen skal anvendes inden for 2 uger. Før hver fodring tilsættes 0,125 μM frisk RA. Denne løsning anvendes fra dag 14 (mulighed 1) eller dag 28 (mulighed 2).
    8. Lad FACS-bufferen klargøre ved at blande DMEM med 2% FBS, 2 mM L-glutamat og antibiotika, hvis det er nødvendigt for et samlet volumen på 100 ml.
  3. hPSC-vedligeholdelse
    1. Optøning og opbevaring af HPSCs
      1. Forbered en VTN belagt 100 mm fad.
      2. At tø et hætteglas med HPSCs direkte fra flydende nitrogen, sætte hætteglasset i en 37 °C vandbad, omhyggeligt svinge røret i vandet, indtil det tø op. Optøede HPSCs overføres til et 15 ml rør indeholdende 10 ml 1x PBS og centrifugeres ved 200 x g i 4 min.
      3. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml E8-medium til røret. Pipette et par gange for fuldt ud at resuspendere pellet og derefter tilføje en anden 9 ml E8 medium for at nå 10 ml i alt.
      4. Sug VTN-opløsningen ud af 100 mm skålen.
      5. Overfør hPSCs til en 100 mm skål, ryst forsigtigt (op-ned og venstre-højre, ikke i cirkler) for at sikre celler er fordelt jævnt i skålen
      6. Inkuber ved 37 °C i 5% CO2.
      7. Den følgende dag, aspireralle medium og foder med 10 ml E8.
      8. Feed på denne måde hver dag i de næste 3-4 dage og derefter forberede sig på at opdele.
    2. Opdeling af hPSCs
      BEMÆRK: HPSCs på det punkt, opdeling bør være 80% -90% confluent. Store kolonier med glatte og lyse kanter skal overholdes. Kontakt mellem hver koloni bør dog undgås (figur 2B, dag 0 og figur 6B).
      1. Forbered VTN-belagte 100 mm retter efter behov.
      2. Aspirer e8 og vask skålen, der skal deles 1x med 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS og tilsæt 4 ml 0,25 M EDTA. Inkuber i 2 minutter ved 37 °C, 5% CO2.
        BEMÆRK: HPSC'erne skal opdeles/replateres som små kolonier. Må ikke behandles med EDTA længere end 2 min for at forhindre adskillelse i enkelte celler. Cellerne skal stadig fastgøres til skåloverfladen efter 2 min.
      4. Aspirere EDTA, løsrive kolonierne ved kraftigt pipettering 10 ml E8 medium på skålens overflade, og opsamles alle medium og celler i et 15 ml rør.
      5. Med HPSCs på 80%-90% sammenløb, split kolonier med 1:15-1:20. For eksempel, at opdele HPSCs med 1:20 i en 100 mm fad, tage 500 μL af E8/ hPSCs opløsning og blandes med 9,5 ml frisk E8 medium.
      6. Plade hPSCs i VTN-belagte 100 mm retter.
        BEMÆRK: Det tilrådes at etablere den ideelle split ratio for hver forsker og cellelinje uafhængigt.
    3. Frysning af hPSCs
      1. For en 100 mm skål af HPSCs, der er klar til at blive delt, forberede tre kryovialer og 3,5 ml frysemiddel.
        BEMÆRK: Medier og hætteglas skal opbevares i 4 °C eller på is, indtil de tages i brug.
      2. Aspirere E8 og vask skålen 2x med 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS og tilsættes 4 ml 0,25 M EDTA, inkuberi i 2 min ved 37 °C, i 5% CO2.
        BEMÆRK: HPSCs bør fryses som små kolonier på det tidspunkt, hvor de ville blive delt. Cellerne må ikke behandles med EDTA længere end 2 min for at forhindre adskillelse i enkelte celler. Cellerne skal stadig fastgøres på skålens overflade efter 2 min behandlingen.
      4. Aspirere EDTA, løsrive kolonierne ved kraftigt pipettering 10 ml 1x PBS på skålens overflade, og opsamles alle medium og celler i et 50 ml rør.
      5. Der tilsættes 20 ml 1x PBS og centrifugeres ved 200 x g i 4 minutter for at vaske den resterende EDTA ud.
      6. Supernatanten kasseres, og pelletsen suspenderes igen i 3 ml frysemiddel.
      7. Fordel hPSCs jævnt ind i de tre kryovialer, 1 ml hver.
      8. Opbevares ved -80 °C natten over i en kontrolleret frysekasse eller en styrofoam sandwich for at sikre et langsomt temperaturfald, og derefter overføres til en flydende nitrogentank til langtidsopbevaring.

2. Seeding HPSCs at starte differentiering (dag 0)

BEMÆRK: HPSCs skal være klar til differentiering efter at være blevet stabiliseret (dvs. at være delt 2-3x efter optøning). Sørg for, at kolonierne er sunde, med glatte, skinnende kanter og minimal differentiering (Figur 2B).

  1. Forbered kælder membran matrix-belagte retter (24 godt eller 6 godt retter) en dag før dag 0 efter behov. Bring retterne til RT i starten af differentieringen.
  2. Gør dagen 0-1 differentiering medium efter behov.
  3. Aspirer e8 fra det sammenflydende, klar til at splitte hPCS'er, og vask skålen 2x med 1x PBS.
  4. Der tilsættes 7 ml 0,25 M EDTA pr. 100 mm skål, inkuberes ved 37 °C, 5% CO2i 15 min.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt forlænges EDTA-behandlingen for at sprede sig til enkelte celler.
  5. Pipet off alle hPSCs (de skal være flydende) og overføre til en 50 ml rør. Der tilsættes den samme mængde eller mere af 1x PBS som EDTA-opløsning for at udvande EDTA.
  6. Centrifugeved 200 x g i 4 min.
  7. Kassér supernatanten, tilsæt 1 ml dag 0-1 differentieringsmedium og pipet for at homogenisere cellerne. Følg ved at tilføje mere medium og derefter blandes for at fortynde celleopløsningen til en koncentration ideel til at tælle cellerne.
    BEMÆRK: Celleopløsningen må ikke fortyndes for meget. Celler fra en fuld skål på 100 mm skal fortyndes i 5 ml medium til start.
  8. Tæl cellenummeret ved hjælp af en automatiseret celletæller eller hæmocytometer.
  9. Celleopløsningen fortyndes efter behov for at nå 125.000 celler/cm2 i et lavt slutvolumen (f.eks. 2 ml pr. brønd for en 6 brøndskål eller 500 μL pr. brønd for en 24 brøndskål).
    BEMÆRK: En lav lydstyrke hjælper cellerne med at fastgøre hurtigere.
  10. Sug hele kælderenmembranmatrixopløsning enes fra de belagte fade og pladen celleopløsningen ind i brøndene.
  11. Inkuber ved 37 °C i 5% CO2.

3. Neural crest celle induktion (dag 1 til dag 10, Figur 2A)

  1. På dag 1 fodrecellerne med dag 0-1 differentieringmedium (3 ml pr. brønd til 6 brøndretter og 1 ml pr. brønd til 24 brøndretter).
  2. På dag 2 fodrecellerne med dag 2-dages 10 differentieringmedium (3 ml pr. brønd til 6 brøndretter og 1 ml pr. brønd til 24 brøndretter).
  3. Fra nu af skal cellerne fodres hver anden dag indtil dag 10 (dvs. den næste fodringsdag vil være dag 4).
    BEMÆRK: Fra dag 6 skal NC-kamme detekteres (Figur 2B). For at kontrollere, om differentieringen finder sted, anbefales det at have en parallel differentieringskultur i mindre brønde (dvs. 24 brønde), der kan farves for SOX10/AP2a og anvendes til markørgenekspression langs differentieringstidspunktet (figur 2B,C).
  4. Hvis du sorterer celler, skal du fortsætte til afsnit 4. Ellers skal du gå videre til afsnit 5.

4. Fluorescens aktiveret cellesortering (FACS) til neural crest-markør CD49D og sammenlægning af NC-celler i sfæroider

BEMÆRK: Til FACS-sortering skal prøverne opbevares på is og ikke udsættes for lys efter farvning, før sorteringen er blevet sorteret.

  1. Forbered FACS-bufferen, hvis cellerne sorteres.
  2. Forbered dag 10-14 sfæroide medium.
  3. På dag 10 fjernes mediet og vaskes 1x med 1x PBS.
  4. Der tilsættes dissociationsopløsning (se Materialetabel) ved 2 ml pr. brønd for en 6 brøndskål eller 1 ml pr. brønd for en 24 brøndskål og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 20 min.
  5. Pipet off alle hPSCs og overføre til en 50 ml rør.
  6. Resten af røret fyldes op med FACS buffer og centrifugeres ved 200 x g i 4 min.
    BEMÆRK: Hvert 50 ml rør kan rumme op til 20 ml eller mindre celleopløsning. Volumenet af FACS-bufferen skal være højt nok til at neutralisere dissociationsopløsningen.
  7. Supernatanten kasseres, cellerne suspenderes igen med den passende mængde FACS-buffer (~2 ml pr. brønd af en 6 brøndplade) og tal for at bestemme cellenummeret.
  8. Klargør følgende prøver.
    1. Prøve 1 (ubejdset kontrol): 1 x 106 celler i 400 μL FACS-buffer. Cellerne filtreres gennem en 20 μm sihætte, og røret holdes på is.
    2. Prøve 2 (kun DAPI-kontrol): 1 x 106 celler i 400 μL FACS-buffer indeholdende 0,5 ug/ml DAPI. Filtrer cellerne gennem et FACS-rør med en sihætte og hold røret på is.
    3. Prøve 3 (CD49d-mærket): Rekvire resten af cellerne med FACS-buffer indeholdende PE/Cy7-konjugeret CD49D-antistof (5 μL for 1 x 106 celler pr. 100 μL FACS-buffer) suspenderes i et 15 ml rør og inkuberes på is i 20 min.
  9. Rørene fyldes op med FACS buffer og centrifuger ved 200 x g i 4 min.
  10. Supernatanten kasseres, og resuspender hver 5-10 x 106 celler i 1 ml FACS-buffer, der indeholder 0,5 ug/ml DAPI, i henhold til producentens anvisninger.
  11. Cellerne filtreres gennem FACS-røret med sihætten, og røret holdes på is.
  12. Klargør indsamlingen AF FACS-rør, der indeholder 2 ml FACS-buffer.
  13. Sorter gennem FACS maskinen med lasere, der kan detektere DAPI og PE-Cy7 for at isolere CD49D+ populationen.
  14. Når du har sorteret, skal du tælle de sorterede celler.
  15. Alle sorterede celler centrifugeres, og i dag 10-14 sfæroide medium til en endelig koncentration på 0,5 x 106 celler pr. 500 μL medium.
  16. Plade 0,5 x 106 celler pr godt i ultra-lav vedhæftet fil 24 godt plader.
  17. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5 % CO2.

5. Sammenlægning af NC-celler i sfæroider

  1. Hvis der ikke bruger FACS til at isolere NC-cellerne og i stedet samle dem direkte i sfæroider, skal cellerne først forberedes som beskrevet i trin 4.2-4.5.
  2. Resten af røret fyldes med 1x PBS, og centrifugeres ved 200 x g i 4 min.
  3. Supernatanten kasseres, cellerne suspenderes igen med en passende mængde dag 10-14 sfæide medium (f.eks. ~2 ml medium pr. brønd for en 6 brøndplade) og tal for at bestemme celletallet.
  4. Cellerne fortyndes i dag 10-14 sfæroide medium til 0,5 x 106 celler pr. 500 μL medium.
  5. Plade 500 μL af cellesuspensionen pr. brønd i ultralav fastgørelse 24 brøndplader.
  6. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5 % CO2.

6. NC sfæroide vedligeholdelse og sympatisk stamphaminduktion (dag 10 til dag 14, Figur 4A)

  1. Mulighed 1: Minimal sfæroide kultur
    1. På dag 11 tilsættes 500 μL dag 10-14 sfæoidmedium til NC-sfæroiderne uden at aspirere eksisterende medium fra dag 10. Inkuber ved 37 °C i 5% CO2.
    2. På dag 12 vippes pladen for at samle NC-sfæroiderne på den ene side af brøndene. Omhyggeligt aspirat og kassér så meget medium som muligt, og foder med 1 ml dag 10-14 sfæroide medium.
    3. Bliv ved med at fodre cellerne hver dag indtil dag 14.
    4. Valgfrit: Hvis sfænoiderne aggregerer og genererer en stor klump, skal du bruge en pipette til at bryde de sfæroide klumper op. Dette sikrer også, at de enkelte sfæroider ikke bliver for store.
      BEMÆRK: Det ideelle sfæide størrelsesområde bør være ca. 100-500 μm. Inden for dette område, er størrelsen af de enkelte sfæroider ikke kritisk. Morfologien, såsom glatte og klare kanter (figur 3 og figur 6), er imidlertid vigtig for yderligere succes. På dag 14, hver 24 godt plade ideelt indeholder omkring 50-60 sfæroider i forskellige størrelser inden for ovennævnte størrelse rækkevidde.
  2. Mulighed 2: Udvidet sfæroide kultur
    1. På dag 15, for at holde NC sfæroider, foder med 1,5 ml dag 10-14 sfæroide medium indeholder 0,5 μM RA. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2.
      BEMÆRK: RA skal tilsættes frisk til hver fodring og altid opbevares ved -80 °C.
    2. Fra nu af fodres hver anden dag op til dag 28 og derefter fortsætte med plettering af sfæroiderne (punkt 7.1).
      BEMÆRK: De voksende sfæroider er delt ca 1x om ugen ved pipettering dem med en 1 ml pipette til at bryde dem op. De er delt i et omtrentligt forhold på 1:2-1:4. Inden for 2 ugers ekspansionsperiode, cellerne bør omtrent firdoble i antal.

7. SymN-differentiering og modning (mulighed 1: efter dag 14; Mulighed 2: efter dag 28)

  1. Plating sfæroider i regelmæssige retter
    1. Forbered PO/LM/FM-belagte 24 brøndplader.
    2. Der fremstilles symN-medium indeholdende 0,125 μM RA (tilsæt frisk hvert foder) og 10 μM Y27632 (kun dag 14).
    3. På dag 14 vippes pladen for at samle NC-sfæroider på den ene side af brøndene. Omhyggeligt aspirat og kassér så meget medium som muligt, og foder med 1 ml symN medium.
    4. Fjern LM/FN fra de belagte plader.
    5. Split og plade hver brønd fra 24 godt plade i 4 separate brønde af den nye, belagt 24 godt plade. Hver original brønd vil have 1 ml, der indeholder ~ 50-60 sfæroider. Dette giver 250 μL, indeholdende ca. 10-15 sfæroider for hver brønd på den nye plade.
    6. Der tilsættes 250 μL ekstra medium pr. brønd.
      BEMÆRK: Dette er en opdeling på 1:4; sørg for, at sfænoiderne fordeles korrekt i opløsningen, så opdelingen er forholdsvis jævn. Antallet af sfæroider tælles ikke, fordi det endelige tal ikke påvirker succesen med at generere symNs.
    7. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2.
    8. På dag 15 (eller dag 29 for mulighed 2) indføres foderet ved at erstatte alle medier med 1 ml symN-medium indeholdende 0,125 μM RA. Fra nu af, neuronerne bør fodres hver 2 dage indtil dag 20 (eller dag 35 for mulighed 2).
    9. Efter dag 20 (eller dag 35 for mulighed 2) bør neuronerne fodres ved omhyggeligt at erstatte kun halvdelen af det eksisterende medium (500 μL). Fra nu af, foder hver uge, medmindre mediet hurtigt bliver gul.
    10. Bliv ved med at fodre ugentligt indtil det ønskede tidspunkt.
      BEMÆRK: symNs tendens til at samle i gangli-lignende strukturer og er tilbøjelige til at løsrive sig fra kultur retter. For at forhindre dette anbefales halvfodring og minimal håndtering.
  2. Plettering celler til elektrofysiologisk optagelse
    1. Forbered PO/LM/FM-belagt96 brønd elektrofysiologi plader.
    2. Der fremstilles symN-medium indeholdende 0,125 μM RA (tilsæt frisk hvert foder) og 10 μM Y27632 (kun dag 14).
    3. På dag 14, indsamle alle sfænoider, derefter centrifugere dem på 200 x g i 4 min.
    4. Supernatanten kasseres, der tilsættes 2 ml dissociationsopløsning, og overfør blandingen tilbage til en af brøndene på den ultralave fastgørelsesplade. Inkuber ved 37 °C i 5% CO2 i 20-45 min.
      BEMÆRK: Afhængigt af sfænoidernes størrelse kan dissociationsperioden være længere end 20 min. Kontroller cellens dissociation hver 10 min op til 45 min. Eventuelt kan 0,1 mg/ml DNase tilsættes med dissociationsopløsning for at forhindre fri DNA fra døde celler, der gør opløsningen klæbrig. Dette er valgfrit i denne protokol, fordi sfænoider ikke vil samle, når de er fuldt adskilt.
    5. Pipet til fuldt ud at adskille sfænoider, derefter centrifugere ved 200 x g i 4 min.
    6. Overnatanten kasseres, cellerne suspenderes igen med en passende mængde symN-medium, og tæl cellenummeret.
    7. Cellerne plader ved 100.000/cm2 i PO/LM/FN-belagte elektrofysiologbrønde i 200 μL samlet volumen pr. brønd.
    8. På dag 15 (eller dag 29 for mulighed 2) skal du følge de samme fodringsprocesser som i afsnit 7.1. Det samlede volumen efter dag 15 (eller dag 29 for mulighed 2) skal være 300 μL pr. brønd.
    9. Mål de elektriske signaler ved hjælp af en multielektrode array maskine efter dag 20 (eller dag 35 for mulighed 2).
      BEMÆRK: I mulighed 2 kan sfæroider forgyldtnår som helst mellem dag 14-dag 28. De første elektriske signalmålinger kan udføres 1 uge efter plettering af sfænoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol giver vi instruktioner om, hvordan du genererer symNs fra HPSCs. De kulturbetingelser, der blev påvist her, blev forbedret fra en tidligere offentliggjort protokol23,24 (figur 1A) til feederfrie og kemisk definerede betingelser ( figur1B). Der er to muligheder, hvor den ene er lavet inden for 20 dage, og en anden, hvor De Nationale Rådgivende Råd kan udvides i 2 uger for at generere flere celler, som derefter kan differentieres til symNs(Figur 1B, Mulighed 1 og 2).

For korrekt at overvåge symN egenskaber differentierede celler, PHOX2B-eGFP WA09 reporter linje og den forælder WA09 PsCs linje19. Alle differentieringer blev udført i mindst tre biologiske gentagelser, defineret som uafhængige differentieringsforsøg efter mindst én passage og/eller afledt af et friskoptøet hætteglas med celler. Differentiering blev induceret, når sammenløbet af udifferentierede HPSCs nåede 80%-90%. HPSC kolonierne var runde, med skinnende, glatte kanter og lidt at ingen differentiering. Kolonierne må ikke røre hinanden(figur 2B, dag 0). I stedet for typisk dobbelt SMAD hæmning25, som tidligere blev brugt til neurektoderm induktion, TGF-β hæmning kombineret med WNT og BMP4 signalering i de første 2 dage førte til robust udtryk for den tidlige neurale crest markør AP2a. Den neurale crest markør SOX10 blev udtrykt fra dag 4 til dag 10 (Figur 2B). NCC'er opstod i tætte, mørke kamme synlige fra dag 6 på. Disse kamme udtrykt SOX10 (Figur 2B, pile). Det blev tidligere påvist, at SOX10 på NCC-stadiet korrelerer med celleoverflademarkøren CD49D23,,26 og dermed CD49D kan anvendes til at sortere NC-celler, der ikke rapporterer nogen fluorophore fra SOX10 locus. Figur 2C viser udtrykket af NCC markør gener over tid. Figur 2D viser, at vores differentieringseffektivitet var over 80 %. For at bestemme identiteten af de resterende celler blev qRT-PCR brugt til at teste for forurenende celletyper, herunder BryT-ekspresning mesoderm, SOX17-ekspresenelse endoderm, og PAX6-udtrykkende neuroectoderm; alle blev anset for at være fraværende eller udtrykt på meget lave niveauer (data ikke vist; se supplerende tabel 1 for alle primere). Der blev dog fundet ca. SIX1/EYA1+ placode (data, der ikke blev vist), og som kan være kilden til de resterende celletyper. Derudover er det muligt, at de resterende celletyper er NCC-derivater, der allerede er yderligere differentierede. HOX-koden for NCC'erne blev vurderet på nuværende tidspunkt (figur 2E). Men på dette tidlige stadium HOX signaler var meget lav (bemærk skalaen), hvilket tyder på, at disse NCC'er var enten af kraniel-NC karakter eller ikke havde vedtaget nogen NCC undertype karakter endnu.

På dag 10 kunne NCC'erne renses ved hjælp af FACS, hvilket gav ca. 80 % CD49D+ NCC 'er (figur 2D). Et eksempel på en typisk gatingstrategi er angivet i figur 2D. Efter sortering blev cellerne samlet som NC-sfæroider (figur 3A). For at udvide NCC'erne og fremkalde trunk-NC-lignende egenskaber blev cellerne behandlet med en kombination af FGF2 og CHIR. Vi testede, om sortering for CD49D+ befolkningen gav bedre eller renere kulturer symNs senere. Figur 3B sammenligner usorteret versus CD49D+ sorteret versus CD49D- sorterede cellepopulationer. Til venstre kan det ses, at de positive sorterede og usorterede populationer lavet NC sfæroider på en lignende måde, mens de negative sorterede celler ikke samles ordentligt, ikke gøre runde, glat, sundt udseende sfæroider og døde inden for 3-4 dage. Når NC-sfæroiderne blev sammenlignet på dag 14 via qRT-PCR for NC- og symN-sogenitormarkører, kunne der desuden ikke påvises signifikante forskelle mellem sorterede og usorterede celler. Mærkbart, på dette tidspunkt udtryk for sympatiske progenitor markører var stadig lav og SOX10 niveauer forblev høj, hvilket tyder på, at sfæroider stadig var sammensat af celler med NC egenskaber. En dag efter plating (dag 15), både usorterede og CD49D+ sfænoider fastgjort godt til PO / LM / FN retter og neurite udvækst kunne tydeligt observeres(Figur 3B, D15 og Figur 3C, D29). De usorterede og sorterede kulturer blev gennemført videre til dag 35 parallelt, men der sås ingen større forskelle (data blev ikke vist). Det kan således konkluderes, at sorteringstrinnet ikke var afgørende for genereringen af symns, og det er derfor et valgfrit skridt i denne protokol. Men for mindre effektive differentieringer, der ikke giver 80% CD49D+ celler, anbefaler vi sorteringsproceduren.

Dernæst testede vi, om disse NC sfæroider kunne opretholdes uden at miste deres NC identitet(Figur 3A,mulighed 2). NCC'erne blev dyrket som sfæroider i op til 2 uger (Figur 3C). Morfologien på dag 28 sfæroider og belagte celler på dag 29 var ens sammenlignet med dag 14 og 15 celler i mulighed 1. På dag 28 blev SOX10-udtrykket opretholdt på samme niveau som dag 14. Men udtrykket af tidlige sympatiske progenitor markører (dvs. ASCL1, PHOX2B, og GATA3) steg (Figur 3C, højre), hvilket tyder på, at den udvidede kultur i FGF2, WNT, og RA signalering førte til modning og posteriorisering (Figur 4C og F). Lignende virkninger blev tidligere rapporteret af Kirino et al21.

Efter NC ekspansion (mulighed 1 eller mulighed 2), sfæroider blev belagt på PO / LM / FN belagt retter og leveres med flere neurale faktorer til at modne symNs (Figur 4A). På dag 20 og 35 (1 uge efter plettering i henholdsvis mulighed 1 og 2) blev neuriter observeret i et radial mønster, der strækker sig fra de vedlagte sfæroider(figur 4A,højre). Desuden blev markører relateret til noradrenalin (NE) syntese og transport (dvs. TH, AAAD, DBH) udtrykt (figur 4B). Tilstedeværelsen af forurenende celletyper blev undersøgt her igen, og udtryk for ChAT, som kan indikere parasympatiske neuroner, blev fundet (Figur 4B,E). Men, ChAT er også udtrykt i kolinerge symNs. Meget lave niveauer af VIP, en anden parasympatisk markør, blev opdaget (data ikke vist). Desuden blev lave niveauer af BRN3A, ISL1, og RUNX1 opdaget (Figur 4B,E), som kunne indikere enten sensoriske neuroner eller trigeminusneuroner, dvs derivater af placode. Minimal EDNRB (mærkning enteriske neuroner) og OLIG2 (mærkning motorneuroner) blev opdaget (data ikke vist). Identiteten af de ikke-neuronale celler er fortsat uklart. Men baseret på resultater fra vores tidligere symN protokol23,de var mest sandsynligt αSMA+ myofibroblaster. Udtryk for HOX gener blev revurderet, og det blev konstateret, at HOX5-9 blev udtrykt, hvilket tyder på en kuffert identitet. HOX10 (vejledende for sakrale-NC) blev ikke udtrykt (figur 4C, F). Endelig blev der udtrykt modne markører, herunder nicotinic acetylcholinreceptor (CHRNA3/4) og NE-relaterede receptorer, herunder adrenerge receptorer (ADRA2A/B2) NE transporter (NET, SCL6A2) og vesikeltransportør (VMAT1) (figur 4D,G). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i ekspressionen af disse gener i celler, der blev afledt med mulighed 2 sammenlignet medløsningsmodel1 ( figur 4E-G).

Vi bekræftede yderligere vores resultater ved at udføre denne protokol på H9-PHOX2B: GFP reporter linje (Figur 5). På dag 20 dannede cellerne en tæt plæne af neuroner og samlet i klynger med endnu højere tæthed, hvilket indikerer en meget høj differentieringseffektivitet(Figur 5A, øverste række). Farvningen viste, at de fleste symN'er klumper sammen i disse klynger, hvilket gjorde vurderingen og kvantificeringen af den samlede differentieringseffektivitet vanskelig. For at fremhæve farvning og samlokalisering af specifikke symN markører, vi fokuserede på de mindre tætte områder i udkanten af klynger (se gul boks i figur 5A, højre). Det var også her, de fleste forurenende celler var placeret, så det var ikke et godt område at bedømme den samlede effektivitet. Ikke desto mindre, typiske symN markører; herunder periferi (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH og NET1 (udtrykt i prikker langs symN organer og axoner, Figur 5A, bund); blev opdaget. En multielektrode array (MEA) tilgang blev anvendt til at måle elektrisk aktivitet, og det blev konstateret, at dag 20 symNs affyret på omkring 3-5 pigge per sekund i forhold til den negative kontrol af udifferentierede hPSCs (Figur 5B). Det er vigtigt, at cellerne fordeles jævnt i brønden, så hver elektrode (sorte prikker i figur 5B, lyse felt) kan optages korrekt. Dag 20 til dag 30 symNs blev også stimuleret med 1 μM nikotin, som efterligner den præganglioniske signalering af symNs in vivo og øget den gennemsnitlige fyring sats i cellerne. Hæmning af neuronerne blev også målt. β2-adrenerge receptor (ADRB2), placeret på symN axon terminaler, skaber en positiv feedback loop for NE sekresekredi29. Behandling af symNs med 1 μM propranolol (en β2-adrenerge receptor antagonist) hæmmet deres aktivitet(Figur 5C, højre). Disse resultater tyder på, at de symNs genereret af denne protokol var funktionelt aktive.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration og sammenligning af symN differentieringsprotokoller. (A) Tidligere protokol af Zeltner et al.23. (B) Optimeret protokol. Mulighed 1 er 20 dage lang og indeholder kun 4 dage nc sfæroide kultur. Mulighed 2 er 35 dage lang og indeholder en 2 ugers NC sfæroide ekspansionstrin, der tillader produktion af flere NC-celler. VTN = vitronectin, PO = poly-L-ornithin, LM = laminin, FN = fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = retinsyre, AA = ascorbinsyre, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: NC induktion. (A) Tidslinje og behandlinger for NC induktion fra dag 0 til dag 10. (B) Morfologiog dannelse af NC kamme blev overvåget hver 2 dage ved lyse felt mikroskopi. Celler på hvert tidspunkt efter dag 2 blev co-farves for AP2A (rød) og SOX10 (grøn). Alle immunfluorescensbilleder blev imødegået med DAPI. Røde pile angiver strukturerne af kamme. (C) qRT-PCR-analyse for udtryksprofilen af NC-markører fra dag 2-10. dD) Repræsentativ plot af FACS sortering på dag 10 for CD49D+ NC populationer (venstre). En typisk gatingstrategi og isotypekontrol er angivet i de første fire parceller. Kvantificering af CD49D+ celleprocent på dag 10 blev også udført. (E) qRT-PCR analyse for ekspressionsprofilen af HOX gener fra dag 2-10. NC = neurale våbenskjold. Fejllinjer stammer fra data fra n ≥ 3 biologiske gentagelser, defineret som uafhængige differentieringsforsøg udført på separate dage fra PSC-kulturer, der var mindst én adskilt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Neural crest vedligeholdelse og ekspansion. (A) Tidslinje og behandlinger for NC ekspansion i løbet af dag 10 til dag 14 kultur for mulighed 1 eller dag 10 til dag 28 kultur for mulighed 2. (B) NC sfænodedannelse blev overvåget ved lys felt mikroskopi fra dag 11 (1 dag efter sfænodedannelse) til dag 14 (dvs. dagen for plating). Usorterede populationer, CD49D+og CD49D- blev sammenlignet. De belagte celler på dag 15 vises også. Celler undlod at danne sfæroider korrekt i CD49D- gruppe og døde efter plating. Dag 14 celler blev undersøgt ved qRT-PCR analyse (til højre) for udtrykket profil af symN progenitors. Usorterede og CD49D+ populationer blev sammenlignet (n ≥ 3). CC) NC sfænoider kunne opretholdes i op til 2 uger. Sfæroider blev overvåget af lyse felt mikroskopi fra dag 15 til dag 28 (landingsdagen). De belagte celler på dag 29 vises også. Dag 28 sfæroider blev undersøgt ved qRT-PCR analyse for udtryksprofilen af symN progenitors (til højre). Usorterede og CD49D+ populationer blev samlet (n ≥ 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: SymN-differentiering og modning. (A) Tidslinje og behandlinger efter plettering på dag 14 for mulighed 1 eller dag 28 for mulighed 2. Bright felt mikroskopi fotos (til højre) viser symNs på dag 20 og dag 35, henholdsvis (1 uge efter plating for begge muligheder). (B–D) Mulighed 1 qRT-PCR-analyse for udtryksprofilen for symN-egenskaber mellem dag 20-30. Usorterede og CD49D+ populationer blev samlet. (E–G) Mulighed 2 qRT-PCR-analyse for udtryksprofilen for symN-egenskaber efter dag 35. Usorterede og CD49D+ populationer blev samlet (n ≥ 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Funktionel karakterisering af symNs. (A, øverste række) Bright felt billede af symN klynger på dag 20 og farvede billede viser PRPH og TH dobbelt positive celler for det meste placeret i klynger. (A, nederst) Flere symN markører (adskilte kanaler) blev verificeret ved immunfluorescens farvning på dag 20. Noradrenalintransporteren (NET1) var placeret både på overfladen af cellelegemerne samt langs axoner og dendritter. Det viste sig som prikker på denne forstørrelse. Alle immunfluorescensbilleder blev imødegået med DAPI. (B)Repræsentative heatmaps af multielectrode array (MEA) analyse for symNs på dag 20 (top). Det lyse feltbillede (nederst) viser tætheden af symNs og fordelingen af elektroder (otte sorte prikker). Usorteret og CD49D+ populationer blev samlet her. CC) Kvantificering af gennemsnitlige fyringsrater for dag 20-30 symNs under behandlinger af henholdsvis 1 μM nikotin og 1 μM propranolol i 5 min (til højre). Resultater fra usorterede og CD49d-positive populationer blev samlet (n ≥ 3). Ikke-parret, tosidet t-test med Welchs korrektion, p-værdi:*<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på celler under forhold, der ikke er egnede til at gå videre med differentieringen. AA) Tidslinje for differentieringen med hvert kontrolpunkt for cellemorfologier angivet som i B–E. bB) hPSCs (a) med sunde kolonier og en masse differentierede celler og b) fusionerede og differentierede kanter mellem nogle kolonier på dag 0. Røde pile angiver de flettede områder. CC) NCC'er på dag 10 med boblelignende blærer i højderyggene. Røde pile angiver vablerne i den øverste række. Den nederste række repræsenterer en højere forstørrelse. Vi har ikke været i stand til at identificere celleidentiteten af vablerne. Men tilstedeværelsen af flere vabler synes at korrelere med lavere SOX10/CD49D udtryk. (D) Uregelmæssig eider mangler glatte kanter og rund form på dag 14. (E) Usunde og døende symNs på dag 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har for nylig offentliggjort to anmeldelser, en diskuterer brugen af hPSC-afledte symNs for sygdom modellering31 samt en dybtgående sammenligning af tilgængelige differentiering protokoller22. Således, her fokuserer vi på fejlfinding den nuværende protokol for at hjælpe den interesserede forsker lykkes at gøre symNs. Under hele differentieringsprocessen bør kontaminering i alle faser kontrolleres nøje for at opnå ensartede data samt sunde differentierede celler. Ved rutinemæssig hPSC-vedligeholdelse skal mycoplasmatest udføres hver anden gang hver anden uge eller månedligt. Hvis cellesortering udføres på dag 10, er tilsætning af antibiotika til ethvert medie stærkt fremmes. Det er også vigtigt at kontrollere cellemorfologien før og efter start af differentieringen. Her foreslår vi flere kritiske kontrolpunkter (Figur 6A). For det første bør ideelle hPSC kolonier klar til differentiering have lyse og glatte kanter med små pigge. Kolonier med gearlignende pigge er begyndt at differentiere og bør ikke anvendes. Det anbefales stærkt, at celler på det perfekte tidspunkt anvendes med det samme, fordi morfologien kan ændre sig inden for få timer. Hvis cellerne udskydes for blot én dag, kan cellerne gå ned (figur 6B, a) eller føre til kontakt mellem kolonier ( figur6B, b), hvilket stimulerer differentieringen i HPSC'er. Det er udfordrende at slippe af med hver differentieret celle i en kultur, men befolkningen bør kontrolleres til at indeholde færre end 5% af dårlige kolonier. Når du følger denne protokol, er det andet kontrolpunkt under differentiering mellem dag 2 og dag 10. På dette stadium, bør mørke NC kamme være tydeligt observeret under et lyst felt mikroskop (Figur 2C). Tykkelsen og fordelingen af kamme kan bruges som indikatorer for NC effektivitet: Fordi NCC'er hovedsageligt stammer fra celler, der danner kamme, tynde eller mindre udbredte kamme og blærer i kamme kan indikere lav NC produktion, og derfor bør mærkes eller kasseres i tilfælde af inkonsekvente resultater (Figur 6C). RNA-prøvetagning anbefales på det kraftigste på dag 10 for at kontrollere de nc-markører, der er beskrevet ovenfor. Det tredje checkpoint er under NC sfæroide fase, fordi sfæroider kan samle. Det er bedst at periodisk pipet mediet til at bryde op og resuspendere sammenlægningen (celler vil ikke blive spredt tilbage til enkelte celler, men kun små sfæroider). Hvis sfæroider udvide for hurtigt, opdele dem med 1:2 eller 1:4 til at forlade nok plads og næringsstoffer for cellerne til at vokse. Hvis sfæroider ikke har glatte og runde former (Figur 6D), kan det indikere, at NC effektivitet på dag 10 ikke var høj nok, og dermed kan ødelægge den endelige differentiering. Test udtryk profiler for at kontrollere symN progenitor egenskaber anbefales på den ønskede sfæroide plating dag. Det fjerde checkpoint er efter plating sfænoider. Neuriterne skal være klart synlige, og bundterne skal begynde at danne efter dag 20. Celler uden udbredte neuriter og bundter bør betragtes som kontaminering (figur 6E). På dette tidspunkt er det vigtigt at fodre neuronerne ved at erstatte kun halvdelen af det eksisterende medium for at opretholde det nærende miljø skabt af stabile neuroner. Vær forsigtig, når fodring celler, fordi modning symNs er sårbare og kan nemt løsrive. Årsagen til hver af de dårlige udseende morfologier beskrevet her er ikke helt forstået endnu. Det giver dog indsigt i hPSC'ernes følsomme karakter og in vitro-differentiering. En kilde til sådanne uregelmæssigheder kan skyldes reagenser fra forskellige leverandører. For eksempel dukker de tynde kamme med blærer op, når du bruger et andet mærke af BMP4.

For elektrofysiologisk analyse ved hjælp af MEA, for at jævnt distribuere symNs i elektrode brønde, sfæroider er adskilt af Accutase. Behandling tid bør være 20 min til at begynde med. Men fordi sfæroider er meget komprimeret, kan tidspunktet for dissociation øges til 45 min for at sikre sfæroider er fuldt adskilt. Generelt skal hver forsøgsgruppe på en MEA-plade køres i multipla på mindst seks for at opnå ensartede resultater. Især fordi vores tæthed for replating er meget lavere end producentens anbefalinger32 (ca. 500-700.000/cm2),brønden gentagelser er afgørende. I vores resultater dukker både et betydeligt symN-markørudtryk og stabil aktivitet op fra dag 20 til dag 30. Vi anbefaler dette som det bedste tidspunkt at begynde at optage de foretrukne variabler. For hver differentiering skal mediet gøres friskt og anvendes så hurtigt som muligt (ikke længere end en måned).

SymN differentieringsprotokollen, der præsenteres her, er feeder-fri, kemisk defineret, effektiv, udvidelig og giver funktionelle symNs dag 20. Denne definerede symN differentiering protokol kunne bruges til at studere menneskelige lidelser i det sympatiske nervesystem, som en platform for narkotika screening, for tumorigenesis undersøgelser såsom neuroblastoma/fæokromocytom, eller for grundforskning i homostatisk regulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Heidi Ulrichs for kritisk læsning og redigering af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Tags

Udviklingsbiologi menneskelige pluripotente stamceller neurale crest sympatiske neuroner autonome nervesystem sympatisk nervesystem feeder-fri kemisk defineret stamcellekultur
Effektiv differentiering af postganglioniske sympatiske neuroner ved hjælp af humane pluripotente stamceller under Feeder-fri og kemisk definerede kulturbetingelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient… More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter