Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحفيز منافذ الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة في جلد الفأر عن طريق التوليد الضوئي المعتمد على البروتوبورفيرين التاسع لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/60859
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 1, 5
1Ramón y Cajal Institute for Health Research (IRYCIS), Ramón y Cajal University Hospital, 2Centro Integrativo de Biología y Química Aplicada (CIBQA), Universidad Bernardo O'Higgins, 3Department of Molecular Biology, Faculty of Sciences, Universidad Autónoma de Madrid (UAM), 4Instituto de Investigaciones Biosanitarias, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 5Department of Radiology, Rehabilitation & Physiotherapy, Faculty of Medicine, Complutense University

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تحفيز الإنتاج العابر في الجسم الحي لمستويات غير قاتلة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في جلد الفأر ، مما يعزز الاستجابات الفسيولوجية في الأنسجة.

Abstract

هنا ، نصف بروتوكولا للحث على التوليد الضوئي القابل للتحويل في الجسم الحي لأنواع الأكسجين التفاعلية الداخلية (ROS) في جلد الفأر. هذا الإنتاج العابر لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع ينشط بكفاءة تكاثر الخلايا في منافذ الخلايا الجذعية ويحفز تجديد الأنسجة كما يتجلى بقوة من خلال تسريع عمليات التئام الحروق ونمو بصيلات الشعر. يعتمد البروتوكول على علاج ديناميكي ضوئي قابل للتنظيم يعالج الأنسجة بسلائف المحسس الضوئي الداخلي البروتوبورفيرين التاسع ويزيد من تشعيع الأنسجة بالضوء الأحمر تحت معايير فيزيائية كيميائية خاضعة لرقابة مشددة. بشكل عام ، يشكل هذا البروتوكول أداة تجريبية مثيرة للاهتمام لتحليل بيولوجيا ROS.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي نتيجة الاختزال الكيميائي للأكسجين الجزيئي لتكوين الماء ، وتشمل الأكسجين المفرد ، وأنيون الأكسيد الفائق ، وبيروكسيد الهيدروجين ، وجذر الهيدروكسيل1،2،3. تتمتع أنواع الأكسجين التفاعلية بعمر قصير جدا بسبب طبيعتها الكيميائية شديدة التفاعل. في الكائنات الهوائية ، تتشكل أنواع الأكسجين التفاعلية بشكل عرضي داخل الخلايا كمنتج ثانوي رئيسي متسرب للتنفس الهوائي (سلسلة نقل الإلكترون) في الميتوكوندريا. يؤدي التراكم العابر لمستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلية إلى حالة إجهاد تأكسدي قد تؤدي إلى تعطيل لا رجعة فيه للبروتينات والدهون والسكريات وإدخال طفرات في جزيء الحمض النووي2،3،4،5. يزداد التراكم التدريجي للضرر التأكسدي في الخلايا والأنسجة والكائنات الحية بأكملها بشكل مطرد مع مرور الوقت وقد ارتبط بتحريض برامج موت الخلايا والعديد من الأمراض وعملية الشيخوخة2،3،4،6.

طورت الكائنات الهوائية بشكل مطرد آليات جزيئية فعالة لمعالجة تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية الزائدة في الخلايا والأنسجة. تشمل هذه الآليات أعضاء عائلة بروتين ديسموتاز الفائق (SOD) ، والتي تحفز التحول الجذري للأكسيد الفائق إلى أكسجين جزيئي وبيروكسيد الهيدروجين ، بالإضافة إلى محفزات وبيروكسيديز مختلفة تستخدم تجمع مضادات الأكسدة (الجلوتاثيون ، NADPH ، بيروكسيريدوكسين ، ثيوريدوكسين 7,8) لتحفيز التحويل اللاحق لبيروكسيد الهيدروجين إلى ماء وأكسجين جزيئي.

ومع ذلك ، تدعم العديد من التقارير دور أنواع الأكسجين التفاعلية كمكونات رئيسية للدوائر الجزيئية التي تنظم وظائف الخلايا الحرجة ، بما في ذلك الانتشار والتمايز والتنقل2،3،4. يتم دعم هذا المفهوم بشكل أكبر من خلال التحديد والتوصيف الأولي لآليات إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المخصصة في الكائنات الهوائية ، بما في ذلك إنزيمات الأكسدة الحلقية لأكسيجيناز الشحمية وأوكسيديز NADPH 9,10. بهذا المعنى ، تظهر أنواع الأكسجين التفاعلية دورا نشطا أثناء تطور جنين الفقاريات 11،12،13 وقد تم الإبلاغ عن الأدوار الرئيسية لهذه الجزيئات في تنظيم وظائف فسيولوجية محددة في الجسم الحي في أنظمة تجريبية مختلفة ، بما في ذلك برنامج التمايز للأسلاف المكونة للدم في ذبابة الفاكهة14 ، أو تحريض الشفاء في الزرد ، أو تجديد الذيل في الضفادع الصغيرة Xenopus 15. في الثدييات ، شاركت أنواع الأكسجين التفاعلية في إمكانات التجديد الذاتي / التمايز للخلايا الجذعية العصبية في نموذج الغلاف العصبي16 وفي تحرير وظيفة الخلايا الجذعية المعوية أثناء بدء سرطان القولون والمستقيم17. في الجلد ، ارتبطت إشارات ROS بتمايز البشرة وتنظيم مكانة الخلايا الجذعية للجلد ودورة نمو بصيلات الشعر18,19.

في هذا المنظور ، يتمثل أحد القيود التجريبية الرئيسية لتحديد الأدوار الفسيولوجية لأنواع الأكسجين التفاعلية في النظم البيولوجية ، سواء في الظروف العادية أو المرضية ، في عدم وجود أدوات تجريبية كافية للحث على الإنتاج الخاضع للرقابة لهذه الجزيئات في الخلايا والأنسجة ، والتي تشبه بدقة إنتاجها الفسيولوجي كرسل إشارات ثانية. في الوقت الحاضر ، تتضمن معظم الأساليب التجريبية إدارة أنواع الأكسجين التفاعلية الخارجية ، ومعظمها في شكل بيروكسيد الهيدروجين. لقد قمنا مؤخرا بتنفيذ نهج تجريبي لتشغيل إنتاج عابر وغير قاتل في الجسم الحي من أنواع الأكسجين التفاعلية الداخلية في جلد الفأر ، بناء على إعطاء سلائف البروتوبورفيرين التاسع المحسس للضوء الداخلي (PpIX ؛ على سبيل المثال ، حمض أمينولايفولينيك أو مشتقه من الميثيل ميثيل أمينوليفولينات) والمزيد من تشعيع العينة بالضوء الأحمر للحث على تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع من الأكسجين الجزيئي داخل الخلايا (الشكل 1). يمكن استخدام هذا الإجراء الضوئي الديناميكي بكفاءة لتحفيز منافذ الخلايا الجذعية المقيمة ، وبالتالي تنشيط البرامج التجديدية للأنسجة19،20 وفتح الطريق لطرق علاجية جديدة في الطب التجديدي للجلد. هنا ، نقدم وصفا تفصيليا للبروتوكول ، ونعرض أمثلة تمثيلية لتحفيز منافذ الخلايا الجذعية ، تقاس بزيادة في عدد الخلايا المحتفظة بعلامة 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) على المدى الطويل (LRCs) في منطقة الانتفاخ من بصيلات الشعر19,21 ، والتنشيط اللاحق لبرامج التجديد (تسريع نمو الشعر وعمليات التئام الحروق) الناجمة عن عابرة ، إنتاج ROS غير المميت في جلد سلالة الماوس C57Bl6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب إجراء جميع إجراءات تربية الفئران والتجارب وفقا للتشريعات والمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية والدولية بشأن التجارب على الحيوانات.

1. تحريض نمو الشعر ، وتحريض الحروق وتحديد BrdU LRCs على المدى الطويل في ظهارة جلد الذيل wholemounts

ملاحظة: استخدم الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 10 أيام أو 7 أسابيع ، ويفضل أن تكون زميلة القمامة ، للتصميمات التجريبية الموضحة أدناه. في جميع الإجراءات التجريبية ، سيتم تخدير الحيوانات عن طريق استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 3 ٪ أو القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم كما هو موضح.

  1. تحريض نمو الشعر في الجلد الخلفي للفئران في المرحلة الثانية من التيلوجين (الراحة) (حوالي اليوم 50 بعد الولادة)
    1. تخدير الفئران مع استنشاق 3 ٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العميق الكامل بسبب عدم وجود منعكس دواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة). احلق منطقتين مستقلتين جنبا إلى جنب من الجلد الخلفي في كل فأرة باستخدام أدوات قص الشعر وكريم إزالة الشعر (جدول المواد). استخدم الجانب الأيسر للتحكم والجانب الأيمن للعلاج.
      ملاحظة: تأكد من أنه بعد الحلاقة ، يكون جلد الظهر تحت البقعة ورديا وليس رماديا / أسود ، وهو مؤشر على تكوين الميلانين والدخول في مرحلة التنامي (النمو) في سلالة الفأر هذه.
    2. اغسل جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة جميع بقايا الكريم والمضي قدما في تحريض الإنتاج العابر في الموقع لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة كما هو موضح في القسم 2.1.
    3. سجل نمو بصيلات الشعر من خلال الحصول اليومي على صور عالية الدقة لمناطق الجلد الخلفية المعالجة والمعالجة في كل (على سبيل المثال ، باستخدام كاميرا عالية الدقة مقترنة بعدسة مجهر 5-20x).
  2. تحريض آفاتحرق الدرجة 2 في الجلد الخلفي للفئران في مرحلة التيلوجين الثانية (الراحة) (حوالي اليوم 50 بعد الولادة)
    1. تخدير الفئران. احلق منطقة الجلد الخلفي بالكامل في كل فأر باستخدام ماكينة قص الشعر وكريم إزالة الشعر واغسلها جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة جميع بقايا الكريم.
      ملاحظة: يتم تطبيق حقن ليدوكائين تحت الجلد في موضعية 0.5٪ (2 ملغ/ مل) في محلول ملحي معقم، لا يتجاوز 7 ملغ/ مل، قبل إجراء الحرق مباشرة.
    2. سخني قضيبا نحاسيا (1 سم في المقطع العرضي) عند 95 درجة مئوية عن طريق الغمر في الماء المغلي ثم ضعيه على المنطقة المركزية من سطح الجلد الخلفي الظهري لكل فأر لمدة 5 ثوان.
    3. بعد توليد الحرق مباشرة ، قم بحقن الحيوانات داخل الصفاق ب 1 مل من المحلول الفسيولوجي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) على بطانية كهربائية لمنع الجفاف. دع الحيوانات تتعافى لمدة 24 ساعة والمضي قدما في تحريض الإنتاج العابر في الموقع لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة كما هو موضح في القسم 2.3.
    4. سجل تطور جرح الحروق من خلال الحصول اليومي على صور عالية الدقة للتحكم ومناطق الجلد الخلفية المعالجة في كل (على سبيل المثال ، باستخدام كاميرا عالية الدقة مقترنة بعدسة مجهر 5-20x).
  3. توليد وتحديد BrdU LRCs على المدى الطويل في ظهارة جلد الذيل
    1. حقن رفقاء القمامة بعمر 10/14 يوما داخل الصفاق (بدون تخدير) مرة واحدة يوميا لمدة 4 أيام متتالية مع إذابة 50 مجم / كجم من وزن الجسم BrdU في برنامج تلفزيوني. بعد مرحلة وضع العلامات ، اترك الفئران تنمو لمدة 50-60 يوما قبل أي علاج.
      ملاحظة: استخدم إبرة جديدة لكل حقنة.
    2. تابع كما هو موضح في القسم 2.3 لتحريض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية غير المميتة العابرة في الموقع في جلد الذيل في أوقات مختلفة قبل تحضير الأنسجة الكاملة.
    3. لتحضير حوامل كاملة من بشرة الذيل ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم وقص ذيول المقص الجراحي.
      1. استخدم مشرطا لعمل شق طولي مستقيم على طول الذيل وقشر الجلد بالكامل كقطعة واحدة من العمود الفقري. احتضان الجلد المقشر في 5 مللي متر EDTA في PBS في أنابيب 5 مل لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية وافصل بعناية صفائح البشرة السليمة عن الأدمة باستخدام الملقط.
      2. ثبت الأنسجة في 4٪ فورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT) وتابع اكتشاف BrdU باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.
      3. استخدم الفحص المجهري الفلوري / متحد البؤر لتحديد وقياس مراكز مصادر التعلم في كل حالة تجريبية ، بما في ذلك عناصر التحكم في الضوء والعلاجات الديناميكية الضوئية في أوقات مختلفة قبل تحضير الأنسجة الكاملة ، كما هو موضح سابقا بالتفصيل19،20.
        ملاحظة: يمكن تخزين صفائح البشرة الثابتة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. يمكن استخدام صفائح البشرة الثابتة لتحديد الموقع المناعي للبروتينات المطلوبة باتباع إجراءات المقاطع النسيجية القياسية.

2. تحريض الإنتاج العابر لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة في جلد الفأر

ملاحظة: للحث على الإنتاج العابر لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة في جلد الفأر ، سيتم استخدام علاج ديناميكي ضوئي باستخدام مقدمة من المحسس الضوئي الداخلي PpIX ، في هذه الحالة ، ميثيل أمينوليفولينات (mALA) ، والضوء الأحمر.

  1. لتشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابرة لتحريض نمو الشعر في الجلد الخلفي ، قم بإعداد الحيوانات كما هو موضح في القسم 1.1.
    1. ضع ~ 25 مجم من mALA على شكل كريم موضعي (جدول المواد) على المنطقة اليمنى ، مع الحفاظ على الجانب الأيسر كتحكم داخلي لتجنب الاختلافات بين الأفراد. احتضان لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، وغسل كريم الزائد جيدا مع برنامج تلفزيوني. لتأكيد عمق التخدير ، راقب الحيوانات كل 10 دقائق حتى تتعافى تماما.
      ملاحظة: يجب اختبار إنتاج PpIX في الجلد الخلفي في الموقع من خلال مضان أحمر تحت إثارة الضوء الأزرق (407 نانومتر).
    2. تخدير الحيوانات.
    3. قم بتشعيع الجلد الخلفي بالكامل بمصدر ضوء أحمر مناسب (جدول المواد) بجرعة إجمالية قدرها 2.5−4 جول / سم2. احتفظ بالفئران على بطانية كهربائية حتى تتعافى تماما وتابع كما هو موضح في الخطوة 1.1.3.
      ملاحظة: يجب ضبط الإشعاع عن طريق معالجة المسافة بين مصدر الضوء والأنسجة وقياسها باستخدام مقياس طاقة الطاقة (جدول المواد). تعتبر التجربة منتهية عند ملاحظة نمو الشعر الكامل في أي من مناطق حلق مستقلة لكل. يتضمن الإجراء بأكمله معالجة صورة واحدة فقط.
  2. لتشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابرة لتحسين الشفاء من آفات الحروقمن الدرجة الثانية ، قم بإعداد الحيوانات كما هو موضح في القسم 1.2.
    1. ضع ~ 25 مجم من mALA على شكل كريم موضعي على طول السطح المحروق ، ويشمل حوالي 4 مم من الأنسجة المجاورة. احتضان لمدة 2.5 ساعة في الظلام ، وغسل كريم الزائد جيدا مع برنامج تلفزيوني. لتأكيد عمق التخدير ، راقب الحيوانات كل 10 دقائق حتى تتعافى تماما.
    2. تخدير الحيوانات.
    3. قم بتشعيع الجلد الخلفي بالكامل بمصدر ضوء أحمر مناسب لجرعة إجمالية قدرها 2.5−4 جول / سم2. احتفظ بالفئران على بطانية كهربائية حتى الشفاء التام وتابع كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
      ملاحظة: يعتبر الإجراء التجريبي لكل منتهيا عند ملاحظة الشفاء الكامل للحروق. يتضمن الإجراء بأكمله معالجة صورة واحدة فقط.
  3. لتشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابرة في جلد الذيل ، قم بإعداد الفئران كما هو موضح في القسم 1.3 ، ضع ~ 25 مجم من mALA على شكل كريم موضعي على طول منطقة الأنسجة الظهرية واستمر كما هو موضح في القسم 2.1 للجلد الخلفي. قم بإجراء معالجات ضوئية وأدوات تحكم في الضوء المراسل لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 72 ساعة قبل القتل الرحيم للحيوانات ومزيد من استخراج حوامل جلد الذيل بالكامل.
    ملاحظة: في جميع التصاميم التجريبية ، قم بفحص اعتماد ROS للعملية باستخدام كاسحات ROS المضادة للأكسدة (على سبيل المثال ، التلقيح اليومي ل 100 مجم / كجم من وزن الجسم N-acetyl-cysteine عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول 20 مجم / مل في PBS ، درجة الحموضة 7.2 ، بدءا من 5 أيام قبل علاجات mALA أو ، بدلا من ذلك ، جرعتين من 100 مجم / مل من حمض الأسكوربيك في 50٪ إيثانول ، متباعدة 30 دقيقة ، تطبق موضعيا على الجلد في الفترة الزمنية بين علاجات mALA وتشعيع الضوء الأحمر).

3. الكشف عن ROS في الجلد

  1. تقييم خارج الجسم الحي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في جلد الذيل بعد المعالجة الضوئية الديناميكية باستخدام الهيدرويثيدين
    ملاحظة: هيدرويثيدين هو جزيء غير فلوري يتفاعل بشكل خاص مع أنواع الأكسجين التفاعلية لإنتاج صبغة الفلورسنت 2-هيدروكسي إيثيديوم (hET).
    1. احتضان جلود الذيل الكاملة ، التي تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 1.3.3 ، لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في 5 مللي متر EDTA في محلول PBS (عينات التحكم) أو بالإضافة إلى ذلك تحتوي على 2 mM mALA (عينات المعالجة الديناميكية الضوئية).
    2. في جميع الحالات ، أضف الهيدرويثيدين إلى تركيز نهائي قدره 3.2 ميكرومتر من مخزون 25 مجم / مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) واحتضانه لمدة 1 ساعة في الظلام عند RT.
    3. قم بتمديد عينات جلد الذيل على سطح زجاجي باستخدام أطراف الأصابع وقم بالإشعاع بضوء أحمر 636 نانومتر عند طلاقة 10 J / cm2 .
    4. تابع على الفور لفصل البشرة عن الأدمة وإصلاح صفائح البشرة كما هو موضح في القسم 1.3.3.
    5. قم بتقييم الانبعاث الأحمر hET تحت المجهر الفلوري / متحد البؤر باستخدام ضوء أخضر مثير ، والتقط صورا عالية الجودة وتابع المزيد من التحليل.
      ملاحظة: استخدم تلطيخ hET لعينات الأنسجة في غياب العلاج الضوئي الديناميكي كعنصر تحكم سلبي للأكسدة الذاتية hET.
  2. الكشف في الجسم الحي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد الخلفي بعد تحريض نمو الشعر والتئام الحروق يليه العلاج الضوئي الديناميكي
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام 2′,7′-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات (DHF-DA) ، وهي خلية تحتوي على مركب غير فلوري ، بعد الانقسام بواسطة إنزيمات الإستراز داخل الخلايا ، يتفاعل بشكل خاص مع ROS مما يعطي صبغة الفلورسنت 2 ′ ، 7 ′ - ثنائي كلورو فلوريسئين (DCF).
    1. استخدم الحيوانات المعدة لتحريض نمو الشعر (القسم 1.1) أو التئام الحروق (القسم 1.2). قبل علاجات كريم mALA الموضعية مباشرة (انظر القسمين 2.1 و 2.2) ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر موضعيا من 1 مجم / مل في 50٪ إيثانول من DHF-DA على جميع مناطق الجلد المستهدفة / المعالجة ، ودع الجلد يمتص المادة بالكامل والمضي قدما في تطبيق كريم mALA الموضعي.
    2. احتضان الحيوانات المعالجة لمدة 4 ساعات في الظلام ، وغسل كريم mALA الموضعي جيدا عن الجلد مع برنامج تلفزيوني والاستغناء عن جرعة ثانية من 100 ميكرولتر من محلول DHF-DA على الجلد. لتأكيد عمق التخدير ، راقب الحيوانات كل 10 دقائق حتى تتعافى تماما.
    3. احتضان الحيوانات المعالجة لمدة 50 دقيقة في الظلام ، وتخدير وتشعيع الجلد الخلفي بالكامل بطلاقة تتراوح من 2.5 إلى 4 جول / سم2 من 636 نانومتر ضوء أحمر باستخدام مصباح LED.
    4. مباشرة بعد التشعيع ، قم بتقييم مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية المتولدة في الجلد باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي (جدول المواد). اضبط صندوق المرشح على إثارة 445-490 نانومتر وانبعاث 515-575 نانومتر ، والتقط صورا عالية الجودة وتابع المزيد من التحليل.
      ملاحظة: استخدم تلطيخ DHF-DA لعينات الأنسجة في غياب المعالجة الديناميكية الضوئية كعنصر تحكم سلبي للأكسدة الذاتية ل DHF-DA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يؤدي الإعطاء الموضعي لسلائف mALA في ظهر الفأر وجلد الذيل إلى تراكم كبير ل PpIX في الأنسجة بأكملها ، وبشكل ملحوظ في بصيلات الشعر ، كما يتضح من التألق الوردي المحمر لهذا المركب تحت الضوء الأزرق (407 نانومتر) الإثارة (الشكل 2أ ، ج). التشعيع اللاحق للأنسجة المعالجة بالضوء الأحمر (636 نانومتر) عند طلاقة 2.5−4 جول / سم 2 يعزز الإنتاج العابر لأنواع الأكسجين التفاعلية في الأنسجة ، خاصة في منطقة الانتفاخ في بصيلات الشعر (الشكل 2ب ، د).

يؤدي تشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة في جلد الفأر في الجسم الحي إلى زيادة كبيرة في عدد مراكز مصادر التعلم ، المصنفة على أنها خلايا جذعية جسدية ، في منطقة الانتفاخ من بصيلات الشعر بعد يومين من العلاج بالصور (الشكل 3 ، الألواح اليسرى). والجدير بالذكر أن الزيادة في عدد مراكز مصادر التعلم عابرة ، حيث تعود إلى المستويات الطبيعية بعد 6 أيام من العلاج (الشكل 3 ، اللوحة اليمنى). نظرا لأن هذه المنطقة هي واحدة من منافذ الخلايا الجذعية الرئيسية في جلد الفأر ، فإن الحث العابر لتكاثر الخلايا في هذه المنطقة يعكس بشكل أساسي التنشيط الوظيفي لمكانة الانتفاخ وبرامج الخلايا الجذعية المقيمة للتكاثر والتمايز22,23.

يرتبط التنشيط المعتمد على أنواع الأكسجين التفاعلية لمكانة بصيلات الشعر المنتفخة أيضا بالاستجابات الفسيولوجية في الجلد. وبالتالي ، فإن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابرة يسرع بشكل ملحوظ عملية شفاء الجلد بعدحرق درجة 2 (الشكل 4أ ، ب). يوضح القياس الكمي للانخفاض التدريجي لمنطقة الجلد التالفة / الجرب المتانة والدلالة الإحصائية لعملية تسريع التئام الجروح الناجمة عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية العابرة المعتمدة على PPIX في الأنسجة (الشكل 4C). بنفس الطريقة ، تعزز مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية غير القاتلة نمو الشعر بقوة بعد الحلاقة خلال الكرب المنسق الثاني (الشكل 5 أ) ، وهي مرحلة تكون خلالها بصيلات الشعر مقاومة للاستجابة لمحفزات النمو22,23 ، مما يشكل طريقة مناسبة لتقييم إمكانات المركبات و / أو العمليات الجديدة لتحفيز نمو الشعر. والجدير بالذكر أن استخدام المركبات المضادة للأكسدة مثل حمض الأسكوربيك (AA) يؤدي إلى انخفاض معتد به إحصائيا في عدد الحيوانات التي تظهر نموا متسارعا للشعر (الشكل 5 ب). بالإضافة إلى ذلك ، فإن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد بعد العلاجات بالصور ، والذي يتم قياسه كميا من خلال انبعاث الفلورسنت من DHF في الجلد ، يتم تقليله بشكل كبير بواسطة المركبات المضادة للأكسدة (الشكل 5C). معا ، تظهر هذه النتائج أن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بعد العلاجات الضوئية القائمة على PpIX مطلوب بشكل صارم للحث على استجابة فسيولوجية في الأنسجة.

Figure 1
الشكل 1: الخلفية النظرية للتشغيل المتحكم فيه للإنتاج الديناميكي الضوئي الداخلي لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع في الخلايا والأنسجة باستخدام مسار التخليق الحيوي للهيم. (أ) التمثيل التخطيطي للتفاعلات الكيميائية الضوئية الأساسية التي تؤدي إلى إثارة الأكسجين الجزيئي أثناء المعالجة الديناميكية الضوئية. عند امتصاص الضوء مع λ المناسب ، يخضع جزيء التحسس الضوئي (PS) في الحالة الأرضية S0 للانتقال إلى حالة مفردة متحمسة S1. نظرا لأن أي حالة مثارة أقل نشاطا من الحالة الأرضية ، يعود الجزيء إلى S0 بعد فترة زمنية قصيرة. تتمتع معظم PS بكفاءة كمية عالية للانتقال من S 1 إلى الحالة الثلاثية T1 ، والتي تتميز عموما بعمر طويل نسبيا. يمكن أن يتفاعل PS المنشط في الحالة الثلاثية المثارة مع جزيئات أخرى عبر مسارين مختلفين. التفاعل الكيميائي الضوئي من النوع الأول هو نقل الإلكترونات إلى الجزيئات المجاورة لتشكيل أنواع جذرية. من المحتمل أن تتفاعل هذه الجذور مع الأكسجين الجزيئي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، بما في ذلك أنيون الأكسيد الفائق (• O 2-) ، بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O2) وجذر الهيدروكسيل (• OH). يمثل التفاعل الكيميائي الضوئي من النوع الثاني العملية السائدة لمعظم PS المستخدمة في PDT. خلال هذا التفاعل ، يؤدي نقل الطاقة (وليس الإلكترونات) إلى الأكسجين الجزيئي (الذي يكون تكوينه في الحالة الأرضية هو الثلاثي ، 3O 2) إلى تكوين الأكسجين المفرد غير الجذري ولكن شديد التفاعل (1O2). تؤدي المنتجات الضوئية المتكونة خلال هذه التفاعلات إلى سلسلة من الأحداث الكيميائية الحيوية مما يؤدي إلى إجهاد تأكسدي يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا أو يمكن أن يحفز نمو الخلايا. (ب) حمض 5-أمينوليفولينيك (ALA) هو مقدمة طبيعية في مسار التخليق الحيوي للهيم ، والذي يتضمن كلا من المقصورات الخلوية الميتوكوندريا والخلوية. يتم تنظيم نشاط إنزيم ALA synthase من خلال التحكم في التغذية المرتدة السلبية حيث يمنع الهيم الحر ، المنتج النهائي لهذا المسار ، تخليق ALA من الجلايسين والسكسينيل CoA. إن إدارة ALA الخارجية أو مشتقاتها من ميثيل أمينوليفولينات (mALA) تتجاوز نظام التغذية المرتدة التنظيمية ، بحيث تتراكم المستقلبات النهائية ، وخاصة البروتوبورفيرين التاسع (PpIX) ، في الخلية التي تحفز التحسس الضوئي. الخصائص المحددة لمعدل ferrochelatase ، إنزيم المحفز لإدخال الحديد في PpIX ، تعزز تراكم مركب PS الداخلي هذا. PBG = بورفوبيلينوجين. تم تعديل هذا الرقم من Carrasco et al.19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام mALA والضوء الأحمر يحفز الإنتاج العابر لأنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد. (أ) تراكم PpIX الداخلي المنشأ بعد علاج موضوع mALA في الجلد الخلفي. تم استخدام الجانب الأيسر في نفس الحيوان كعنصر تحكم. (B) اللوحة اليسرى: إنتاج ROS (mALA + Light) المعتمد على PPIX الذي يراقبه DHF-DA. اللوحة اليمنى: تحليل الدورة الزمنية لإنتاج ROS النسبي في الجلد الخلفي ؛ تم تحديد الكثافة المتكاملة النسبية لانبعاث الفلورسنت DHF-DA لمناطق mALA + Light مقابل الضوء في كل في أوقات مختلفة بعد التشعيع وتطبيعها كما هو موضح في المنهجية. تم تمثيل متوسط ± SE (n = 4 لكل نقطة زمنية). (ج) توطين PpIX في جلد الذيل (صور مجهرية مضانية). (د) إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في جلد الذيل بعد mALA + Light كما هو موضح من قبل hET مما يدل على تراكم متزايد ومستدام في منطقة الانتفاخ في بصيلات الشعر. يتم عرض صور مجهرية تمثيلية متحدة البؤر (الحد الأقصى للإسقاطات). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Carrasco et al.19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يؤدي تشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع في الجلد إلى زيادة كبيرة في الخلايا الجذعية في منطقة الانتفاخ في مكانة بصيلات الشعر. اللوحات اليسرى: صور مجهرية متحدة البؤر تمثيلية (أقصى إسقاطات) تظهر توطين خلايا الاحتفاظ بتسمية BrdU (LRC) في حوامل جلد ذيل الفأر بالكامل والزيادة الواضحة في LRC في منطقة الانتفاخ لبصيلات الشعر بعد 2 أيام من العلاجات الضوئية المستندة إلى PpIX. اللوحة اليمنى: تحديد عدد LRC في منطقة انتفاخ بصيلات الشعر. يتم تمثيل المتوسط + SE (n = 4). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Carrasco et al.19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يؤدي تشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع في الجلد إلى تسريع التئام الحروق. (أ) إنتاج PpIX الناجم عن mALA في المناطق المصابة بالحروق في الحيوانات المعالجة مقارنة بعينات التحكم. (ب) تطور شفاء الحروق في mALA + الحيوانات المعالجة بالضوء والسيطرة عليها. (ج) تحديد كمي للمناطق المحروقة (اللوحة اليسرى) يظهر تسارع التئام الحروق في mALA + الحيوانات المعالجة بالضوء ؛ يتم تمثيل المتوسط + SE (n = 4) للمنطقة غير المعالجة. تحليل المساحة تحت المنحنى (اللوحة اليمنى) يوضح الاختلافات الإحصائية بين منحنيي المسار الزمني (p ≤ 0.06). تم تعديل هذا الرقم من Carrasco et al.19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تشغيل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع في الجلد يحفز نمو الشعر. (أ) الصف العلوي: تحريض نمو الشعر خلال مرحلة التيلوجين المقاومة للحرارة بواسطة mALA + Light (الجانب الأيمن من الجلد الظهري) مقارنة بمنطقة التحكم في الضوء (الجانب الأيسر). الصف السفلي: يتم تثبيط كل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد وتسريع نمو الشعر الناجم عن mALA + Light بواسطة العلاج المضاد للأكسدة بحمض الأسكوربيك (AA). (ب) القياس الكمي للنسبة المئوية للحيوانات التي تظهر نموا متسارعا للشعر في mALA-PT مقارنة بالمنطقة الضابطة في غياب أو وجود مضادات الأكسدة AA (n = 4 في 3 تجارب مستقلة). (ج) القياس الكمي لتثبيط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الجلد الظهري الناجم عن AA أثناء mALA-PT (n = 4). في جميع الحالات ، تمثل الأشرطة المتوسط + SE. تم تعديل هذا الرقم من Carrasco et al.19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نقدم منهجية تسمح بتنشيط عابر لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الداخلية في الجسم الحي في جلد الفأر مع تأثيرات فسيولوجية. تعتمد المنهجية على إجراء ديناميكي ضوئي للحث على تحفيز موضعي وخاضع للرقابة للمحسس الضوئي الداخلي PpIX (الشكل 1B). هذا النهج التجريبي هو أداة مثيرة للاهتمام لدراسة بيولوجيا ROS في الأنظمة التجريبية في الجسم الحي التي تشكل تقدما كبيرا على المنهجيات التي تستخدم مصادر ROS الخارجية (عادة بيروكسيد الهيدروجين) والسماح بالإنتاج الخاضع للرقابة والمحلي من ROS في الأنسجة / العينة.

بالنظر إلى أن السلائف القائمة على أمينوليفولينات تدار بشكل زائد لتعزيز تراكم PpIX داخل الخلايا ، فإن الخطوة الحاسمة في هذه المنهجية هي إنشاء جرعة ضوئية كافية للحث على الإنتاج العابر لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في الأنسجة تحت عتبة الضرر ولكن تظهر تأثيرا محفزا قويا. لا توجد حاليا تقنيات متاحة لتحديد الكمية الدقيقة لأي نوع من أنواع الأكسجين التفاعلية التي يتم إنتاجها في الخلايا والأنسجة. في منهجيتنا ، لا يزال من غير الممكن إنشاء علاقة مباشرة بين جرعة ضوئية معينة ، والكمية الدقيقة من أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة ، وتأثير بيولوجي معين (على سبيل المثال ، موت الخلايا أو تكاثر الخلايا). لهذا السبب ، يجب تحديد جرعة الضوء (الطلاقة) لأي نموذج تجريبي معين تجريبيا من قبل الباحث باستخدام المعلمات النوعية أو شبه النوعية المفضلة لكل حالة. في حالة جلد الفأر ، نختار انتقالا قابلا للقياس بسهولة بين موت الخلايا وتلف الأنسجة وتحريض موجة تكاثرية كبيرة وعابرة.

أثبتت المنهجية المقدمة هنا أنها فعالة للغاية في تحسين تجديد الجلد في عمليات مختلفة ، بما في ذلك التئام الحروق ونمو بصيلات الشعر. تمهد هذه الملاحظات الطريق لتنفيذ التطبيقات العلاجية لهذه التكنولوجيا في العيادات لعلاج الحروق والجروح العرضية أو المزمنة أو لأمراض الجلد المختلفة ، وخاصة بصيلات الشعر التي تنطوي على خلل في عمل الخلايا الجذعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع التطبيقات التجارية للإجراءات الموضحة في هذا العمل محمية ببراءة اختراع CSIC-UAM (EP2932967A1) من تأليف EC و MIC و JE ومرخصة لشركة Derma Innovate SL للاستغلال التجاري. JE و JJM لديهما منصب استشاري في Derma Innovate SL.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة الاقتصاد والمنافسة (RTC-2014-2626-1 إلى JE) ومعهد الصحة كارلوس الثالث (PI15 / 01458 إلى JE) في إسبانيا. تم دعم المفوضية الأوروبية من خلال منحة Atracción de Talento Investigador 2017-T2 / BMD-5766 (Comunidad de Madrid و UAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine Sigma Aldrich B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein Roche 11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet) Veet
Dihydroethidium Sigma Aldrich 37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp Photocure ASA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
  2. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
  3. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
  4. Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
  5. Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
  6. Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
  7. Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
  8. Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
  9. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  10. Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
  11. Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
  12. Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
  13. Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
  14. Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
  15. Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
  16. Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  17. Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  18. Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
  19. Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
  20. Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
  21. Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
  22. Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
  23. Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).

Tags

التراجع ، العدد 159 ، أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، البروتوبرفيرين التاسع ، التوليد الضوئي ، جلد الفأر ، الخلايا الجذعية ، تجديد الأنسجة ، بصيلات الشعر ، التئام الحروق
تحفيز منافذ الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة في جلد الفأر عن طريق التوليد الضوئي المعتمد على البروتوبورفيرين التاسع لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espada, J., Carrasco, E.,… More

Espada, J., Carrasco, E., Calvo-Sánchez, M. I., Fernández-Martos, S., Montoya, J. J. Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ. J. Vis. Exp. (159), e60859, doi:10.3791/60859 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter