Summary
In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn uitgegroeid tot een krachtig instrument voor ziekte modellering en de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling in vitro. We presenteerden eerder een differentiatieprotocol voor de afleiding van autonome neuronen met sympathiek karakter dat is toegepast op patiënten met autonome neuropathie. Het protocol werd echter gebouwd op Knock Out Serum Replacement (KSR) en op feeder gebaseerde cultuuromstandigheden, en om een hoge differentiatie-efficiëntie te garanderen, was celsortering noodzakelijk. Deze factoren veroorzaken een hoge variabiliteit, hoge kosten en een lage reproduceerbaarheid. Bovendien zijn volwassen sympathieke eigenschappen, waaronder elektrische activiteit, niet geverifieerd. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarbij PSC-cultuur en differentiatie worden uitgevoerd in feedervrije en chemisch gedefinieerde cultuuromstandigheden. Genetische markers die hoofdwapen identificeren, worden geïdentificeerd. Verdere differentiatie in postganglionic sympathieke neuronen wordt bereikt na 20 dagen zonder de noodzaak voor celsortering. Elektrofysiologische opname toont verder de functionele neuron identiteit. Afvuren gedetecteerd van onze gedifferentieerde neuronen kan worden versterkt door nicotine en onderdrukt door de adrenerge receptor antagonist propranolol. Intermediaire sympathische neurale voorouders in dit protocol kunnen tot 2 weken worden gehandhaafd als neurale sferoïden, waardoor de culturen kunnen worden uitgebreid. Kortom, onze bijgewerkte sympathische neuron differentiatie protocol toont een hoge differentiatie efficiëntie, betere reproduceerbaarheid, meer flexibiliteit, en een betere neurale rijping in vergelijking met de vorige versie. Dit protocol zal onderzoekers voorzien van de cellen die nodig zijn om menselijke aandoeningen te bestuderen die het autonome zenuwstelsel beïnvloeden.
Introduction
Postganglionic sympathische neuronen (symNs) behoren tot het autonome zenuwstelsel (ANS) en hebben meerdere belangrijke rollen in het reageren en reguleren van homeostase van het lichaam onafhankelijk van bewustzijn. Stress stimuleert bijvoorbeeld symnen en roept de vecht-of-vluchtrespons op die leidt tot een toename van hartslag, bloeddruk en zweten. Symns worden beïnvloed in veelvoudige menselijke wanorde toe te schrijven aan genetica, giftigheid/verwonding, of als metgezellen aan andere ziekten. Een voorbeeld van een genetische neuropathie is de kinderziekte Familiale Dysautonomia (FD), waar een ernstige dysregulatie van symns dysautonome crisis veroorzaakt, duidelijk door zweten, vlekken van de huid, braken aanvallen, hypertensie, en angst1. Een voorbeeld van toxiciteit is chemotherapie behandeling, waarvan is gemeld dat toxische bijwerkingen hebben op autonome neuronen2. Het is bekend dat autonome denerhonger en hyper-innervatie beide kunnen leiden tot, of begeleiden, ziekten zoals de ziekte van Parkinson of hypertensieve nierziekte3,4. Dus, in staat zijn om onderzoek te doen en de mechanismen van symN biologie en gebreken in de context van de ziekte te begrijpen is gunstig voor het zoeken naar nieuwe en effectieve behandelingen.
Anatomie
Het perifere zenuwstelsel vertakt zich in zintuiglijke en autonome divisies. De afferente zenuwen van het zintuiglijke zenuwstelsel zijn verantwoordelijk voor het gevoel van pijn en aanraking, terwijl de ANS verantwoordelijk is voor het doorgeven van informatie van alle organen naar de hersenen. Het ANS is verdeeld in het enterische zenuwstelsel, waarbij het maag-darmkanaal, het parasympathische zenuwstelsel, dat belangrijk is voor ontspanning, en het sympathische zenuwstelsel (SNS), dat belangrijk is voor activering/regulatie van organen. De SNS past een twee-neuron systeem5. Preganglionic sympathische neurale axonen in het ruggenmerg eerste project aan de sympathische ganglia, waar postganglionic symN cel lichamen bevinden. Deze neuronen sturen dan lange projecties om de doelweefsels van elk orgaan in het lichaam innervate. Signalen overgedragen door preganglionic neuronen zijn cholinerge, terwijl postganglionic symNs zijn adrenergic en dus express noradrenaline (NE) als hun belangrijkste neurotransmitter. Er zijn enkele opmerkelijke uitzonderingen van postganglionic, sympathische neuronen die cholinerg zijn, met inbegrip van degenen innervating bloedvaten. Adrenerge postganglionic neuronen uitdrukken de enzymen tyrosine hydroxylase (TH), aromatische L-aminozuur decarboxylase (AAAD), dopamine β-hydroxylase (DBH), en monoamine oxidase (MAO-A), allemaal verantwoordelijk voor het genereren en metaboliseren NE. Voorts drukken zij de NE-recyclingtransporters en/of receptoren α-adrenerge receptor (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalinetransporter (NET1) en vesiculaire monoaminetransporter (VMAT1/2) uit.
Ontwikkeling
Tijdens de embryonale ontwikkeling symNs zijn afgeleid van de neurale crest (NC), die ontstaat tussen de neurale buis en overlaying ectoderm6, en kan zich onderscheiden in meerdere celgeslachten, met inbegrip van melanocyten, osteoblasten, adipocyten, glia, enterische neuronen, sensorische neuronen, en autonome neuronen7. Neurale crest cellen (NPC's) zijn zeer migrerende cellen die verschillende routes door het embryo. In dit vroege stadium van nc-ontwikkeling drukken de cellen de markers SNAIL1/2, FOXD3 en SOX108,9,10,11uit . De migratieroute bepaalt samen met de axiale locatie die ze aannemen het NC-subtype waarin ze zich zullen ontwikkelen. Deze NC-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun specifieke HOX-genexpressie: CranialN NPC's drukken geen HOX-genen uit, vagalNcc's express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9 en sacrale NPC's express HOX 10–1112. Onder hen, stam NPC's worden erkend als de belangrijkste bron van symNen. SymN precursoren uiten de transcriptiefactor MASH1/ASCL113, die de expressie van PHOX2B14 en INSM115bevordert . De GATA familie van transcriptie factoren wordt uitgedrukt tijdens de late sympathische ontwikkeling. GATA2 en GATA3 worden uitgedrukt in de symNs, die op hun beurt activeert DBH16. De transcriptiefactor HAND2 is ook belangrijk voor de expressie en het onderhoud van DBH en TH17.
HPSCs (bijvoorbeeld embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) zijn een krachtig instrument18 om ontwikkelingsparadigma's te recapituleren en symNs te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering van verschillende menselijke aandoeningen. Het genereren van symnen uit hPSCs is dus van cruciaal belang om ontwikkelingsrichtlijnen te volgen en de expressie van geschikte markeringen langs het differentiatieproces te beoordelen.
Vorig symN-protocol
Weinig onderzoeksgroepen hebben eerder gemeld de generatie van symN's van hPSCs19,20,21. De directe vergelijking van deze protocollen met elkaar en de onze werd onlangs herzien22. In 201623, publiceerden we een differentiatie protocol voor het genereren van autonome neuronen met symN karakter (Figuur 1A). Dit protocol gebruikte KSR-gebaseerd medium, dat werd gebruikt bij zowel het onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs als celdifferentiatie. Bovendien werden hPSC's gehandhaafd op embryonale fibroblasten van muizen (MEF-feedercellen). We gebruikten dit protocol en PSC's van patiënten met FD om de aandoening 23 temodelleren. In 2019 beschreven we een meer gedetailleerde versie van dit oudere protocol24. Samengevat werd het neurale lot veroorzaakt door dubbele SMAD-remming25 om TGF-β en BMP-signalering in de eerste 2 dagen te blokkeren. WNT activering met chir99021 bevorderd neurale voorlopers om NC-cellen te worden. Op dag 11 werden cellen gesorteerd door FACS voor CD49D+ of SOX10+ populaties26,23, wat ongeveer 40% NC-generatie efficiëntie opleverde. Zo was sorteren nodig om de efficiëntie en zuiverheid voor de volgende stappen van differentiatie te waarborgen. De NPC's werden gehandhaafd en versterkt als sferoïden met de gecombineerde behandeling van FGF2 en CHIR. Na 4 dagen werden de NC sferoïden van onderhoud verguld en kregen BDNF, GDNF en NGF de symN rijping te voltooien. Hoewel deze symN's sterke symN-markers zoals ASCL1, TH, DBH en PHOX2A uitten, waren markers voor meer volwassen symnen, inclusief expressie van de nicotinische acetylcholine-receptor (CHRNA3/CHRNB4) en blaastransporter (VMAT1/2), laag, zelfs na 70 dagen differentiatie. HOX-genen in dit protocol werden niet formeel getest en volwassen neurale eigenschappen, waaronder elektrofysiologische activiteit van de cellen, werden niet geverifieerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van symNs (figuur 1B). HPSC's worden onderhouden in feeder-vrije omstandigheden, op vitronectine (VTN)-gecoate gerechten, met behulp van Essential 8 (E8) media27. De formule van de differentiatiemedia is in elk stadium gewijzigd, waardoor het percentage van de NC-populatie28is verhoogd. De symN rijping kan worden gedaan op CD49D+/ SOX10+ gesorteerdof ongesorteerde bulk NCC populaties. Beide tonen hoge niveaus van symN marker expressie door dag 30. Bovendien reageren de symnen die met dit protocol worden gegenereerd, op elektrofysiologische opname en op behandelingen met symN-activator- en inhibitorverbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De H9 PHOX2B:GFP reporter lijn werd geleverd door Oh et al.19. Sommige qPCR primers gebruikt in dit papier werden verkregen van OriGene Technologies, terwijl een paar sequenties worden verkregen uit Frith et al.20,30.
1. Opstelling voor schotelcoating, mediavoorbereiding en hPSC-onderhoud
- De laag van de schotel
-
Vitronectine (VTN) coating
- Plaats flesjes VTN in een waterbad van 37 °C tot het volledig ontdooid is en meng vervolgens goed.
- Meng voor een petrischaal van 100 mm 7 mL van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5 mg/mL VTN, voeg VTN-oplossing toe aan de schotel en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur.
-
Kelder membraan matrix coating
- Ontdooi flacons van keldermembraanmatrix (zie Tabel van Materialen)op ijs bij 4 °C 's nachts.
- Voor een put van een 6 put plaat, meng 2 mL van DMEM/F12 met 20 μL van 100x kelder membraan matrix, voeg kelder membraan matrix oplossing aan de schotel, wikkel de schotel met paraffine film, en op te slaan in een schone container op 4 °C 's nachts. Werk zo snel mogelijk. Gecoate gerechten kunnen maximaal 2 weken in 4 °C worden bewaard.
-
Polyornithine (PO)/lamine (LM)/fibronectine (FN) coating
- Meng op de eerste dag voor één put van een 24-put plaat 15 μg/mL PO met 1 mL van 1x PBS, incubeer bij 37 °C, 5% CO2 's nachts. Ontdooi zowel LM als FN bij -20 °C 's nachts en bewaar bij 4 °C tot volledig ontdooid.
- Op de tweede dag, aanzuigen PO oplossing, was de putten 2x met 1x PBS, voeg 1 mL van 1x PBS met 2 μg/mL van LM en 2 μg/mL van FN en incubeer bij 37 °C in 5% CO2 's nachts. Op dit punt kan de schotel met de LM/FN-oplossing maandenlang in de couveuse worden bewaard zolang het niet uitdroogt. Voeg meer 1x PBS toe om te voorkomen dat de schotel uitdroogt.
-
Vitronectine (VTN) coating
- Mediavoorbereiding
-
Bereid het Essential 8 medium (E8) voor door één fles E8-supplement bij 4 °C 's nachts te ontdooien. Meng het supplement met 500 mL E8 medium en antibiotica indien nodig.
LET OP: Werkende E8-oplossing moet binnen 2 weken worden opgebruikt. - Bereid het hPSC vriesmedium voor door 90 mL compleet E8-medium te mengen met 10 mL DMSO voor een totaal volume van 100 mL. Filter steriliseren.
- Bereid het dag0 tot dag 1 differentiatiemedium voor door 100 mL van essentieel 6 (E6) medium te mengen met 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 en 10 μM Y27632 voor een totaal volume van 100 mL.
- Bereid het dag 2 tot dag 10 differentiatiemedium voor door 100 mL E6-medium te mengen met 10 μM SB en 0,75 μM CHIR99021 voor een totaal volume van 100 mL.
- Bereid de dag 10 tot dag 14 sferoïde medium door het mengen van neurobasaal medium met 2 mL van B27 (50x), 1 mL van N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 μM CHIR99021, en 10 ng/mL FGF2 voor een totaal volume van 100 mL.
-
Bereid de dag 14 tot en met dag 28 medium voor sferoïde onderhoud op lange termijn door 0,5 μM verse RA toe te voegen aan de dag 10 tot dag 14 sferoïde medium voor elke voeding.
LET OP: Houd RA altijd op -80 °C. - Bereid het Rijpingsmedium van SymN voor door neurobasaal medium te mengen met 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-glutamaat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM ascorbiczuur en 0,2 mM dbcAMP voor een totaal volume van 100 mL. De oplossing moet binnen 2 weken worden gebruikt. Voeg voor elke voeding 0,125 μM verse RA toe. Deze oplossing wordt gebruikt vanaf dag 14 (optie 1) of dag 28 (optie 2).
- Bereid de FACS-buffer voor door DMEM te mengen met 2% FBS, 2 mM L-glutamaat en antibiotica indien nodig voor een totaal volume van 100 mL.
-
Bereid het Essential 8 medium (E8) voor door één fles E8-supplement bij 4 °C 's nachts te ontdooien. Meng het supplement met 500 mL E8 medium en antibiotica indien nodig.
- hPSC-onderhoud
- HPSC's ontdooien en bewaren
- Bereid een VTN gecoate 100 mm schotel.
- Om een flesje hPSC's rechtstreeks van vloeibare stikstof te ontdooien, plaatst u de flacon in een waterbad van 37 °C en slingert u de buis voorzichtig in het water tot het ontdooit. Breng de ontdooide hPSCs over op een buis van 15 mL met 10 mL van 1x PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
- Gooi de supernatant weg en voeg 1 mL E8 medium toe aan de buis. Pipetteer een paar keer om de pellet volledig opnieuw op te schorten en voeg vervolgens nog eens 9 mL E8 medium toe om in totaal 10 mL te bereiken.
- Vermeer de VTN-oplossing uit de 100 mm schaal.
- Breng de hPSCs naar een schaal van 100 mm, schud zachtjes (omhoog en links-rechts, niet in cirkels) om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig worden verdeeld in de schotel
- Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.
- Op de volgende dag, aanzuigen alle medium en voer met 10 mL van E8.
- Voer op deze manier elke dag voor de komende 3-4 dagen en vervolgens voor te bereiden om te splitsen.
- HPSCs splitsen
LET OP: hPSCs op het punt van splitsing moet 80%-90% confluent. Grote kolonies met gladde en heldere randen moeten worden waargenomen. Het contact tussen elke kolonie moet echter worden vermeden(figuur 2B,dag 0 en figuur 6B).- Bereid vtn-gecoate 100 mm gerechten als dat nodig is.
- Aanzuig de E8 aan en was de schaal die 1x gesplitst moet worden met 1x PBS.
- Aangezogen de 1x PBS en voeg 4 mL van 0,25 M EDTA. Incubatie gedurende 2 min bij 37 °C, 5% CO2.
LET OP: De hPSCs moeten worden gesplitst / opnieuw worden geplated als kleine kolonies. Behandel met EDTA niet langer dan 2 min om scheiding in enkele cellen te voorkomen. De cellen moeten na de behandeling van 2 min nog steeds aan het schoteloppervlak worden bevestigd. - Aangezogen de EDTA, los de kolonies door sterk pipetteren 10 mL van E8 medium op de schotel oppervlak, en het verzamelen van alle medium en cellen in een 15 mL buis.
- Met hPSCs op 80%-90% samenvloeiing, split kolonies door 1:15-1:20. Als u bijvoorbeeld hPSCs tegen 1:20 in één schotel van 100 mm wilt splitsen, neemt u 500 μL E8/hPSCs-oplossing en mengt u met 9,5 mL vers E8-medium.
- Plate hPSC's in vtn-gecoate 100 mm gerechten.
OPMERKING: Het wordt aangeraden om de ideale splitratio voor elke onderzoeker en cellijn onafhankelijk vast te stellen.
- Bevriezing van hPSCs
- Voor een 100 mm schotel van hPSCs die klaar is om te worden gesplitst, bereiden drie cryovials en 3,5 mL van bevriezing medium.
LET OP: Media en flacons moeten in 4 °C of op ijs worden bewaard tot het gebruik. - Aangezogen E8 en was de schotel 2x met 1x PBS.
- Aanzuigen 1x PBS en voeg 4 mL van 0,25 M EDTA, incubeer gedurende 2 min bij 37 °C, in 5% CO2.
OPMERKING: hPSCs moeten worden ingevroren als kleine kolonies op het moment dat ze zouden worden gesplitst. Behandel de cellen met EDTA niet langer dan 2 min om scheiding in enkele cellen te voorkomen. Cellen moeten na de behandeling van 2 min nog steeds op het oppervlak van de schotel worden bevestigd. - Aangezogen de EDTA, los de kolonies door sterk pipetteren 10 mL van 1x PBS op het oppervlak van de schotel, en verzamel alle medium en cellen in een 50 mL buis.
- Voeg 20 mL van 1x PBS toe en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min om de resterende EDTA uit te wassen.
- Gooi de supernatant weg en stouw de pellet opnieuw in 3 mL vriesmiddel.
- Verdeel hPSCs gelijkmatig in de drie cryovials, 1 mL per stuk.
- Bewaar 's nachts bij -80 °C in een gecontroleerde vriesdoos of een broodje piepschuim om een langzame temperatuurdaling te garanderen en vervolgens over te dragen aan een vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag.
- Voor een 100 mm schotel van hPSCs die klaar is om te worden gesplitst, bereiden drie cryovials en 3,5 mL van bevriezing medium.
- HPSC's ontdooien en bewaren
2. Zaaiende hPSCs om de differentiatie te starten (dag 0)
OPMERKING: hPSCs moeten klaar zijn voor differentiatie na stabilisatie (d.w.z. 2-3x worden gesplitst na ontdooien). Zorg ervoor dat de kolonies gezond zijn, met gladde, glanzende randen en minimale differentiatie(figuur 2B).
- Bereid kelder membraan matrix-gecoate gerechten (24 goed of 6 goed gerechten) een dag voor dag 0 als dat nodig is. Breng de gerechten naar RT aan het begin van differentiatie.
- Maak de dag 0-1 differentiatie medium als dat nodig is.
- Aangezogen de E8 van de confluent, klaar om hPCSs splitsen, en was de schotel 2x met 1x PBS.
- Voeg 7 mL van 0,25 M EDTA per schaal van 100 mm toe, incubeer bij 37 °C, 5% CO2, gedurende 15 min.
OPMERKING: Op dit punt wordt de EDTA-behandeling verlengd om zich in enkele cellen te verspreiden. - Pipet uit alle hPSCs (ze moeten drijven) en over te dragen aan een 50 mL buis. Voeg dezelfde hoeveelheid of meer van 1x PBS toe als EDTA-oplossing om de EDTA te verdunnen.
- Centrifugeer op 200 x g voor 4 min.
- Gooi de supernatant weg, voeg 1 mL van dag 0-1 differentiatiemedium en pipet toe om de cellen te homogeniseren. Volg door het toevoegen van meer medium en vervolgens mengen om de celoplossing te verdunnen tot een concentratie ideaal om de cellen te tellen.
LET OP: Oververdun de celoplossing niet. Cellen van een volledige 100 mm schotel moeten worden verdund in 5 mL van medium om te beginnen. - Tel het celnummer met behulp van een geautomatiseerd celteller of hemocytometer.
- Verdun de celoplossing indien nodig om 125.000 cellen/cm2 te bereiken in een laag eindvolume (bijvoorbeeld 2 mL per put voor een 6-putschaal of 500 μL per put voor een 24-putschaal).
LET OP: Een laag volume helpt de cellen sneller te hechten. - Aangezogen alle kelder membraan matrix oplossing van de gecoate gerechten en plaat de cel oplossing in de putten.
- Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.
3. Neurale crest cell inductie (dag 1 tot dag 10, Figuur 2A)
- Op dag 1 voer de cellen met dag 0-1 differentiatie medium (3 mL per put voor 6 goed gerechten en 1 mL per put voor 24 goed gerechten).
- Op dag 2 voeden de cellen met dag 2-dag 10 differentiatie medium (3 mL per goed voor 6 goed gerechten en 1 mL per goed voor 24 goed gerechten).
- Vanaf nu moeten de cellen om de dag worden gevoed tot dag 10 (d.w.z. de volgende voederdag zal dag 4 zijn).
OPMERKING: Vanaf dag 6 moeten NC-ribbels worden gedetecteerd (figuur 2B). Om te controleren of differentiatie plaatsvindt, wordt geadviseerd om een parallelle differentiatiecultuur in kleinere putten (d.w.z. 24 putten) te dragen, die voor SOX10/AP2a kunnen worden gekleurd en gebruikt voor markergenexpressie gedurende de tijd van differentiatie (Figuur 2B,C). - Als u cellen sorteert, gaat u door naar sectie 4. Ga anders naar sectie 5.
4. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor neurale crest marker CD49D en aggregerenDE NC-cellen in sferoïden
OPMERKING: Voor FACS-sortering mogen de monsters op ijs worden gehouden en mogen zij niet aan licht worden blootgesteld na het bevlekken tot het sorteren.
- Bereid de FACS-buffer voor als de cellen worden gesorteerd.
- Bereid dag 10-14 sferoïde medium.
- Verwijder op dag 10 het medium en was 1x met 1x PBS.
- Voeg dissociatieoplossing (zie Materiaaltafel)bij 2 mL per put toe voor een 6-putschaal of 1 mL per put voor een 24-putschotel en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 voor 20 min.
- Pipet uit alle hPSCs en over te dragen aan een 50 mL buis.
- Vul de rest van de buis met FACS buffer en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
LET OP: Elke 50 mL buis is geschikt voor maximaal 20 mL of minder van de cel oplossing. Het volume van de FACS-buffer moet hoog genoeg zijn om de dissociatieoplossing te neutraliseren. - Gooi de supernatant, resuspend de cellen met de juiste hoeveelheid FACS buffer (~ 2 mL per put van een 6 goed plaat), en tellen om het celnummer te bepalen.
- Bereid de volgende monsters voor.
- Monster 1 (onbevlekte controle): 1 x 106 cellen in 400 μL FACS buffer. Filtreer de cellen door een zeefkap van 20 μm en houd de buis op ijs.
- Monster 2 (Alleen DAPI-besturing): 1 x 106 cellen in 400 μL FACS-buffer met 0,5 ug/mL DAPI. Filtreer de cellen door een FACS-buis met een zeefkap en houd de buis op ijs.
- Monster 3 (CD49d-label): Hang de rest van de cellen op met FACS-buffer met PE/Cy7-geconjugeerde CD49D-antilichamen (5 μL voor 1 x 106 cellen per 100 μL FACS-buffer) in een buis van 15 mL en incubeer op ijs gedurende 20 min.
- Vul de buizen met FACS buffer en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
- Gooi de supernatant weg en suspend elke 5-10 x 106 cellen in 1 mL FACS-buffer met 0,5 ug/mL DAPI volgens de instructies van de fabrikant.
- Filtreer de cellen door de FACS-buis met de zeefkap en houd de buis op ijs.
- Bereid de FACS-buizen met 2 mL FACS-buffer voor.
- Sorteer de FACS-machine met lasers die DAPI en PE-Cy7 kunnen detecteren om de CD49D+ populatie te isoleren.
- Na het sorteren, tel de gesorteerde cellen.
- Centrifugeer alle gesorteerde cellen en resuspend in dag 10-14 sferoïde medium tot een definitieve concentratie van 0,5 x 106 cellen per 500 μL medium.
- Plaat 0,5 x 106 cellen per put in ultra-lage bevestiging 24 goed platen.
- De cellen uitbroeden bij 37 °C, in 5% CO2.
5.
- Als u FACS niet gebruikt om de NC-cellen te isoleren en ze in plaats daarvan rechtstreeks in sferoïden te aggregeren, bereid dan eerst cellen voor zoals beschreven in stappen 4.2–4.5.
- Vul de rest van de buis met 1x PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
- Gooi de supernatant weg, schort de cellen opnieuw op met een geschikte hoeveelheid dag 10-14 sferoïde medium (bijvoorbeeld ~ 2 mL medium per put voor een 6-putplaat) en tel om het celnummer te bepalen.
- Verdun de cellen in dag 10-14 sferoïde medium tot 0,5 x 106 cellen per 500 μL medium.
- Plaat 500 μL van de celvering per put in ultra-lage bevestiging 24 goed platen.
- De cellen uitbroeden bij 37 °C, in 5% CO2.
6. NC sferoïde onderhoud en sympathische progenitor inductie (dag 10 tot dag 14, figuur 4A)
-
Optie 1: Minimale sferoïde cultuur
- Voeg op dag 11 500 μL van dag 10-14 sferoïde medium toe aan de NC-sferoïden zonder bestaand medium vanaf dag 10 te aspreeren. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.
- Op dag 12, kantel de plaat om de NC sferoïden accumuleren aan de ene kant van de putten. Spoel voorzichtig aan en gooi zoveel mogelijk medium weg, en voer met 1 mL van dag 10-14 sferoïde medium.
- Blijf de cellen elke dag voeden tot dag 14.
- Optioneel: Als de sferoïden samengaan en een grote klomp genereren, gebruik dan een pipet om de sferoïde klonters te breken. Dit zorgt er ook voor dat individuele sferoïden niet te groot worden.
LET OP: Het ideale sferoïde bereik moet ongeveer 100-500 μm liggen. Binnen dat bereik is de grootte van individuele sferoïden niet kritiek. De morfologie, zoals een gladde en heldere randen (figuur 3 en figuur 6) is echter belangrijk voor verder succes. Op dag 14, elke 24 goed plaat idealiter bevat ongeveer 50-60 sferoïden van verschillende grootte binnen de bovengenoemde grootte bereik.
-
Optie 2: Uitgebreide sferoïde cultuur
- Op dag 15, om NC sferoïden te houden, voer met 1,5 mL van dag 10-14 sferoïde medium met 0,5 μM RA. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
LET OP: RA moet vers worden toegevoegd voor elke voeding en altijd worden opgeslagen bij -80 °C. - Voer voortaan om de dag tot dag 28 en ga dan verder met het beplaten van de sferoïden (punt 7.1).
LET OP: De groeiende sferoïden worden ongeveer 1x per week gesplitst door ze te pipetteren met een 1 mL pipet om ze op te breken. Ze worden gesplitst bij een geschatte verhouding van 1:2–1:4. Binnen de uitbreidingsperiode van 2 weken moeten de cellen ongeveer verviervoudigen in aantal.
- Op dag 15, om NC sferoïden te houden, voer met 1,5 mL van dag 10-14 sferoïde medium met 0,5 μM RA. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
7. SymN differentiatie en rijping (optie 1: na dag 14; Optie 2: na dag 28)
- Plating sferoïden in reguliere gerechten
- Bereid PO/LM/FM-gecoate 24 putplaten voor.
- Bereid symN medium met 0,125 μM RA (voeg vers elke feed) en 10 μM Y27632 (alleen dag 14).
- Op dag 14, kantel de plaat om NC sferoïden accumuleren aan de ene kant van de putten. Spoel voorzichtig aan en gooi zoveel mogelijk medium weg, en voer met 1 mL symN medium.
- Verwijder LM/FN van de gecoate platen.
- Split en plaat elk goed van de 24 goed plaat in 4 aparte putten van de nieuwe, gecoate 24 goed plaat. Elke originele put zal 1 mL hebben, met ~50-60 sferoïden. Dit levert 250 μL op, met ongeveer 10-15 sferoïden voor elke put op de nieuwe plaat.
- Voeg 250 μL extra medium per put toe.
LET OP: Dit is een splitsing van 1:4; zorg ervoor dat de sferoïden goed binnen de oplossing worden verdeeld, zodat de splitsing relatief gelijkmatig is. Het aantal sferoïden wordt niet meegeteld omdat het uiteindelijke aantal geen invloed heeft op het succes van het genereren van symN's. - Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
- Op dag 15 (of dag 29 voor optie 2) u alle mediums vervangen door 1 mL symN medium met 0,125 μM RA. Vanaf nu moeten de neuronen elke 2 dagen worden gevoed tot dag 20 (of dag 35 voor optie 2).
- Na dag 20 (of dag 35 voor optie 2) moeten de neuronen worden gevoed door slechts de helft van het bestaande medium (500 μL) zorgvuldig te vervangen. Vanaf nu, voeden elke week, tenzij het medium snel geel wordt.
- Blijf wekelijks voeden tot het gewenste tijdstip.
OPMERKING: symns hebben de neiging om samen te voegen in ganglia-achtige structuren en zijn geneigd om los te komen van de cultuur gerechten. Om dit te voorkomen, wordt halfvoeding en minimale handling aanbevolen.
- Platingcellen voor elektrofysiologische opname
- Bereid PO/LM/FM-gecoate 96 goed elektrofysiologie platen.
- Bereid symN medium met 0,125 μM RA (voeg vers elke feed) en 10 μM Y27632 (alleen dag 14).
- Verzamel op dag 14 alle sferoïden en centrifugeer ze vervolgens op 200 x g gedurende 4 min.
- Gooi de supernatant weg, voeg 2 mL dissociatieoplossing toe en breng het mengsel terug naar een van de putten van de ultralage bevestigingsplaat. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2 voor 20-45 min.
OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de sferoïden kan de dissociatieperiode langer zijn dan 20 min. Controleer de dissociatie van de cel elke 10 min tot 45 min. Optioneel kan 0,1 mg/mL van DNase worden toegevoegd met dissociatieoplossing om te voorkomen dat vrij DNA van dode cellen de kleverige oplossing maakt. Dit is optioneel in dit protocol omdat de sferoïden niet zullen samengaan zodra ze volledig gescheiden zijn. - Pipet om de sferoïden volledig te scheiden en centrifugeer vervolgens op 200 x g gedurende 4 min.
- Gooi de supernatant weg, schort de cellen opnieuw op met de juiste hoeveelheid symN-medium en tel het celnummer.
- Verguld de cellen op 100.000/cm2 in PO/LM/FN-gecoate elektrofysiologieputten in 200 μL totaal volume per put.
- Volg op dag 15 (of dag 29 voor optie 2) dezelfde voerprocessen als in punt 7.1. Het totale volume na dag 15 (of dag 29 voor optie 2) moet 300 μL per put zijn.
- Meet de elektrische signalen met behulp van een multi-elektrode array machine na dag 20 (of dag 35 voor optie 2).
OPMERKING: In optie 2 kunnen sferoïden op elk moment worden verguld tussen dag 14-dag 28. De eerste metingen van elektrische signalen kunnen 1 week na het beplaten van de sferoïden worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol geven we instructies over het genereren van symns van hPSCs. De hier aangetoonde cultuuromstandigheden werden verbeterd van een eerder gepubliceerd protocol23,24 (figuur 1A) tot feedervrije en chemisch gedefinieerde omstandigheden ( figuur1B). Er zijn twee opties beschikbaar, een waarbij symnen binnen 20 dagen worden gemaakt, en een andere waar de NPC's gedurende 2 weken kunnen worden uitgebreid om meer cellen te genereren die vervolgens kunnen worden gedifferentieerd in symNs (figuur 1B, optie 1 en 2).
Om de symN-kenmerken van gedifferentieerde cellen goed te controleren, geven de PHOX2B-eGFP WA09 reporterlijn en de bovenliggende WA09 PSCs-lijn19. Alle differentiaties werden uitgevoerd in ten minste drie biologische herhalingen, gedefinieerd als onafhankelijke differentiatieexperimenten na ten minste één passage en/of afgeleid van een vers ontdooide flacon van cellen. Differentiatie werd veroorzaakt toen de samenvloeiing van ongedifferentieerde hPSC's 80%-90% bereikte. De hPSC kolonies waren rond, met glanzende, gladde randen en weinig tot geen differentiatie. De kolonies mogen elkaar niet aanraken (Figuur 2B, dag 0). In plaats van typische dubbele SMAD remming25, die eerder werd gebruikt voor neurectoderm inductie, TGF-β remming in combinatie met WNT en BMP4 signalering in de eerste 2 dagen leidde tot robuuste expressie van de vroege neurale crest marker AP2a. De neurale crest marker SOX10 werd uitgedrukt van dag 4 tot dag 10 (Figuur 2B). Nccs ontstonden in dichte, verduisterde richels zichtbaar vanaf dag 6. Deze richels uitgedrukt SOX10 (Figuur 2B, pijlen). Eerder werd aangetoond dat SOX10 in het NCC-stadium correleert met de celoppervlaktemarker CD49D23,26 en dus CD49D kan worden gebruikt om NC-cellen te sorteren die geen fluorophore van de SOX10-locus rapporteren. Figuur 2C toont de expressie van NCC marker genen na verloop van tijd. Figuur 2D geeft aan dat onze differentiatie-efficiëntie boven de 80% lag. Om de identiteit van de resterende cellen te bepalen, werd qRT-PCR gebruikt om te testen op contaminating celltypes, waaronder BryT-expressing mesoderm, SOX17-expressing endoderm en PAX6-expressing neuroectoderm; allen bleken afwezig te zijn of uitgedrukt op zeer lage niveaus (gegevens niet weergegeven; zie aanvullende tabel 1 voor alle primers). Er is echter ongeveer 61/EYA1+ placode gedetecteerd (gegevens die niet worden weergegeven) die de bron van de resterende celtypen kunnen zijn. Bovendien is het mogelijk dat de resterende celtypen NCC-derivaten zijn die al verder worden gedifferentieerd. De HOX-code van de NCP's werd in dit stadium beoordeeld (figuur 2E). Echter, in dit vroege stadium de HOX signalen waren zeer laag (let op de schaal), wat suggereert dat deze NCP's waren ofwel cranial-NC karakter of had nog geen NCC subtype karakter aangenomen.
Op dag 10 konden de NPC's worden gezuiverd met behulp van FACS, wat ongeveer 80% CD49D+ NPC's (Figuur 2D )opleverde. Een voorbeeld van een typische gatingstrategie wordt aangegeven in figuur 2D. Na het sorteren werden de cellen samengevoegd als NC-sferoïden (figuur 3A). Om de NPC's uit te breiden en trunk-NC-achtige eigenschappen te induceren, werden cellen behandeld met een combinatie van FGF2 en CHIR. We testten of sorteren voor de CD49D+ bevolking later betere of zuiverder culturen van symns opleverde. Figuur 3B vergelijkt ongesorteerd e-cd49D+ gesorteerd versus CD49D- gesorteerde celpopulaties. Aan de linkerkant kan worden gezien dat de positieve gesorteerde en ongesorteerde populaties NC-sferoïden op een vergelijkbare manier maakten, terwijl de negatieve gesorteerde cellen niet goed aggregingen, geen ronde, gladde, gezond uitziende sferoïden maakten en binnen 3-4 dagen stierven. Bovendien, toen de NC-sferoïden op dag 14 werden vergeleken via qRT-PCR voor NC- en symN-voorlopermarkers, konden er geen significante verschillen tussen gesorteerde en ongesorteerde cellen worden gedetecteerd. Merkbaar, op dit punt de expressie van sympathische voorloper markers was nog steeds laag en SOX10 niveaus bleef hoog, wat suggereert dat de sferoïden waren nog steeds samengesteld uit cellen met NC eigenschappen. Een dag na beplating (dag 15), zowel ongesorteerd en CD49D+ sferoïden goed gehecht aan PO / LM / FN gerechten en de neurite uitgroei kon duidelijk worden waargenomen (Figuur 3B, D15 en Figuur 3C, D29). De ongesorteerde en gesorteerde culturen werden parallel verder naar dag 35 gedragen, maar er werden geen grote verschillen gezien (gegevens niet getoond). Zo kan worden geconcludeerd dat de sorteerstap niet essentieel was voor het genereren van symN's, en daarom is het een optionele stap in dit protocol. Voor minder efficiënte differentiaties die echter geen 80% CD49D+ cellen opleveren, raden we de sorteerprocedure aan.
Vervolgens hebben we getest of deze NC sferoïden kunnen worden gehandhaafd zonder verlies van hun NC-identiteit (Figuur 3A, optie 2). De NPC's werden gekweekt als sferoïden voor maximaal 2 weken (Figuur 3C). De morfologie van dag 28 sferoïden en vergulde cellen op dag 29 waren vergelijkbaar in vergelijking met dag 14 en 15 cellen in optie 1. Op dag 28 werd de SOX10-expressie op hetzelfde niveau gehouden als dag 14. Echter, de expressie van vroege sympathische nakomelingen markers (dat wil zeggen, ASCL1, PHOX2B, en GATA3) toegenomen (Figuur 3C,rechts), wat suggereert dat de uitgebreide cultuur in FGF2, WNT, en RA signalering leidde tot rijping en posteriorisatie (Figuur 4C en F). Soortgelijke effecten werden eerder gemeld door Kirino etal. 21.
Na NC-uitbreiding (optie 1 of optie 2) werden sferoïden verguld met PO/LM/FN gecoate gerechten en werden ze voorzien van meerdere neurale factoren om de symns te rijpen (figuur 4A). Op dag 20 en 35 (1 week na beplating in respectievelijk optie 1 en 2) werden neuriten waargenomen in een radiaal patroon dat zich uitstrekt e.a.v. de bijgevoegde sferoïden(figuur 4A, rechts). Voorts werden markers met betrekking tot noradrenaline (NE) synthese en transport (d.w.z. TH, AAAD, DBH) uitgedrukt (figuur 4B). De aanwezigheid van vervuilende celtypes werd hier opnieuw onderzocht, en expressie van ChAT, die kan wijzen op parasympathische neuronen, werd gevonden (Figuur 4B,E). Echter, ChAT wordt ook uitgedrukt in cholinerge symNs. Zeer lage niveaus van VIP, een andere parasympathische marker, werden gedetecteerd (gegevens niet weergegeven). Bovendien werden lage niveaus van BRN3A, ISL1 en RUNX1 gedetecteerd (Figuur 4B,E), wat kan wijzen op sensorische neuronen of trigeminusneuronen, d.w.z. derivaten van placode. Minimale EDNRB (markering enterische neuronen) en OLIG2 (markering motorneuronen) werden gedetecteerd (gegevens niet getoond). De identiteit van de niet-neuronale cellen blijft onduidelijk. Echter, op basis van de resultaten van onze vorige symN protocol23, ze waren waarschijnlijk αSMA+ myofibroblasts. Expressie van HOX genen werd opnieuw onderzocht, en het bleek dat HOX5-9 werden uitgedrukt, wat wijst op een stam identiteit. HOX10 (indicatief voor sacrale-NC) werd niet uitgedrukt (figuur 4C, F). Ten slotte werden volwassen markers, waaronder nicotinische acetylcholine receptor (CHRNA3/4) en NE-gerelateerde receptoren, met inbegrip van adrenerge receptoren (ADRA2A/B2) NE transporter (NET, SCL6A2), en blaastransporter (VMAT1) uitgedrukt (Figuur 4D,G). Er werd geen significant verschil gevonden in de expressie van deze genen in cellen die werden afgeleid met optie 2 in vergelijking met optie 1 (Figuur 4E–G).
We hebben onze resultaten verder bevestigd door dit protocol uit te voeren op de H9-PHOX2B:GFP reporter lijn (Figuur 5). Tegen dag 20 vormden de cellen een dicht gazon van neuronen en samengevoegd in clusters van een nog hogere dichtheid, wat wijst op een zeer hoge differentiatie-efficiëntie(figuur 5A, bovenste rij). De kleuring toonde aan dat de meeste symns klonteren in deze clusters, waardoor de beoordeling en kwantificering van de algehele differentiatie-efficiëntie moeilijk. Om vlekken en colokalisatie van specifieke symN-markers te markeren, richtten we ons op de minder dichte gebieden aan de rand van de clusters (zie geel vak in figuur 5A, rechts). Dit was ook waar de meeste vervuilende cellen zich bevonden, dus het was geen goed gebied om de algehele efficiëntie te beoordelen. Niettemin, typische symN markers; met inbegrip van periferie (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronale), DBH, en NET1 (uitgedrukt in stippen langs symN lichamen en axonen, Figuur 5A, bodem); werden gedetecteerd. Een multi-electrode array (MEA) benadering werd gebruikt om elektrische activiteit te meten, en het bleek dat die dag 20 symN's afgevuurd op ongeveer 3-5 pieken per seconde in vergelijking met de negatieve controle van ongedifferentieerde hPSCs (Figuur 5B). Het is belangrijk dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld in de put om voor elke elektrode (zwarte stippen in figuur 5B, helder veld) goed op te nemen. Dag 20 tot dag 30 symNen werden ook gestimuleerd met 1 μM nicotine, die de preganglionic signalering van symNs in vivo imiteert en de gemiddelde vuursnelheid in de cellen verhoogde. Remming van de neuronen werd ook gemeten. β2-adrenerge receptor (ADRB2), gelegen op symN axon terminals, creëert een positieve feedback lus voor NE secretie29. De behandeling van de symnen met 1 μM propranolol (een β2-adrenerge receptorantagonist) remde hun activiteit(figuur 5C, rechts). Deze resultaten suggereren dat de symnen gegenereerd door dit protocol functioneel actief waren.
Figuur 1: Schematische illustratie en vergelijking van symN differentiatie protocollen. (A) Vorig protocol van Zeltner et al.23. (B) Geoptimaliseerd protocol. Optie 1 is 20 dagen lang en bevat slechts 4 dagen NC sferoïde cultuur. Optie 2 is 35 dagen lang en bevat een 2 weken NC sferoïde expansiefase die de productie van meer NC-cellen mogelijk maakt. VTN = vitronectine, PO = poly-L-ornithine, LM = lamine, FN = fibronectine, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = retinoïnezuur, AA = ascorbinezuur, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: NC inductie. (A) Tijdlijn en behandelingen voor NC-inductie van dag 0 tot dag 10. (B) De morfologie en de vorming van NC ruggen werden gecontroleerd om de 2 dagen door heldere veld microscopie. Cellen op elk moment punt na dag 2 werden mede-gekleurd voor AP2A (rood) en SOX10 (groen). Alle immunofluorescentiebeelden werden tellerstained met DAPI. Rode pijlen geven de structuren van richels aan. (C) qRT-PCR-analyse voor het expressieprofiel van NC-markeringen van dag 2-10. (D) Representatieve plot van FACS sorteren op dag 10 voor CD49D+ NC populaties (links). Een typische gating strategie en isotype controle is aangegeven in de eerste vier percelen. Kwantificering van CD49D+ celpercentage op dag 10 werd ook uitgevoerd. (E) qRT-PCR-analyse voor het expressieprofiel van HOX-genen van dag 2-10. NC = neurale kam. Foutbalken vloeien voort uit gegevens van n ≥ 3 biologische herhalingen, gedefinieerd als onafhankelijke differentiatie-experimenten die op afzonderlijke dagen van PSC-culturen werden uitgevoerd en die ten minste één uit elkaar waren gesplitst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Neurale crest onderhoud en uitbreiding. (A) Tijdlijn en behandelingen voor NC uitbreiding tijdens dag 10 tot dag 14 cultuur voor optie 1 of dag 10 tot dag 28 cultuur voor optie 2. (B) De NC sferoïde formatie werd gecontroleerd door heldere veldmicroscopie vanaf dag 11 (1 dag na sferoïde vorming) tot dag 14 (d.w.z. de dag van de beplating). Ongesorteerd, CD49D+, en CD49D- populaties werden vergeleken. De vergulde cellen op dag 15 worden ook getoond. Cellen niet goed te vormen sferoïden in de CD49D- groep en stierf na beplating. Dag 14 cellen werden onderzocht door qRT-PCR analyse (rechts) voor het expressieprofiel van symN voorouders. Ongesorteerde en CD49D+ populaties werden vergeleken (n ≥ 3). (C) NC sferoïden kunnen maximaal 2 weken worden gehandhaafd. Sferoïden werden gecontroleerd door heldere veldmicroscopie van dag 15 tot dag 28 (de dag van de landing). De vergulde cellen op dag 29 worden ook getoond. Dag 28 sferoïden werden onderzocht door qRT-PCR analyse voor het expressieprofiel van symN voorouders (rechts). Ongesorteerde en CD49D+ populaties werden samengevoegd (n ≥ 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: SymN differentiatie en rijping. (A) Tijdlijn en behandelingen na beplating op dag 14 voor optie 1 of dag 28 voor optie 2. Heldere veldmicroscopiefoto's (rechts) tonen symNen op respectievelijk dag 20 en dag 35 (1 week na beplating voor beide opties). (B–D) Optie 1 qRT-PCR-analyse voor het expressieprofiel van symN-eigenschappen tussen dag 20-30. Ongesorteerden en CD49D+ populaties werden samengevoegd. (E–G) Optie 2 qRT-PCR-analyse voor het expressieprofiel van symN-eigenschappen na dag 35. Ongesorteerde en CD49D+ populaties werden samengevoegd (n ≥ 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Functionele karakterisering van symNs. (A, bovenste rij) Helder gebiedsbeeld van symN clusters bij dag 20 en bevlekt beeld dat PRPH en TH dubbele positieve cellen toont die meestal in de clusters worden gevestigd. (A, onder) Meerdere symN markers (gescheiden kanalen) werden gecontroleerd door immunofluorescentie kleuring op dag 20. De noradrenalinetransporter (NET1) bevond zich zowel op het oppervlak van de cellichamen als langs de axonen en dendrieten. Het verscheen als stippen bij deze vergroting. Alle immunofluorescentiebeelden werden tellerstained met DAPI. (B) Representatieve heatmaps van multielectrode array (MEA) analyse voor symNs op dag 20 (boven). Het heldere veldbeeld (onder) toont de dichtheid van symNen en de verdeling van elektroden (acht zwarte stippen). Ongesorteerd en CD49D+ populaties werden hier samengevoegd. (C) Kwantificering van gemiddelde vuursnelheden voor dag 20-30 symNen onder behandelingen van respectievelijk 1 μM nicotine en 1 μM propranolol gedurende 5 min (rechts). Resultaten van ongesorteerde en CD49d-positieve populaties werden gebundeld (n ≥ 3). Ongepaarde, tweezijdige t-test met Welch's correctie, p-waarde:*<0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeld van cellen onder omstandigheden die niet geschikt zijn om door te gaan met de differentiatie. (A) Tijdlijn van de differentiatie met elk controlepunt voor celmorfologieën aangegeven als in B–E. bB) hPSCs (a) met gezonde kolonies en veel gedifferentieerde cellen, en (b) samengevoegd en gedifferentieerde grenzen tussen sommige kolonies op dag 0. Rode pijlen geven de samengevoegde gebieden aan. (C) NPC's op dag 10 met bubble-achtige blaren in de richels. Rode pijlen geven de blaren in de bovenste rij aan. De onderste rij vertegenwoordigt een hogere vergroting. We hebben de identiteit van de blaren niet kunnen identificeren. Echter, aanwezigheid van meer blaren lijkt te correleren met lagere SOX10/CD49D expressie. (D) Onregelmatig uitziende sferoïden ontbreekt gladde randen en ronde vorm op dag 14. (E) Ongezonde en stervende symNs op dag 20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We publiceerden onlangs twee reviews, een bespreken van het gebruik van hPSC-afgeleide symNs voor ziekte modellering31 evenals een diepgaande vergelijking van de beschikbare differentiatie protocollen22. Dus, hier richten we ons op het oplossen van problemen met het huidige protocol om de geïnteresseerde onderzoeker te helpen slagen in het maken van symNs. Tijdens het gehele differentiatieproces, om consistente gegevens en gezonde gedifferentieerde cellen te verkrijgen, moet besmetting in alle stadia zorgvuldig worden gecontroleerd. Bij routinehPSC-onderhoud moet mycoplasmatests tweewekelijks of maandelijks worden uitgevoerd. Als celsortering wordt uitgevoerd op dag 10, wordt de toevoeging van antibiotica aan elk medium sterk aangemoedigd. Het is ook belangrijk om de celmorfologie te controleren voor en na het starten van de differentiatie. Hier stellen we een aantal kritische controlepunten(figuur 6A)voor. Ten eerste, ideale hPSC kolonies klaar voor differentiatie moet heldere en gladde randen met kleine spikes. Kolonies met tandwielachtige spikes zijn begonnen te differentiëren en mogen niet worden gebruikt. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat cellen op het perfecte tijdstip onmiddellijk worden gebruikt, omdat de morfologie binnen enkele uren kan veranderen. Het uitstellen voor slechts één dag kan de cellen(figuur 6B, a)laten crashen of leiden tot contact tussen kolonies (Figuur 6B, b), wat differentiatie in hPSC's stimuleert. Het is een uitdaging om zich te ontdoen van elke gedifferentieerde cel in een cultuur, maar de bevolking moet worden gecontroleerd om minder dan 5% van de slechte kolonies bevatten. Bij het volgen van dit protocol is het tweede controlepunt tijdens differentiatie tussen dag 2 en dag 10. In dit stadium moeten donkere NC-ribbels duidelijk worden waargenomen onder een heldere veldmicroscoop (figuur 2C). De dikte en verdeling van de ribbels kan worden gebruikt als indicatoren van NC-efficiëntie: Omdat NPC's voornamelijk afkomstig zijn van cellen die de ruggen vormen, kunnen dunne of minder wijdverspreide ribbels en blaren in de ribbels wijzen op een lage NC-productie en daarom moeten worden gemarkeerd of weggegooid in het geval van inconsistente resultaten (figuur 6C). RNA-bemonstering wordt sterk aanbevolen op dag 10 om de hierboven beschreven NC-markeringen te controleren. De derde controlepost is tijdens de NC sferoïde fase, omdat sferoïden kunnen aggregeren. Het is het beste om periodiek pipet het medium te breken en opnieuw op te schorten de aggregatie (cellen zullen niet worden verspreid terug naar enkele cellen, maar kleine sferoïden alleen). Als de sferoïden te snel uitzetten, splitze ze door 1:2 of 1:4 om genoeg ruimte en voedingsstoffen te verlaten voor de cellen om te groeien. Als sferoïden geen gladde en ronde vormen hebben (Figuur 6D), kan dit erop wijzen dat de NC-efficiëntie op dag 10 niet hoog genoeg was en dus de uiteindelijke differentiatie kan ruïneren. Het testen van expressieprofielen om de eigenschappen van de symN-voorloper te controleren wordt aanbevolen op de gewenste sferoïde platingdag. Het vierde controlepunt is na het beplaten van de sferoïden. Neurites moeten duidelijk zichtbaar zijn en bundels moeten beginnen te vormen na dag 20. Cellen zonder wijdverspreide neuriten en bundels moeten als contaminatie worden beschouwd (figuur 6E). Op dit punt is het belangrijk om de neuronen te voeden door slechts de helft van het bestaande medium te vervangen om de voedzame omgeving te behouden die door stabiele neuronen wordt gecreëerd. Wees voorzichtig bij het voeden van cellen, omdat rijpen symNs kwetsbaar zijn en gemakkelijk kunnen losmaken. De reden voor elk van de slecht uitziende morfologieën die hier beschreven worden, is nog niet volledig begrepen. Het geeft echter wel inzicht in het gevoelige karakter van hPSC's en in vitro differentiatie. Een bron van dergelijke onregelmatigheden kan te wijten zijn aan reagentia van verschillende leveranciers. Bijvoorbeeld, de dunne ribbels met blaren verschijnen bij het gebruik van een ander merk van BMP4.
Voor elektrofysiologische analyse met BEHULP VAN MEA, om symNen gelijkmatig te verdelen in de elektrodeputten, worden sferoïden gescheiden door Accutase. De behandeltijd moet om te beginnen 20 min zijn. Echter, omdat sferoïden zijn zeer verdicht, de tijd van dissociatie kan worden verhoogd tot 45 min om ervoor te zorgen dat de sferoïden volledig gescheiden zijn. In het algemeen moet elke experimentele groep op een MEA-plaat in veelvouden van ten minste zes worden uitgevoerd om consistente resultaten te krijgen. Met name omdat onze dichtheid voor replating is een stuk lager dan de aanbevelingen van de fabrikant32 (ongeveer 500-700.000/cm2),de put herhalingen zijn van cruciaal belang. In onze resultaten, zowel aanzienlijke symN marker expressie en stabiele activiteit verschijnen van dag 20 tot dag 30. We raden dit aan als het beste tijdspunt om te beginnen met het opnemen van de variabelen naar keuze. Voor elke differentiatie moet het medium zo snel mogelijk vers worden gemaakt en gebruikt (niet langer dan een maand).
Het hier gepresenteerde symN-differentiatieprotocol is feedervrij, chemisch gedefinieerd, efficiënt, uitbreidbaar en levert functionele symN's op dag 20. Dit gedefinieerde symN differentiatie protocol kan worden gebruikt om menselijke aandoeningen van het sympathische zenuwstelsel te bestuderen, als een platform voor medicijnscreening, voor tumorigenese studies zoals neuroblastoom / pheochromocytoma, of voor fundamenteel onderzoek in homeostatische regulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Heidi Ulrichs bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| DAPI dye | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
- Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
