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Biology

"सीटू में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्विचेबल प्रोटोपोर्फिरिन IX-निर्भर फोटोजनरेशन द्वारा माउस त्वचा में स्टेम सेल निच और ऊतक पुनर्जनन की उत्तेजना"

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/60859
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 1, 5
1Ramón y Cajal Institute for Health Research (IRYCIS), Ramón y Cajal University Hospital, 2Centro Integrativo de Biología y Química Aplicada (CIBQA), Universidad Bernardo O'Higgins, 3Department of Molecular Biology, Faculty of Sciences, Universidad Autónoma de Madrid (UAM), 4Instituto de Investigaciones Biosanitarias, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 5Department of Radiology, Rehabilitation & Physiotherapy, Faculty of Medicine, Complutense University

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माउस त्वचा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के गैर-घातक स्तरों के विवो उत्पादन में क्षणिक को प्रेरित करना है, जिससे ऊतक में शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा मिलता है।

Abstract

यहां, हम माउस त्वचा में अंतर्जात प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के विवो फोटोजनरेशन में स्विच करने योग्य को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सीटू में आरओएस का यह क्षणिक उत्पादन स्टेम सेल आला में सेल प्रसार को कुशलतापूर्वक सक्रिय करता है और ऊतक पुनर्जनन को उत्तेजित करता है जैसा कि जलने की चिकित्सा और बाल कूप विकास प्रक्रियाओं के त्वरण के माध्यम से दृढ़ता से प्रकट होता है। प्रोटोकॉल एक विनियमित फोटोडायनामिक उपचार पर आधारित है जो ऊतक को अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटोपोर्फिरीन IX के अग्रदूतों के साथ इलाज करता है और आगे कसकर नियंत्रित भौतिक रासायनिक मापदंडों के तहत लाल प्रकाश के साथ ऊतक को विकिरणित करता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल आरओएस जीव विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक दिलचस्प प्रयोगात्मक उपकरण का गठन करता है।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) पानी बनाने के लिए आणविक ऑक्सीजन की रासायनिक कमी का परिणाम हैं, और इसमें सिंगलेट ऑक्सीजन, सुपरऑक्साइड आयन, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हाइड्रॉक्सिल रेडिकल 1,2,3 शामिल हैं। आरओएस का जीवनकाल उनकी अत्यंत रासायनिक प्रतिक्रियाशील प्रकृति के कारण बहुत कम है। एरोबिक जीवों में, आरओएस संयोग से माइटोकॉन्ड्रिया में एरोबिक श्वसन (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला) के एक प्रमुख रिसाव उप-उत्पाद के रूप में कोशिकाओं के अंदर बनता है। कोशिका में आरओएस के उच्च स्तर के क्षणिक संचय के परिणामस्वरूप एक ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति होती है जो प्रोटीन, लिपिड और शर्करा की अपरिवर्तनीय निष्क्रियता और डीएनए अणु 2,3,4,5 में उत्परिवर्तन की शुरूआत को उत्तेजित कर सकती है। कोशिकाओं, ऊतकों और पूरे जीवों में ऑक्सीडेटिव क्षति का क्रमिक संचय समय के साथ लगातार बढ़ता है और कोशिका मृत्यु कार्यक्रमों, कई विकृतियों और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया 2,3,4,6 के प्रेरण से जुड़ा हुआ है।

एरोबिक जीवों ने कोशिकाओं और ऊतकों में अतिरिक्त आरओएस संचय से निपटने के लिए कुशल आणविक तंत्र विकसित किए हैं। इन तंत्रों में सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) प्रोटीन परिवार के सदस्य शामिल हैं, जो आणविक ऑक्सीजन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड में सुपरऑक्साइड रेडिकल डिसम्यूटेशन को उत्प्रेरित करते हैं, साथ ही विभिन्न कैटालसेस और पेरोक्सीडेज जो एंटीऑक्सिडेंट पूल (ग्लूटाथियोन, एनएडीपीएच, पेरोक्सीरेडॉक्सिन, थियोरेडॉक्सिन 7,8) का उपयोग करते हैं ताकि हाइड्रोजन पेरोक्साइड के बाद के रूपांतरण को पानी और आणविक ऑक्सीजन में उत्प्रेरित किया जा सके।

हालांकि, कई रिपोर्टें आणविक सर्किट के प्रमुख घटकों के रूप में आरओएस की भूमिका का समर्थन करती हैं जो प्रसार, भेदभाव और गतिशीलता 2,3,4 सहित महत्वपूर्ण सेल कार्यों को नियंत्रित करती हैं। इस अवधारणा को एरोबिक जीवों में समर्पित आरओएस-उत्पादक तंत्र की प्रारंभिक पहचान और लक्षण वर्णन द्वारा समर्थित किया गया है, जिसमें लिपोक्सीजेनेस साइक्लोऑक्सीजिनेज और एनएडीपीएच ऑक्सीडेज 9,10 शामिल हैं। इस अर्थ में, आरओएस कशेरुक भ्रूण के विकास के दौरान एक सक्रिय भूमिका प्रदर्शित करता है 11,12,13 और विवो शारीरिक कार्यों में विशिष्टके नियमन में इन अणुओं के लिए महत्वपूर्ण भूमिकाओं को विभिन्न प्रयोगात्मक प्रणालियों में रिपोर्ट किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला14 में हेमटोपोइएटिक पूर्वजों का भेदभाव कार्यक्रम, जेब्राफिश में उपचार प्रेरण, या जेनोपस टैडपोल 15 में पूंछ पुनर्जनन शामिल है।. स्तनधारियों में, आरओएस एक न्यूरोस्फीयर मॉडल16 में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के आत्म-नवीकरण / भेदभाव क्षमता में और कोलोरेक्टल कैंसर दीक्षा17 के दौरान आंतों के स्टेम सेल फ़ंक्शन के विनियमन में शामिल रहा है। त्वचा में, आरओएस सिग्नलिंग एपिडर्मल भेदभाव और त्वचा स्टेम सेल आला और बाल कूप विकास चक्र18,19 के विनियमन से जुड़ा हुआ है।

इस परिप्रेक्ष्य में, जैविक प्रणालियों में आरओएस की शारीरिक भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए एक प्रमुख प्रयोगात्मक सीमा, दोनों सामान्य या पैथोलॉजिकल स्थितियों में, कोशिकाओं और ऊतकों में इन अणुओं के नियंत्रित उत्पादन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी है, जो दूसरे सिग्नलिंग संदेशवाहक के रूप में उनके शारीरिक उत्पादन से सटीक रूप से मिलते-जुलते हैं। वर्तमान में, अधिकांश प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में बहिर्जात आरओएस का प्रशासन शामिल है, ज्यादातर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के रूप में। हमने हाल ही में माउस त्वचा में अंतर्जात आरओएस के विवो उत्पादन में एक क्षणिक, गैर-घातक पर स्विच करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण लागू किया है, जो अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र प्रोटोपोर्फिरीन IX (पीपीआईएक्स; जैसे, एमिनोलेवुलिनिक एसिड या इसके मिथाइल व्युत्पन्न मिथाइलएमिनोलेवुलिनेट) के अग्रदूतों के प्रशासन पर आधारित है और इंट्रासेल्युलर आणविक ऑक्सीजन से आरओएस के सीटू गठन को प्रेरित करने के लिए लाल प्रकाश के साथ नमूने का आगे विकिरण (चित्रा 1)।). इस फोटोडायनामिक प्रक्रिया का उपयोग कुशलतापूर्वक निवासी स्टेम सेल आला को उत्तेजित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार ऊतक19,20 के पुनर्योजी कार्यक्रमों को सक्रिय करता है और त्वचा पुनर्योजी चिकित्सा में नए चिकित्सीय तौर-तरीकों के लिए रास्ता खोलता है। यहां, हम प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं, जो स्टेम सेल आला की उत्तेजना के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं, जिसे बाल कूप19,21 के उभार क्षेत्र में दीर्घकालिक 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) लेबल रिटेनिंग कोशिकाओं (एलआरसी) की संख्या में वृद्धि के रूप में मापा जाता है, और बाद में पुनर्जनन कार्यक्रमों (बालों के विकास और जलने की चिकित्सा प्रक्रियाओं का त्वरण) के सक्रियण के रूप में मापा जाता है। C57Bl6 माउस तनाव की त्वचा में गैर-घातक ROS उत्पादन।

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Protocol

सभी माउस पशुपालन और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को स्थानीय, राष्ट्रीय, अंतर्राष्ट्रीय कानून और पशु प्रयोग पर दिशानिर्देशों के अनुपालन में आयोजित किया जाना चाहिए।

1. पूंछ की त्वचा उपकला होलमाउंट में बालों के विकास, जलने के प्रेरण और दीर्घकालिक बीआरडीयू एलआरसी की पहचान

नोट: नीचे वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए 10-दिन या 7-सप्ताह के सी 57बीएल /6 चूहों का उपयोग करें, अधिमानतः कूड़े के साथी। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में, जानवरों को 3% आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा एनेस्थेटाइज किया जाएगा या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी जाएगी जैसा कि संकेत दिया गया है।

  1. दूसरे टेलोजेन (आराम) चरण में चूहों की पीठ की त्वचा में बालों के विकास का प्रेरण (लगभग 50 दिन बाद प्रसव)
    1. 3% आइसोफ्लुरेन की साँस लेने के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पेडल रिफ्लेक्स (दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी) की कमी से पूर्ण गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें। हेयर क्लिपर और डिपिलेटरी क्रीम (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्रत्येक माउस में पीठ की त्वचा के दो अलग-अलग क्षेत्रों को शेव करें। नियंत्रण के लिए बाईं ओर और उपचार के लिए दाईं ओर का उपयोग करें।
      नोट: जांचें कि, शेविंग के बाद, सबजेसेंट बैक स्किन गुलाबी है और ग्रे / काली नहीं है, जो मेलानोजेनेसिस का एक संकेतक है और इस माउस स्ट्रेन में एनाजेन (बढ़ती) चरण में प्रवेश करता है।
    2. सभी क्रीम अवशेषों को हटाने के लिए पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोएं और धारा 2.1 में वर्णित गैर-घातक आरओएस स्तरों के क्षणिक उत्पादन को शामिल करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. प्रत्येक जानवर में नियंत्रण और उपचारित त्वचा क्षेत्रों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के दैनिक अधिग्रहण के माध्यम से बाल कूप विकास रिकॉर्ड करें (उदाहरण के लिए, 5-20x दूरबीन लेंस के साथ युग्मित एचडी कैमरे का उपयोग करना)।
  2. दूसरे टेलोजेन (आराम) चरण में चूहों की पीठ की त्वचा में 2डिग्री जलने के घावों का प्रेरण (लगभग 50 दिन बाद प्रसव)
    1. चूहों को एनेस्थेटाइज करें। हेयर क्लिपर और डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके प्रत्येक माउस में पूरी पीठ की त्वचा क्षेत्र को शेव करें और सभी क्रीम अवशेषों को हटाने के लिए पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें।
      नोट: जलने की प्रक्रिया से ठीक पहले बाँझ खारा में लिडोकेन 0.5% (2 मिलीग्राम / मिलीलीटर) के सीटू चमड़े के नीचे इंजेक्शन का प्रशासन करें, जो 7 मिलीग्राम / मिलीलीटर से अधिक नहीं है।
    2. उबलते पानी में डुबोकर 95 डिग्री सेल्सियस पर एक पीतल बार (क्रॉस-सेक्शन में 1 सेमी) को प्रीहीट करें और फिर 5 सेकंड के लिए प्रत्येक माउस की पृष्ठीय पीठ की त्वचा की सतह के मध्य क्षेत्र पर लागू करें।
    3. जलने की पीढ़ी के ठीक बाद, निर्जलीकरण को रोकने के लिए इलेक्ट्रिक कंबल पर 1 एमएल शारीरिक समाधान (0.9% एनएसीएल) के साथ जानवरों को इंजेक्ट करें। जानवरों को 24 घंटे के लिए ठीक होने दें और धारा 2.3 में वर्णित गैर-घातक आरओएस स्तरों के स्वस्थाने उत्पादन के प्रेरण के लिए आगे बढ़ें।
    4. प्रत्येक जानवर में नियंत्रण और उपचारित त्वचा क्षेत्रों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के दैनिक अधिग्रहण के माध्यम से जलने के घाव की प्रगति को रिकॉर्ड करें (उदाहरण के लिए, 5-20x दूरबीन लेंस के साथ युग्मित एचडी कैमरे का उपयोग करना)।
  3. पूंछ त्वचा उपकला में दीर्घकालिक बीआरडीयू एलआरसी का उत्पादन और पहचान
    1. पीबीएस में घुलने वाले 50 मिलीग्राम / किलोग्राम बॉडीवेट बीआरडीयू के साथ लगातार 4 दिनों के लिए दिन में एक बार 10/14 दिन के कूड़े को इंट्रापरिटोनियल (कोई एनेस्थीसिया नहीं) इंजेक्ट करें। लेबलिंग चरण के बाद, चूहों को किसी भी उपचार से पहले 50-60 दिनों तक बढ़ने की अनुमति दें।
      नोट: प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एक ताजा सुई का उपयोग करें।
    2. ऊतक होलमाउंट की तैयारी से पहले अलग-अलग समय पर पूंछ की त्वचा में क्षणिक गैर-घातक आरओएस उत्पादन के प्रेरण के लिए धारा 2.3 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
    3. पूंछ एपिडर्मिस के होलमाउंट तैयार करने के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें और सर्जिकल कैंची के साथ पूंछ को क्लिप करें।
      1. पूंछ के साथ एक सीधा अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें और रीढ़ की हड्डी से एक टुकड़े के रूप में पूरी त्वचा को छील दें। पीबीएस में 5 एमएम ईडीटीए में छिलके वाली त्वचा को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 5 एमएल ट्यूबों में इनक्यूबेट करें और फोर्सप्स का उपयोग करके डर्मिस से एपिडर्मिस की बरकरार चादरों को सावधानीपूर्वक अलग करें।
      2. कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 72 घंटे के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड में ऊतक को ठीक करें और उचित एंटीबॉडी का उपयोग करके बीआरडीयू का पता लगाने के लिए आगे बढ़ें।
      3. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति में एलआरसी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति / कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें, जिसमें ऊतक होलमाउंट की तैयारी से पहले अलग-अलग समय पर प्रकाश नियंत्रण और फोटोडायनामिक उपचार शामिल हैं, जैसा कि पहले विस्तार से19,20 में वर्णित है।
        नोट: फिक्स्ड एपिडर्मल शीट को पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है जिसमें तीन महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.02% सोडियम एज़ाइड होता है। मानक हिस्टोलॉजिकल सेक्शन प्रक्रियाओं के बाद आवश्यक प्रोटीन के इम्यूनोलोकलाइजेशन के लिए फिक्स्ड एपिडर्मल शीट का उपयोग किया जा सकता है।

2. माउस त्वचा में गैर-घातक आरओएस स्तरों के क्षणिक उत्पादन का प्रेरण

नोट: माउस त्वचा में गैर-घातक आरओएस स्तरों के क्षणिक उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र पीपीआईएक्स के अग्रदूत का उपयोग करके एक फोटोडायनामिक उपचार, इस मामले में, मिथाइल-एमिनोलेवुलिनेट (एमएएलए), और लाल बत्ती का उपयोग किया जाएगा।

  1. पीठ की त्वचा में बालों के विकास के प्रेरण के लिए क्षणिक आरओएस उत्पादन पर स्विच करने के लिए, जानवरों को तैयार करें जैसा कि खंड 1.1 में दर्शाया गया है।
    1. दाएं क्षेत्र पर सामयिक क्रीम (सामग्री की तालिका) के रूप में ~ 25 मिलीग्राम एमएएलए लागू करें, बाईं ओर को अंतर-व्यक्तिगत मतभेदों से बचने के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में रखें। अंधेरे में 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, पीबीएस के साथ अतिरिक्त क्रीम को अच्छी तरह से धो लें। संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करने के लिए, पूरी तरह से ठीक होने तक हर 10 मिनट में जानवरों की निगरानी करें।
      नोट: पीठ की त्वचा में पीपीआईएक्स के उत्पादन को नीली रोशनी (407 एनएम) उत्तेजना के तहत इसकी लाल प्रतिदीप्ति द्वारा सीटू में परीक्षण किया जाना चाहिए।
    2. जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    3. 2.5−4 J/cm2 की कुल खुराक के लिए पर्याप्त लाल-प्रकाश स्रोत (सामग्री की तालिका) के साथ पूरी पीठ की त्वचा को विकिरणित करें। चूहों को उनकी पूरी तरह से ठीक होने तक एक इलेक्ट्रिक कंबल पर रखें और चरण 1.1.3 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
      नोट: विकिरण को प्रकाश स्रोत और ऊतक के बीच की दूरी में हेरफेर करके समायोजित किया जाना चाहिए और एक बिजली ऊर्जा मीटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके मापा जाना चाहिए। प्रयोग को समाप्त माना जाता है जब प्रत्येक जानवर के स्वतंत्र शेव किए गए क्षेत्रों में से किसी में पूर्ण बाल विकास देखा जाता है। पूरी प्रक्रिया में सिर्फ एक फोटो उपचार शामिल है।
  2. 2डिग्री जलने के घावों के उपचार में सुधार के लिए क्षणिक आरओएस उत्पादन पर स्विच करने के लिए, जानवरों को तैयार करें जैसा कि खंड 1.2 में दर्शाया गया है।
    1. जली हुई सतह पर सामयिक क्रीम के रूप में ~ 25 मिलीग्राम एमएएलए लागू करें, जिसमें लगभग 4 मिमी आसन्न ऊतक शामिल हैं। अंधेरे में 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, पीबीएस के साथ अतिरिक्त क्रीम को अच्छी तरह से धो लें। संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करने के लिए, पूरी तरह से ठीक होने तक हर 10 मिनट में जानवरों की निगरानी करें।
    2. जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    3. 2.5−4 J/cm2 की कुल खुराक के लिए पर्याप्त लाल-प्रकाश स्रोत के साथ पूरी पीठ की त्वचा को विकिरणित करें। चूहों को उनकी पूरी तरह से ठीक होने तक एक इलेक्ट्रिक कंबल पर रखें और चरण 1.2.4 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
      नोट: प्रत्येक जानवर के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया को समाप्त माना जाता है जब पूर्ण जलने की चिकित्सा देखी जाती है। पूरी प्रक्रिया में सिर्फ एक फोटो उपचार शामिल है।
  3. पूंछ की त्वचा में क्षणिक आरओएस उत्पादन पर स्विच करने के लिए, चूहों को तैयार करें जैसा कि खंड 1.3 में दर्शाया गया है, पृष्ठीय ऊतक क्षेत्र के साथ सामयिक क्रीम के रूप में ~ 25 मिलीग्राम एमएएलए लागू करें और पीठ की त्वचा के लिए खंड 2.1 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। पशु इच्छामृत्यु से पहले 24 घंटे, 48 घंटे या 72 घंटे फोटो उपचार और संवाददाता प्रकाश नियंत्रण करें और पूंछ की त्वचा के पूरे माउंट का निष्कर्षण करें।
    नोट: सभी प्रयोगात्मक डिजाइनों में, एंटीऑक्सिडेंट आरओएस स्कैवेंजर्स (उदाहरण के लिए, पीबीएस में 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 100 मिलीग्राम / किलोग्राम बॉडीवेट एन-एसिटाइल-सिस्टीन का दैनिक टीकाकरण, पीएच 7.2, एमएएलए उपचार से 5 दिन पहले शुरू होता है या, वैकल्पिक रूप से, 50% इथेनॉल में 100 मिलीग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड की दो खुराक) का उपयोग करके प्रक्रिया की आरओएस-निर्भरता की परख करें। 30 मिनट की जगह, एमएएलए उपचार और लाल-प्रकाश विकिरण के बीच समय अंतराल में त्वचा पर शीर्ष रूप से लागू किया जाता है)।

3. त्वचा में आरओएस का पता लगाना

  1. हाइड्रोइथिडाइन का उपयोग करके फोटोडायनामिक उपचार के बाद पूंछ की त्वचा में आरओएस उत्पादन का पूर्व विवो मूल्यांकन।
    नोट: हाइड्रोएथिडाइन एक गैर-फ्लोरोसेंट अणु है जो विशेष रूप से फ्लोरोसेंट डाई 2-हाइड्रॉक्सीथिडियम (एचईटी) का उत्पादन करने के लिए आरओएस के साथ प्रतिक्रिया करता है।
    1. पीबीएस समाधान (नियंत्रण नमूने) में 5 एमएम ईडीटीए में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्राप्त पूरी पूंछ की खाल को इनक्यूबेट करें या इसके अतिरिक्त 2 एमएम एमएएलए (फोटोडायनामिक उपचार नमूने) युक्त हो।
    2. सभी मामलों में, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 25 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से 3.2 μM की अंतिम एकाग्रता में हाइड्रोइथिडाइन जोड़ें और आरटी पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. उंगलियों का उपयोग करके कांच की सतह पर पूंछ की त्वचा के नमूने खींचें और 10 जे / सेमी2 फ्लुएंस पर 636 एनएम लाल रोशनी के साथ विकिरणित करें।
    4. डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने और एपिडर्मल शीट को ठीक करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें जैसा कि खंड 1.3.3 में वर्णित है।
    5. हरे रंग के रोमांचक प्रकाश का उपयोग करके प्रतिदीप्ति / कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत एचईटी लाल उत्सर्जन का मूल्यांकन करें, उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को कैप्चर करें और आगे के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: एचईटी ऑटोऑक्सीडेशन के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में फोटोडायनामिक उपचार की अनुपस्थिति में ऊतक के नमूनों के एचईटी धुंधला का उपयोग करें।
  2. विवो में बालों के विकास और जलने के उपचार के बाद पीठ की त्वचा में आरओएस उत्पादन का पता लगाने के बाद फोटोडायनामिक उपचार किया जाता है।
    नोट: यह चरण 2',7'-डाइक्लोरोडाइहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीएचएफ-डीए) का उपयोग करके किया जाता है, जो एक सेल विकृत गैर-फ्लोरोसेंट यौगिक है, जो इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ एंजाइमों द्वारा दरार के बाद, विशेष रूप से आरओएस के साथ प्रतिक्रिया करता है जो 2', 7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (डीसीएफ) फ्लोरोसेंट डाई देता है।
    1. बालों के विकास (धारा 1.1) या जलने की चिकित्सा (धारा 1.2) के प्रेरण के लिए तैयार जानवरों का उपयोग करें। सामयिक एमएएलए क्रीम उपचार (अनुभाग 2.1 और 2.2 देखें) से ठीक पहले, सभी लक्ष्य नियंत्रण / उपचारित त्वचा क्षेत्रों पर डीएचएफ-डीए के 50% इथेनॉल में 100 μL 1 मिलीग्राम / एमएल वितरित करें, त्वचा को सामग्री को पूरी तरह से अवशोषित करने दें और सामयिक एमएएलए क्रीम आवेदन के साथ आगे बढ़ें।
    2. अंधेरे में 4 घंटे के लिए इलाज किए गए जानवरों को इनक्यूबेट करें, पीबीएस के साथ त्वचा से सामयिक एमएएलए क्रीम को अच्छी तरह से धो लें और त्वचा पर डीएचएफ-डीए समाधान के 100 μL की दूसरी खुराक दें। संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करने के लिए, पूरी तरह से ठीक होने तक हर 10 मिनट में जानवरों की निगरानी करें।
    3. अंधेरे में 50 मिनट के लिए इलाज किए गए जानवरों को इनक्यूबेट करें, एक एलईडी लैंप का उपयोग करके 636 एनएम लाल बत्ती के 2.5 से 4 जे / सेमी2 तक की समृद्धि के साथ पूरी पीठ की त्वचा को एनेस्थेटाइज और विकिरणित करें।
    4. विकिरण के तुरंत बाद, एक विवो इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके त्वचा में उत्पन्न आरओएस स्तरों का मूल्यांकन करें। 445−490 एनएम उत्तेजना और 515−575 एनएम उत्सर्जन के लिए फ़िल्टर बॉक्स सेट करें, उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को कैप्चर करें और आगे के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: डीएचएफ-डीए ऑटोऑक्सीडेशन के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में फोटोडायनामिक उपचार की अनुपस्थिति में ऊतक के नमूनों के डीएचएफ-डीए धुंधला का उपयोग करें।

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Representative Results

माउस पीठ और पूंछ की त्वचा में एमएएलए अग्रदूत के सामयिक प्रशासन के परिणामस्वरूप पूरे ऊतक में पीपीआईएक्स का एक महत्वपूर्ण संचय होता है और, उल्लेखनीय रूप से, बाल कूप में, जैसा कि नीली रोशनी (407 एनएम) उत्तेजना (चित्रा 2ए, सी) के तहत इस यौगिक के लाल-गुलाबी प्रतिदीप्ति द्वारा प्रदर्शित किया गया है। 2.5−4 J/cm2 की समृद्धि पर लाल प्रकाश (636 nm) के साथ उपचारित ऊतक का बाद में विकिरण ऊतक में आरओएस के क्षणिक उत्पादन को बढ़ावा देता है, विशेष रूप से बाल कूप के उभार क्षेत्र में (चित्रा 2B, D)।

विवो में माउस त्वचा में गैर-घातक आरओएस उत्पादन पर स्विच करने से फोटो उपचार के दो दिन बाद बाल कूप के उभार क्षेत्र में दैहिक स्टेम कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत एलआरसी की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि को बढ़ावा मिलता है (चित्रा 3, बाएं पैनल)। विशेष रूप से, एलआरसी की संख्या में वृद्धि क्षणिक है, उपचार के 6 दिन बाद सामान्य स्तर पर बहाल हो जाती है (चित्रा 3, दाएं पैनल)। चूंकि यह क्षेत्र माउस त्वचा में मुख्य स्टेम सेल आला में से एक है, इस क्षेत्र में सेल प्रसार का एक क्षणिक प्रेरण मुख्य रूप से उभार आला के कार्यात्मक सक्रियण और प्रसार और भेदभावके निवासी स्टेम सेल कार्यक्रमों को दर्शाता है।

उभार बाल कूप आला का आरओएस-निर्भर सक्रियण आगे त्वचा में शारीरिक प्रतिक्रियाओं से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, क्षणिक आरओएस उत्पादन विशेष रूप से 2डिग्री जलने के बाद त्वचा उपचार प्रक्रिया को तेज करता है (चित्रा 4ए, बी)। क्षतिग्रस्त / स्कैब त्वचा क्षेत्र की क्रमिक कमी का परिमाणीकरण ऊतक में पीपीआईएक्स-निर्भर क्षणिक आरओएस उत्पादन द्वारा प्रेरित घाव भरने की त्वरण प्रक्रिया की मजबूती और सांख्यिकीय महत्व को दर्शाता है (चित्रा 4 सी)। उसी तरह, गैर-घातक आरओएस स्तर दूसरे समन्वित टेलोजेन (चित्रा 5 ए) के दौरान शेविंग के बाद बालों के विकास को दृढ़ता से बढ़ावा देते हैं, एक चरण जिसके दौरान बाल कूप विकास उत्तेजनाओं22,23 का जवाब देने के लिए दुर्दम्य होता है, जो बालों के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए नए यौगिकों और / या प्रक्रियाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने का एक पर्याप्त तरीका है। विशेष रूप से, एस्कॉर्बिक एसिड (एए) जैसे एंटीऑक्सिडेंट यौगिकों के उपयोग से त्वरित बाल विकास दिखाने वाले जानवरों की संख्या में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी आती है (चित्रा 5 बी)। इसके अलावा, फोटो उपचार के बाद त्वचा में आरओएस उत्पादन, त्वचा में डीएचएफ के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन द्वारा निर्धारित, एंटीऑक्सिडेंट यौगिकों (चित्रा 5 सी) द्वारा भी काफी कम हो जाता है। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि पीपीआईएक्स-आधारित फोटो उपचार के बाद आरओएस उत्पादन ऊतक में शारीरिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए सख्ती से आवश्यक है।

Figure 1
चित्रा 1: हीम बायोसिंथेटिक मार्ग का उपयोग करके कोशिकाओं और ऊतकों में सीटू में आरओएस के अंतर्जात फोटोडायनामिक उत्पादन के नियंत्रित स्विचिंग के लिए सैद्धांतिक पृष्ठभूमि। (ए) मूल फोटोकैमिकल प्रतिक्रियाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसके परिणामस्वरूप फोटोडायनामिक उपचार के दौरान आणविक ऑक्सीजन उत्तेजना होती है। उपयुक्त के साथ प्रकाश के अवशोषण पर, जमीन की स्थिति एस0 में एक फोटोसेंसिटाइज़र अणु (पीएस) एक उत्तेजित एकल अवस्था एस1 में संक्रमण से गुजरता है। चूंकि कोई भी उत्तेजित अवस्था जमीन की स्थिति की तुलना में ऊर्जावान रूप से कम बेहतर होती है, इसलिए अणु थोड़े समय के बाद एस0 पर लौट आता है। अधिकांश पीएस में एस 1 से ट्रिपल स्टेट टी1 में संक्रमण के लिए उच्च क्वांटम दक्षता होती है, जो आमतौर पर सापेक्ष लंबे जीवनकाल की विशेषता होती है। उत्तेजित ट्रिपल अवस्था में सक्रिय पीएस दो अलग-अलग मार्गों के माध्यम से अन्य अणुओं के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। एक प्रकार 1 फोटोकैमिकल प्रतिक्रिया कट्टरपंथी प्रजातियों को बनाने के लिए आसन्न अणुओं में इलेक्ट्रॉनों का हस्तांतरण है; इन कणों को आरओएस का उत्पादन करने के लिए आणविक ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करने की संभावना है, जिसमें सुपरऑक्साइड आयन (•ओ 2-), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2) और हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (• ओएच) शामिल हैं। एक प्रकार II फोटोकैमिकल प्रतिक्रिया पीडीटी में नियोजित अधिकांश पीएस के लिए प्रमुख प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करती है। इस प्रतिक्रिया के दौरान, आणविक ऑक्सीजन में ऊर्जा (इलेक्ट्रॉनों नहीं) का हस्तांतरण (जिसका विन्यास जमीन की स्थिति में ट्रिपल, 3ओ 2 है) गैर-कट्टरपंथी लेकिन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील एकल ऑक्सीजन (1ओ2) के गठन को चलाता है। इन प्रतिक्रियाओं के दौरान गठित फोटोप्रोडक्ट्स जैव रासायनिक घटनाओं के एक कैस्केड को ट्रिगर करते हैं जिसके परिणामस्वरूप एक ऑक्सीडेटिव तनाव होता है जो अंततः कोशिका मृत्यु का कारण बनता है या जो संभावित रूप से कोशिका वृद्धि को उत्तेजित कर सकता है। (बी) 5-एमिनोलेवुलिनिक एसिड (एएलए) हेम बायोसिंथेटिक मार्ग में एक प्राकृतिक अग्रदूत है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल और साइटोसोलिक सेलुलर डिब्बे दोनों शामिल हैं। एएलए सिंथेज़ एंजाइम गतिविधि को एक नकारात्मक प्रतिक्रिया नियंत्रण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिससे मुक्त हीम, इस मार्ग का अंतिम उत्पाद, ग्लाइसिन और सक्सिनिल सीओए से एएलए के संश्लेषण को रोकता है। बहिर्जात एएलए या इसके व्युत्पन्न मिथाइल एमिनोलेवुलिनेट (एमएएलए) का प्रशासन नियामक प्रतिक्रिया प्रणाली को बाईपास करता है, ताकि डाउनस्ट्रीम मेटाबोलाइट्स, विशेष रूप से प्रोटोपोर्फिरीन IX (पीपीआईएक्स), सेल उत्प्रेरण फोटोसेंसिटाइजेशन में जमा हो जाएं। पीपीआईएक्स में लोहे के सम्मिलन के उत्प्रेरक एंजाइम, फेरोकेलैटेज की दर-सीमित विशेषताएं, इस अंतर्जात पीएस यौगिक के संचय को बढ़ावा देती हैं। पीबीजी = पोर्फोबिलिनोजेन। इस आंकड़े को कैरास्को एट अल.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमएएलए और लाल प्रकाश के साथ फोटोडायनामिक उपचार त्वचा में आरओएस के क्षणिक उत्पादन को प्रेरित करता है। (ए) पीठ की त्वचा में एमएएलए विषय उपचार के बाद अंतर्जात पीपीआईएक्स का संचय। एक ही जानवर में बाईं ओर नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। (बी) बाएं पैनल: पीपीआईएक्स-निर्भर आरओएस (एमएएलए + लाइट) उत्पादन की निगरानी डीएचएफ-डीए द्वारा की जाती है। दाएं पैनल: पीठ की त्वचा में सापेक्ष आरओएस उत्पादन का समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण; प्रत्येक जानवर में एमएएलए + लाइट बनाम लाइट क्षेत्रों के डीएचएफ-डीए फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के सापेक्ष एकीकृत घनत्व को विकिरण के बाद अलग-अलग समय पर निर्धारित किया गया था और कार्यप्रणाली में वर्णित के रूप में सामान्यीकृत किया गया था। एसई ± माध्य का प्रतिनिधित्व किया गया था (प्रत्येक समय बिंदु के लिए एन = 4)। (सी) पूंछ की त्वचा में पीपीआईएक्स का स्थानीयकरण (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां)। (डी) एमएएलए + लाइट के बाद पूंछ की त्वचा में आरओएस उत्पादन जैसा कि एचईटी द्वारा पता चला है, बाल कूप के उभार क्षेत्र में वृद्धि और निरंतर संचय दर्शाता है। प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां (अधिकतम अनुमान) दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 100 μm। इस आंकड़े को कैरास्को एट अल.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: त्वचा में सीटू आरओएस उत्पादन पर स्विच करना बाल कूप आला के उभार क्षेत्र में स्टेम कोशिकाओं की महत्वपूर्ण वृद्धि को बढ़ावा देता है। बाएं पैनल: प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां (अधिकतम अनुमान) माउस पूंछ की त्वचा में बीआरडीयू लेबल रिटेनिंग कोशिकाओं (एलआरसी) के स्थानीयकरण को दर्शाती हैं और पीपीआईएक्स-आधारित फोटोट्रीटमेंट के 2 दिन बाद बालों के रोम के उभार क्षेत्र में एलआरसी की स्पष्ट वृद्धि दिखाती हैं। दायां पैनल: बाल कूप उभार क्षेत्र में एलआरसी की संख्या का परिमाणीकरण। माध्य + SE (n = 4) का प्रतिनिधित्व किया जाता है। स्केल बार = 50 μm। इस आंकड़े को कैरास्को एट अल.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: त्वचा में सीटू आरओएस उत्पादन पर स्विच करने से जलने की चिकित्सा में तेजी आती है। (क) नियंत्रित नमूनों की तुलना में उपचारित पशुओं में जले हुए घायल क्षेत्रों में एमएएलए द्वारा प्रेरित पीपीआईएक्स उत्पादन। (बी) एमएएलए + लाइट उपचारित और नियंत्रित जानवरों में बर्न हीलिंग विकास। (सी) जले हुए क्षेत्रों (बाएं पैनल) का समय-पाठ्यक्रम परिमाणीकरण एमएएलए + हल्के उपचारित जानवरों में त्वरित जलने के उपचार को दर्शाता है; ठीक न किए गए क्षेत्र का माध्य + एसई (एन = 4) दर्शाया गया है। क्षेत्र-अंडर-द-कर्व विश्लेषण (दाएं पैनल) दोनों समय-पाठ्यक्रम वक्रों (पी ≤ 0.06) के बीच सांख्यिकीय अंतर प्रदर्शित करता है। इस आंकड़े को कैरास्को एट अल.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: त्वचा में सीटू आरओएस उत्पादन पर स्विच करना बालों के विकास को उत्तेजित करता है। (ए) शीर्ष पंक्ति: प्रकाश नियंत्रण क्षेत्र (बाईं ओर) की तुलना में एमएएलए + लाइट (पृष्ठीय त्वचा के दाईं ओर) द्वारा दुर्दम्य टेलोजेन चरण के दौरान बालों के विकास का प्रेरण। नीचे पंक्ति: त्वचा में आरओएस उत्पादन और एमएएलए + लाइट द्वारा प्रेरित बालों के विकास का त्वरण दोनों एस्कॉर्बिक एसिड (एए) एंटीऑक्सिडेंट उपचार द्वारा बाधित होते हैं। (बी) एंटीऑक्सीडेंट एए (एन = 3 स्वतंत्र प्रयोगों में 4) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में नियंत्रण क्षेत्र की तुलना में एमएएलए-पीटी में तेजी से बालों के विकास को दिखाने वाले जानवरों के प्रतिशत का परिमाणीकरण। (सी) एमएएलए-पीटी (एन = 4) के दौरान एए द्वारा प्रेरित पृष्ठीय त्वचा में आरओएस उत्पादन अवरोध का परिमाणीकरण। सभी मामलों में, सलाखों का मतलब + एसई है। इस आंकड़े को कैरास्को एट अल.19 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं जो शारीरिक प्रभावों के साथ माउस त्वचा में विवो में अंतर्जात आरओएस उत्पादन के क्षणिक सक्रियण की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र पीपीआईएक्स (चित्रा 1 बी) की नियंत्रित और स्थानीय उत्तेजना को प्रेरित करने के लिए एक फोटोडायनामिक प्रक्रिया पर आधारित है। यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विवो प्रयोगात्मक प्रणालियों में आरओएस जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प उपकरण है जो बाहरी आरओएस स्रोतों (आमतौर पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड) का उपयोग करके पद्धतियों पर एक महत्वपूर्ण प्रगति का गठन करता है और ऊतक / नमूने में आरओएस के नियंत्रित और स्थानीय उत्पादन की अनुमति देता है।

यह देखते हुए कि कोशिकाओं के अंदर पीपीआईएक्स के संचय को बढ़ावा देने के लिए एमिनोलेवुलिनेट-आधारित अग्रदूतों को अधिक मात्रा में प्रशासित किया जाता है, इस पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम क्षति सीमा से नीचे ऊतक में आरओएस स्तरों के क्षणिक उत्पादन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त प्रकाश खुराक की स्थापना है, लेकिन एक मजबूत उत्तेजक प्रभाव दिखा रहा है। वर्तमान में कोशिकाओं और ऊतकों में उत्पादित किसी भी प्रकार के आरओएस की सटीक मात्रा को सीधे निर्धारित करने के लिए कोई उपलब्ध प्रौद्योगिकियां नहीं हैं। हमारी पद्धति में, किसी दिए गए प्रकाश खुराक, उत्पादित आरओएस की सटीक मात्रा और किसी दिए गए जैविक प्रभाव (जैसे, कोशिका मृत्यु या कोशिका प्रसार) के बीच सीधा संबंध स्थापित करना अभी भी संभव नहीं है। इस कारण से, किसी भी विशेष प्रयोगात्मक मॉडल के लिए प्रकाश खुराक (फ्लुएंस) को शोधकर्ता द्वारा प्रत्येक स्थिति के लिए पसंद के गुणात्मक या अर्धगुणात्मक मापदंडों का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। माउस त्वचा के मामले में, हम कोशिका मृत्यु और ऊतक क्षति और एक महत्वपूर्ण और क्षणिक प्रोलिफेरेटिव तरंग के प्रेरण के बीच आसानी से मापने योग्य संक्रमण चुनते हैं।

यहां प्रस्तुत पद्धति विभिन्न प्रक्रियाओं में त्वचा पुनर्जनन के सुधार में बहुत प्रभावी साबित हुई है, जिसमें जलने की चिकित्सा और बाल कूप विकास शामिल हैं। ये अवलोकन आकस्मिक या पुरानी जलन और घावों के उपचार के लिए क्लीनिकों में इस तकनीक के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के कार्यान्वयन के लिए या विभिन्न विकृति त्वचा और विशेष रूप से, दोषपूर्ण स्टेम सेल कामकाज से जुड़े बाल कूप के लिए मार्ग प्रशस्त करते हैं।

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Disclosures

इस काम में वर्णित प्रक्रियाओं के सभी वाणिज्यिक अनुप्रयोगों को ईसी, एमआईसी और जेई द्वारा लिखित सीएसआईसी-यूएएम पेटेंट (EP2932967A1) द्वारा संरक्षित किया जाता है और वाणिज्यिक शोषण के लिए डर्मा इनोवेट एसएल को लाइसेंस दिया जाता है। डर्मा इनोवेट एसएल में जेई और जेजेएम की सलाहकार की स्थिति है।

Acknowledgments

इस काम को स्पेन के मिनिस्टरियो डी इकोनोमिया वाई कॉम्पेटिविडाड (आरटीसी-2014-2626-1 से जेई) और इंस्टीट्यूटो डी सालुद कार्लोस III (पीआई 15/01458 से जेई) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। ईसी को एट्राकिओन डी टैलेंटो इन्वेस्टिगडोर अनुदान 2017-टी 2 / बीएमडी -5766 (कोमुनिडैड डी मैड्रिड और यूएएम) द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine Sigma Aldrich B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein Roche 11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet) Veet
Dihydroethidium Sigma Aldrich 37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp Photocure ASA

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References

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वापसी अंक 159 प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) प्रोटोपोर्फिरीन IX फोटोजेनरेशन माउस त्वचा स्टेम कोशिकाएं ऊतक पुनर्जनन बाल कूप जलने की चिकित्सा।
"सीटू में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्विचेबल प्रोटोपोर्फिरिन IX-निर्भर फोटोजनरेशन द्वारा माउस त्वचा में स्टेम सेल निच और ऊतक पुनर्जनन की उत्तेजना"
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Espada, J., Carrasco, E., Calvo-Sánchez, M. I., Fernández-Martos, S., Montoya, J. J. Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ. J. Vis. Exp. (159), e60859, doi:10.3791/60859 (2020).

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