Summary
Syftet med detta protokoll är att inducera övergående in vivo-produktion av icke-dödliga nivåer av reaktiva syreradikaler (ROS) i mushud, vilket ytterligare främjar fysiologiska reaktioner i vävnaden.
Abstract
Här beskriver vi ett protokoll för att inducera omkopplingsbar in vivo fotogenerering av endogena reaktiva syreradikaler (ROS) i mushud. Denna övergående produktion av ROS in situ aktiverar effektivt cellproliferation i stamcellsnischer och stimulerar vävnadsregenerering, vilket starkt manifesteras genom accelerationen av brännskadeläkning och hårfollikeltillväxtprocesser. Protokollet är baserat på en reglerbar fotodynamisk behandling som behandlar vävnaden med prekursorer av den endogena fotosensibiliseraren protoporfyrin IX och bestrålar vidare vävnaden med rött ljus under tätt kontrollerade fysikalisk-kemiska parametrar. Sammantaget utgör detta protokoll ett intressant experimentellt verktyg för att analysera ROS-biologi.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) är resultatet av den kemiska reduktionen av molekylärt syre för att bilda vatten och inkluderar singlettsyre, superoxidanjon, väteperoxid och hydroxylradikalen 1,2,3. ROS har en mycket kort livslängd på grund av deras extremt kemiska reaktiva natur. I aeroba organismer bildas ROS för övrigt inuti cellerna som en viktig läckande biprodukt av aerob andning (elektrontransportkedja) i mitokondrierna. Övergående ackumulering av höga nivåer av ROS i cellen resulterar i ett oxidativt stresstillstånd som kan framkalla irreversibel inaktivering av proteiner, lipider och sockerarter och införandet av mutationer i DNA-molekylen 2,3,4,5. Den gradvisa ackumuleringen av oxidativ skada i celler, vävnader och hela organismer ökar stadigt med tiden och har associerats med induktion av celldödsprogram, flera patologier och åldringsprocessen 2,3,4,6.
Aeroba organismer har stadigt utvecklat effektiva molekylära mekanismer för att hantera överskott av ROS-ackumulering i celler och vävnader. Dessa mekanismer innefattar medlemmar av proteinfamiljen superoxiddismutas (SOD), som katalyserar superoxidradikaldismutation till molekylärt syre och väteperoxid, liksom olika katalaser och peroxidaser som använder antioxidantpoolen (glutation, NADPH, peroxiredoxin, thioredoxin 7,8) för att katalysera den efterföljande omvandlingen av väteperoxid till vatten och molekylärt syre.
Flera rapporter stöder dock ROS roll som nyckelkomponenter i molekylära kretsar som reglerar kritiska cellfunktioner, inklusive proliferation, differentiering och rörlighet 2,3,4. Detta koncept stöds ytterligare av den initiala identifieringen och karakteriseringen av dedikerade ROS-producerande mekanismer i aeroba organismer, inklusive lipoxygenaser, cyklooxygenaser och NADPH-oxidaser 9,10. I detta avseende uppvisar ROS en aktiv roll under embryoutveckling av ryggradsdjur 11,12,13 och nyckelroller för dessa molekyler i regleringen av specifika in vivo fysiologiska funktioner har rapporterats i olika experimentella system, inklusive differentieringsprogrammet för hematopoetiska förfäder i Drosophila14, helande induktion i zebrafisk eller svansregenerering i Xenopus grodyngel 15. Hos däggdjur har ROS varit involverat i självförnyelse/differentieringspotentialen hos neurala stamceller i en neurosfärmodell16 och i avregleringen av tarmstamcellsfunktionen under kolorektal cancerinitiering17. I huden har ROS-signalering associerats med epidermal differentiering och reglering av hudens stamcellsnisch och hårsäckens tillväxtcykel18,19.
I detta perspektiv är en viktig experimentell begränsning för att bestämma ROS fysiologiska roller i biologiska system, både under normala eller patologiska förhållanden, bristen på adekvata experimentella verktyg för att inducera kontrollerad produktion av dessa molekyler i celler och vävnader, som exakt liknar deras fysiologiska produktion som andra signalbudbärare. För närvarande innefattar de flesta experimentella tillvägagångssätt administrering av exogen ROS, mestadels i form av väteperoxid. Vi har nyligen implementerat ett experimentellt tillvägagångssätt för att slå på en övergående, icke-dödlig in vivo-produktion av endogen ROS i mushuden, baserat på administrering av prekursorer av den endogena fotosensibiliserande protoporfyrin IX (PpIX; t.ex. aminolaevulinsyra eller dess metylderivatmetylaminolevulinat) och ytterligare bestrålning av provet med rött ljus för att inducera in situ-bildning av ROS från intracellulärt molekylärt syre (figur 1). Denna fotodynamiska procedur kan effektivt användas för att stimulera inhemska stamcellsnischer, vilket aktiverar vävnadens regenerativa program19,20 och öppnar vägen för nya terapeutiska modaliteter inom hudregenerativ medicin. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av protokollet, som visar representativa exempel på stimulering av stamcellsnischer, mätt som en ökning av antalet långsiktiga 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) etiketthållande celler (LRC) i hårsäckens utbuktningsområde19,21 och efterföljande aktivering av regenereringsprogram (acceleration av hårväxt och brännläkningsprocesser) inducerad av övergående, icke-dödlig ROS-produktion i huden av C57Bl6-musstam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All mushållning och alla försöksförsök måste utföras i enlighet med lokal, nationell, internationell lagstiftning och riktlinjer för djurförsök.
1. Induktion av hårväxt, brännskadeinduktion och identifiering av långsiktiga BrdU LRC i svanshudepitelet
OBS: Använd 10-dagars eller 7-veckors gamla C57BL / 6-möss, helst kullkamrater, för de experimentella mönster som beskrivs nedan. I alla experimentella procedurer kommer djuren att bedövas genom 3% isofluran inhalation eller avlivas genom cervikal dislokation enligt indikation.
- Induktion av hårväxt i bakhuden hos möss i den andra telogenfasen (vilo) (cirka dag 50 efter födseln)
- Bedövar möss med inhalation av 3% isofluran. Bekräfta fullständig djup anestesi genom avsaknad av pedalreflex (fast tånyp). Raka två oberoende sida vid sida regioner av bakhuden i varje enskild mus med hårklippare och hårborttagningskräm (Table of Materials). Använd vänster sida för kontroll och höger sida för behandling.
OBS: Kontrollera att den underliggande rygghuden efter rakning är rosa och inte grå/svart, vilket är en indikator på melanogenes och inträde i anagenfasen (växande) i denna musstam. - Tvätta noggrant med PBS för att avlägsna alla krämrester och fortsätt till induktion av övergående in situ-produktion av icke-dödliga ROS-nivåer enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.
- Registrera hårsäckstillväxt genom daglig insamling av högupplösta bilder av kontrollen och behandlade bakre hudområden hos varje djur (t.ex. med hjälp av en HD-kamera kopplad till en 5-20x binokulär lins).
- Bedövar möss med inhalation av 3% isofluran. Bekräfta fullständig djup anestesi genom avsaknad av pedalreflex (fast tånyp). Raka två oberoende sida vid sida regioner av bakhuden i varje enskild mus med hårklippare och hårborttagningskräm (Table of Materials). Använd vänster sida för kontroll och höger sida för behandling.
- Induktion av 2:a gradens brännskador i rygghuden hos möss i den andra telogenfasen (vilo) (cirka dag 50 postnatal)
- Bedövar möss. Raka hela rygghudsregionen i varje mus med hårklippare och hårborttagningskräm och tvätta noggrant med PBS för att ta bort alla krämrester.
OBS: Administrera in situ subkutana injektioner av lidokain 0,5% (2 mg / ml) i steril saltlösning, högst 7 mg / ml, strax före bränningsproceduren. - Förvärm en mässingsstång (1 cm i tvärsnitt) vid 95 °C genom att doppa i kokande vatten och applicera sedan på den centrala delen av ryggytan på varje mus i 5 timmar.
- Strax efter brännskadegenerering injiceras djuren intraperitonealt med 1 ml fysiologisk lösning (0,9% NaCl) på en elektrisk filt för att förhindra uttorkning. Låt djuren återhämta sig under 24 timmar och fortsätt till induktion av övergående in situ-produktion av icke-dödliga ROS-nivåer enligt beskrivningen i avsnitt 2.3.
- Registrera sårprogression genom daglig insamling av högupplösta bilder av kontrollen och behandlade bakre hudområden hos varje djur (t.ex. med hjälp av en HD-kamera kopplad till en 5-20x binokulär lins).
- Bedövar möss. Raka hela rygghudsregionen i varje mus med hårklippare och hårborttagningskräm och tvätta noggrant med PBS för att ta bort alla krämrester.
- Generering och identifiering av långsiktiga BrdU LRC i svanshudepitelet
- Injicera 10/14 dagar gamla kullkamrater intraperitonealt (ingen anestesi) en gång dagligen i 4 dagar i följd med BrdU på 50 mg/kg kroppsvikt upplöst i PBS. Efter märkningsfasen, låt möss växa i 50-60 dagar före någon behandling.
OBS: Använd en ny nål för varje injektion. - Fortsätt enligt beskrivningen i avsnitt 2.3 för induktion av övergående icke-dödlig ROS-produktion in situ i svanshuden vid olika tidpunkter före beredningen av vävnadshelmonteringar.
- För att förbereda helafästen av svansepidermis, avliva möss genom cervikal dislokation och klipp svansarna med kirurgisk sax.
- Använd en skalpell för att göra ett rakt längsgående snitt längs svansen och skala hela huden som en enda bit från ryggraden. Inkubera den skalade huden i 5 mM EDTA i PBS i 5 ml rör i 4 timmar vid 37 °C och separera försiktigt intakta ark av epidermis från dermis med pincett.
- Fixera vävnaden i 4% formaldehyd i PBS i minst 72 timmar vid rumstemperatur (RT) och fortsätt för BrdU-detektion med lämpliga antikroppar.
- Använd fluorescens/konfokalmikroskopi för att identifiera och kvantifiera LRC i varje experimentellt tillstånd, inklusive ljuskontroller och fotodynamiska behandlingar vid olika tidpunkter före beredning av vävnadshelheter, som tidigare beskrivits i detalj19,20.
OBS: Fasta epidermala ark kan förvaras i PBS innehållande 0,02% natriumazid vid 4 ° C i upp till tre månader. Fasta epidermala ark kan användas för immunlokalisering av erforderliga proteiner enligt standardprocedurer för histologiska snitt.
- Injicera 10/14 dagar gamla kullkamrater intraperitonealt (ingen anestesi) en gång dagligen i 4 dagar i följd med BrdU på 50 mg/kg kroppsvikt upplöst i PBS. Efter märkningsfasen, låt möss växa i 50-60 dagar före någon behandling.
2. Induktion av övergående produktion av icke-dödliga ROS-nivåer i mushud
OBS: För att inducera övergående produktion av icke-dödliga ROS-nivåer i mushud kommer en fotodynamisk behandling med användning av en föregångare till den endogena fotosensibiliseraren PpIX, i detta fall metylaminolevulinat (mALA) och rött ljus att användas.
- För att aktivera övergående ROS-produktion för induktion av hårväxt i bakhuden, förbered djuren enligt anvisningarna i avsnitt 1.1.
- Applicera ~ 25 mg mALA i form av aktuell kräm (Table of Materials) på höger region, håll vänster sida som en intern kontroll för att undvika interindividuella skillnader. Inkubera i 2,5 timmar i mörkret, tvätta bort överflödig grädde noggrant med PBS. För att bekräfta anestesidjupet, övervaka djuren var 10: e minut tills de är helt återställda.
OBS: Produktionen av PpIX i den bakre huden bör testas in situ genom dess röda fluorescens under blått ljus (407 nm) excitation. - Bedöva djuren.
- Bestråla hela bakhuden med en lämplig källa för rött ljus (Table of Materials) för en total dos på 2,5−4 J/cm2. Håll mössen på en elektrisk filt tills de har återhämtat sig helt och fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.1.3.
OBS: Irradiansen bör justeras genom att manipulera avståndet mellan ljuskällan och vävnaden och mätas med hjälp av en effektenergimätare (Table of Materials). Experimentet anses vara avslutat när full hårväxt observeras i någon av de oberoende rakade regionerna hos varje djur. Hela proceduren innebär bara en enda fotobehandling.
- Applicera ~ 25 mg mALA i form av aktuell kräm (Table of Materials) på höger region, håll vänster sida som en intern kontroll för att undvika interindividuella skillnader. Inkubera i 2,5 timmar i mörkret, tvätta bort överflödig grädde noggrant med PBS. För att bekräfta anestesidjupet, övervaka djuren var 10: e minut tills de är helt återställda.
- För att slå på övergående ROS-produktion för läkningsförbättring av 2:a gradens brännskador, förbered djuren enligt avsnitt 1.2.
- Applicera ~ 25 mg mALA i form av aktuell kräm längs den brända ytan, som omfattar cirka 4 mm intilliggande vävnad. Inkubera i 2,5 timmar i mörkret, tvätta bort överflödig grädde noggrant med PBS. För att bekräfta anestesidjupet, övervaka djuren var 10: e minut tills de är helt återställda.
- Bedöva djuren.
- Bestråla hela bakhuden med en lämplig källa för rött ljus för en total dos på 2,5−4 J/cm2. Håll mössen på en elektrisk filt tills de har återhämtat sig helt och fortsätt enligt beskrivningen i steg 1.2.4.
OBS: Försöksproceduren för varje djur anses vara avslutad när full brännläkning observeras. Hela proceduren innebär bara en enda fotobehandling.
- För att aktivera övergående ROS-produktion i svanshud, förbered möss enligt avsnitt 1.3, applicera ~ 25 mg mALA i form av topikal kräm längs hela ryggvävnadsområdet och fortsätt enligt beskrivningen i avsnitt 2.1 för rygghud. Utför fotobehandlingar och korrespondentljuskontroller 24 timmar, 48 timmar eller 72 timmar före avlivning av djur och ytterligare extraktion av svansskinnets hela fästen.
OBS: I alla experimentella konstruktioner, analysera ROS-beroendet av processen med hjälp av antioxidant ROS-asätare (t.ex. daglig inokulering av 100 mg / kg kroppsvikt N-acetylcystein genom intraperitoneal injektion av en 20 mg / ml lösning i PBS, pH 7,2, med början 5 dagar före mALA-behandlingar eller, alternativt, två doser av 100 mg / ml askorbinsyra i 50% etanol, 30 min, appliceras lokalt på huden i tidsintervallet mellan mALA-behandlingarna och bestrålning med rött ljus).
3. ROS-detektering i huden
- Ex vivo-utvärdering av ROS-produktion i svanshud efter fotodynamisk behandling med hydroetidin
OBS: Hydroetidin är en icke-fluorescerande molekyl som reagerar specifikt med ROS för att producera fluorescerande färgämne 2-hydroxietidium (hET).- Inkubera hela svansskinn som erhållits enligt beskrivningen i avsnitt 1.3.3 i 3 timmar vid 37 °C i 5 mM EDTA i PBS-lösning (kontrollprover) eller som dessutom innehåller 2 mM mALA (fotodynamiska behandlingsprover).
- Tillsätt i samtliga fall hydroetidin till en slutlig koncentration på 3,2 μM från en 25 mg/ml stam i dimetylsulfoxid (DMSO) och inkubera i 1 timme i mörker vid rumstemperatur.
- Sträck svanshudsproverna över en glasyta med fingertopparna och bestråla med 636 nm rött ljus vid en 10 J/cm2 fluens.
- Fortsätt omedelbart att separera epidermis från dermis och fixera epidermala ark enligt beskrivningen i avsnitt 1.3.3.
- Utvärdera hET-rödemissionen under ett fluorescens/konfokalmikroskop med hjälp av grönt spännande ljus, ta högkvalitativa bilder och fortsätt med vidare analys.
OBS: Använd hET-färgning av vävnadsprover i frånvaro av fotodynamisk behandling som en negativ kontroll för hET-autoxidation.
- In vivo-detektion av ROS-produktion i den bakre huden efter induktion av hårväxt och brännskadeläkning följt av fotodynamisk behandling
OBS: Detta steg utförs med användning av 2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DHF-DA), en cellpermeant icke-fluorescerande förening som, efter klyvning av intracellulära esterasenzymer, reagerar specifikt med ROS som ger 2',7'-diklorfluorescein (DCF) fluorescerande färgämne.- Använd djur som är förberedda för induktion av hårväxt (avsnitt 1.1) eller brännskadeläkning (avsnitt 1.2). Strax före topikala mALA kräm behandlingar (se avsnitt 2.1 och 2.2), dosera lokalt 100 μL av 1 mg / ml i 50% etanol av DHF-DA på alla målkontroll / behandlade hudområden, låt huden helt absorbera materialet och fortsätt framåt med aktuell mALA kräm ansökan.
- Inkubera behandlade djur i 4 timmar i mörker, tvätta den aktuella mALA krämen noggrant från huden med PBS och dispensera en andra dos av 100 μL DHF-DA lösning på huden. För att bekräfta anestesidjupet, övervaka djuren var 10: e minut tills de är helt återställda.
- Inkubera behandlade djur i 50 minuter i mörker, bedöva och bestråla hela bakhuden med en flyt som sträcker sig från 2,5 till 4 J/cm2 av 636 nm rött ljus med en LED-lampa.
- Omedelbart efter bestrålning, utvärdera ROS-nivåer som genereras i huden med hjälp av ett in vivo-bildsystem (Table of Materials). Ställ in filterboxen för 445−490 nm excitation och 515−575 nm emission, ta högkvalitativa bilder och fortsätt med ytterligare analys.
OBS: Använd DHF-DA-färgning av vävnadsprover i frånvaro av fotodynamisk behandling som negativ kontroll för DHF-DA-autoxidation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den topiska administreringen av mALA-prekursorn i musens rygg- och svanshud resulterar i en signifikant ackumulering av PpIX i hela vävnaden och märkbart i hårsäcken, vilket demonstreras av den rödrosa fluorescensen hos denna förening under excitation av blått ljus (407 nm) (figur 2A, C). Efterföljande bestrålning av behandlad vävnad med rött ljus (636 nm) vid en fluens av 2,5−4 J/cm2 främjar övergående produktion av ROS i vävnaden, särskilt i hårsäckens utbuktningsområde (figur 2B,D).
Att slå på icke-dödlig ROS-produktion i mushud in vivo främjar en signifikant ökning av antalet LRC, kategoriserade som somatiska stamceller, i hårsäckens utbuktningsområde två dagar efter fotobehandlingar (figur 3, vänstra paneler). I synnerhet är ökningen av antalet LRC övergående och återställs till normala nivåer 6 dagar efter behandlingar (figur 3, höger panel). Eftersom denna region är en av de viktigaste stamcellsnischerna i mushud, återspeglar en övergående induktion av cellproliferation i denna region huvudsakligen den funktionella aktiveringen av utbuktningsnischen och de bosatta stamcellsprogrammen för proliferation och differentiering22,23.
Den ROS-beroende aktiveringen av den utbuktande hårfollikelnischen är vidare associerad med fysiologiska svar i huden. Således påskyndar övergående ROS-produktion särskilt hudläkningsprocessen efter en 2:a graders brännskada (figur 4A, B). Kvantifiering av den gradvisa minskningen av det skadade / skorvhudområdet visar robustheten och den statistiska signifikansen av sårläkningsaccelerationsprocessen inducerad av PpIX-beroende övergående ROS-produktion i vävnaden (figur 4C). På samma sätt främjar icke-dödliga ROS-nivåer starkt hårväxt efter rakning under den andra samordnade telogenen (figur 5A), en fas under vilken hårsäcken är eldfast för att svara på tillväxtstimuli22,23, vilket utgör ett adekvat sätt att utvärdera potentialen hos nya föreningar och / eller processer för att stimulera hårväxt. I synnerhet resulterar användningen av antioxidantföreningar som askorbinsyra (AA) i en statistiskt signifikant minskning av antalet djur som visar accelererad hårväxt (figur 5B). Dessutom reduceras ROS-produktionen i huden efter fotobehandlingar, kvantifierad av fluorescerande utsläpp av DHF i huden, också signifikant av antioxidantföreningar (figur 5C). Tillsammans visar dessa resultat att ROS-produktion efter PpIX-baserade fotobehandlingar är strikt nödvändig för att inducera ett fysiologiskt svar i vävnaden.
Figur 1: Teoretisk bakgrund för kontrollerad påkoppling av endogen fotodynamisk produktion av ROS in situ i celler och vävnader med hjälp av hembiosyntesvägen. (A) Schematisk representation av de grundläggande fotokemiska reaktioner som resulterar i molekylär syreexcitation under fotodynamiska behandlingar. Vid absorption av ljus med lämpligt λ genomgår en fotosensibiliserande molekyl (PS) i grundtillståndet S0 en övergång till ett exciterat singletttillstånd S1. Eftersom något exciterat tillstånd är energiskt mindre föredraget än grundtillståndet, återgår molekylen till S0 efter en kort tidsperiod. De flesta PS har en hög kvanteffektivitet för övergången från S 1 till tripletttillståndet T1, som i allmänhet kännetecknas av en relativt lång livslängd. Aktiverat PS i det exciterade tripletttillståndet kan reagera med andra molekyler via två olika vägar. En typ I fotokemisk reaktion är överföringen av elektroner till intilliggande molekyler för att bilda radikala arter; dessa radikaler reagerar sannolikt med molekylärt syre för att producera ROS, inklusive superoxidanjon (•O2-), väteperoxid (H2O2) och hydroxylradikal (•OH). En typ II fotokemisk reaktion representerar den dominerande processen för de flesta PS som används i PDT. Under denna reaktion driver överföringen av energi (inte elektroner) till molekylärt syre (vars konfiguration i marktillståndet är tripletten, 3O2) bildandet av det icke-radikala men mycket reaktiva singlettsyret (1O2). De fotoprodukter som bildas under dessa reaktioner utlöser en kaskad av biokemiska händelser som resulterar i en oxidativ stress som slutligen orsakar celldöd eller som potentiellt kan stimulera celltillväxt. (B) 5-aminolevulinsyra (ALA) är en naturlig föregångare i hembiosyntesvägen, som involverar både mitokondriella och cytosoliska cellulära fack. ALA-syntasenzymaktiviteten regleras av en negativ återkopplingskontroll där fritt hem, slutprodukten av denna väg, hämmar syntesen av ALA från glycin och bärnstensyl CoA. Administreringen av exogent ALA eller dess derivat metylaminolevulinat (mALA) kringgår det regulatoriska återkopplingssystemet, så att nedströms metaboliter, särskilt protoporfyrin IX (PpIX), ackumuleras i cellinducerande fotosensibilisering. De hastighetsbegränsande egenskaperna hos ferrokelatas, katalysatorenzym för järninsättningen i PpIX, främjar ackumuleringen av denna endogena PS-förening. PBG = porphobilinogen. Denna siffra har modifierats från Carrasco et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fotodynamisk behandling med mALA och rött ljus inducerar övergående produktion av ROS i huden. (A) Ackumulering av endogent PpIX efter mALA topic behandling i rygghud. Vänster sida i samma djur användes som kontroll. (B) Vänster panel: PpIX-beroende ROS-produktion (mALA + Light) övervakad av DHF-DA. Höger panel: tidsförloppsanalys av relativ ROS-produktion i bakre huden; den relativa integrerade densiteten av DHF-DA fluorescerande emission av mALA + Light kontra Light-regioner i varje djur kvantifierades vid olika tidpunkter efter bestrålning och normaliserades enligt beskrivningen i metodiken. Medelvärdet ± SE representerades (n = 4 för varje tidpunkt). (C) Lokalisering av PpIX i svanshud (fluorescensmikroskopibilder). (D) ROS-produktion i svanshud efter mALA + Light som avslöjas av hET som visar en ökad och ihållande ackumulering i hårsäckens utbuktningsområde. Representativa konfokalmikroskopibilder (maximala projektioner) visas. Skalstång = 100 μm. Denna siffra har modifierats från Carrasco et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Att slå på in situ ROS-produktion i huden främjar en signifikant ökning av stamceller i utbuktningsområdet i hårfollikelnischen. Vänster paneler: representativa konfokalmikroskopibilder (maximala projektioner) som visar lokaliseringen av BrdU-etiketthållande celler (LRC) i mussvansskinnets hela fästen och den uppenbara ökningen av LRC i hårsäckarnas utbuktningsområde 2 dagar efter PpIX-baserade fotobehandlingar. Höger panel: kvantifiering av antalet LRC i hårfollikelns utbuktningsregion. Medelvärdet + SE (n = 4) representeras. Skalstapel = 50 μm. Denna siffra har modifierats från Carrasco et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Att slå på in situ ROS-produktion i huden påskyndar brännskadeläkning. (A) PpIX-produktion inducerad av mALA i brännskadade områden hos behandlade djur jämfört med kontrollprover. (B) Brännläkningsevolution hos mALA+Ljusbehandlade djur och kontrolldjur. (C) Tidskvantifiering av brända områden (vänster panel) som visar accelererad brännskadeläkning hos mALA+Lättbehandlade djur. medelvärdet + SE (n = 4) av oläkt område representeras. Area-under-the-curve-analys (höger panel) som visar statistiska skillnader mellan båda tidsförloppskurvorna (p ≤ 0,06). Denna siffra har modifierats från Carrasco et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Att slå på in situ ROS-produktion i huden stimulerar hårväxten. (A) Övre raden: Induktion av hårväxt under den eldfasta telogenfasen av mALA + Light (höger sida av dorsal hud) jämfört med ljuskontrollregion (vänster sida). Nedre raden: Både ROS-produktionen i huden och accelerationen av hårväxt inducerad av mALA + Light hämmas av askorbinsyra (AA) antioxidantbehandling. (B) Kvantifiering av procentandelen djur som uppvisar accelererad hårväxt i mALA-PT jämfört med kontrollregionen i frånvaro eller närvaro av antioxidanten AA (n = 4 i 3 oberoende försök). (C) Kvantifiering av ROS-produktionshämningen i dorsal hud inducerad av AA under mALA-PT (n = 4). I samtliga fall representerar staplar medelvärde + SE. Denna siffra har modifierats från Carrasco et al.19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metodik som möjliggör en övergående aktivering av endogen ROS-produktion in vivo i mushud med fysiologiska effekter. Metoden är baserad på en fotodynamisk procedur för att inducera en kontrollerad och lokal stimulering av den endogena fotosensibiliseraren PpIX (figur 1B). Detta experimentella tillvägagångssätt är ett intressant verktyg för att studera ROS-biologi i in vivo-experimentella system som utgör ett betydande framsteg jämfört med metoder som använder externa ROS-källor (vanligtvis väteperoxid) och möjliggör kontrollerad och lokal produktion av ROS i vävnaden / provet.
Med tanke på att aminolevulinatbaserade prekursorer administreras i överskott för att främja ackumuleringen av PpIX inuti cellerna, är ett kritiskt steg i denna metod upprättandet av en adekvat ljusdos för att inducera övergående produktion av ROS-nivåer i vävnaden under skadetröskeln men visar en stark stimulerande effekt. För närvarande finns det ingen tillgänglig teknik för att direkt kvantifiera den exakta mängden av någon typ av ROS som produceras i celler och vävnader. I vår metodik är det fortfarande inte möjligt att fastställa en direkt korrelation mellan en given ljusdos, den exakta mängden ROS som produceras och en given biologisk effekt (t.ex. celldöd eller cellproliferation). Av denna anledning bör ljusdosen (fluens) för en viss experimentell modell fastställas empiriskt av forskaren med hjälp av kvalitativa eller semikvalitativa parametrar som valts för varje situation. När det gäller mushud väljer vi en lätt mätbar övergång mellan celldöd och vävnadsskada och induktion av en signifikant och övergående proliferativ våg.
Metoden som presenteras här har visat sig vara mycket effektiv för att förbättra hudregenerering i olika processer, inklusive brännskadeläkning och hårfollikeltillväxt. Dessa observationer banar väg för genomförandet av terapeutiska tillämpningar av denna teknik i kliniker för behandling av tillfälliga eller kroniska brännskador och sår eller för olika patologier hud och, i synnerhet, av hårsäcken som involverar en defekt stamcellsfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla kommersiella tillämpningar av de förfaranden som beskrivs i detta arbete skyddas av ett CSIC-UAM-patent (EP2932967A1) författat av EC, MIC och JE och licensierat till Derma Innovate SL för kommersiellt utnyttjande. JE och JJM har en rådgivande position i Derma Innovate SL.
Acknowledgments
Detta arbete har fått stöd från Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 till JE) och Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 till JE) i Spanien. EG har fått stöd av Atracción de Talento Investigador-bidraget 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid och UAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
