Summary
Het doel van dit protocol is om voorbijgaande in vivo productie van niet-dodelijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren, waardoor fysiologische reacties in het weefsel verder worden bevorderd.
Abstract
Hier beschrijven we een protocol om schakelbare in vivo fotogeneratie van endogene reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren. Deze voorbijgaande productie van ROS in situ activeert efficiënt celproliferatie in stamcelniches en stimuleert weefselregeneratie zoals sterk gemanifesteerd door de versnelling van brandwondengenezing en haarfollikelgroeiprocessen. Het protocol is gebaseerd op een gereguleerde fotodynamische behandeling die het weefsel behandelt met voorlopers van de endogene fotosensitizer protoporfyrine IX en het weefsel verder bestraalt met rood licht onder streng gecontroleerde fysisch-chemische parameters. Over het algemeen vormt dit protocol een interessant experimenteel hulpmiddel om de ROS-biologie te analyseren.
Introduction
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn het resultaat van de chemische reductie van moleculaire zuurstof tot water, en omvatten singletzuurstof, superoxide-anion, waterstofperoxide en het hydroxylradicaal 1,2,3. ROS hebben een zeer korte levensduur vanwege hun extreem chemisch reactieve karakter. In aerobe organismen wordt ROS incidenteel gevormd in de cellen als een belangrijk lekkend bijproduct van aerobe ademhaling (elektronentransportketen) in de mitochondriën. Voorbijgaande accumulatie van hoge niveaus van ROS in de cel resulteert in een oxidatieve stressconditie die de onomkeerbare inactivatie van eiwitten, lipiden en suikers en de introductie van mutaties in het DNA-molecuul 2,3,4,5 kan veroorzaken. De geleidelijke accumulatie van oxidatieve schade in cellen, weefsels en hele organismen neemt gestaag toe met de tijd en is in verband gebracht met de inductie van celdoodprogramma's, verschillende pathologieën en het verouderingsproces 2,3,4,6.
Aërobe organismen hebben gestaag efficiënte moleculaire mechanismen ontwikkeld om overtollige ROS-accumulatie in cellen en weefsels aan te pakken. Deze mechanismen omvatten leden van de superoxide dismutase (SOD) eiwitfamilie, die superoxide radicale desmutatie in moleculaire zuurstof en waterstofperoxide katalyseren, evenals verschillende catalasen en peroxidasen die de antioxidantpool (glutathion, NADPH, peroxiredoxine, thioredoxine 7,8) gebruiken om de daaropvolgende omzetting van waterstofperoxide in water en moleculaire zuurstof te katalyseren.
Verschillende rapporten ondersteunen echter de rol van ROS als belangrijke componenten van moleculaire circuits die kritieke celfuncties reguleren, waaronder proliferatie, differentiatie en mobiliteit 2,3,4. Dit concept wordt verder ondersteund door de initiële identificatie en karakterisering van speciale ROS-producerende mechanismen in aërobe organismen, waaronder lipoxygenases cyclooxygenases en NADPH-oxidasen 9,10. In die zin vertoont ROS een actieve rol tijdens de ontwikkeling van gewervelde embryo's 11,12,13 en sleutelrollen voor deze moleculen in de regulatie van specifieke in vivo fysiologische functies zijn gemeld in verschillende experimentele systemen, waaronder het differentiatieprogramma van hematopoietische voorlopers in Drosophila14, genezingsinductie bij zebravissen of staartregeneratie bij Xenopus-kikkervisjes 15. Bij zoogdieren is ROS betrokken geweest bij het zelfvernieuwings-/differentiatiepotentieel van neurale stamcellen in een neurosfeermodel16 en bij de deregulatie van de darmstamcelfunctie tijdens de initiatie van colorectale kanker17. In de huid is ROS-signalering in verband gebracht met epidermale differentiatie en de regulatie van de huidstamcelniche en de haarfollikelgroeicyclus18,19.
In dit perspectief is een belangrijke experimentele beperking om de fysiologische rollen van ROS in biologische systemen te bepalen, zowel in normale als pathologische omstandigheden, het gebrek aan adequate experimentele hulpmiddelen om gecontroleerde productie van deze moleculen in cellen en weefsels te induceren, die nauwkeurig lijken op hun fysiologische productie als tweede signaalboodschappers. Op dit moment omvatten de meeste experimentele benaderingen de toediening van exogene ROS, meestal in de vorm van waterstofperoxide. We hebben onlangs een experimentele aanpak geïmplementeerd om een voorbijgaande, niet-dodelijke in vivo productie van endogene ROS in de muizenhuid in te schakelen, gebaseerd op de toediening van precursoren van de endogene fotosensitizer protoporfyrine IX (PpIX; bijv. aminolaepilinezuur of het methylderivaat methylaminolevulinaat daarvan) en verdere bestraling van het monster met rood licht om de in situ vorming van ROS uit intracellulaire moleculaire zuurstof te induceren (figuur 1). Deze fotodynamische procedure kan efficiënt worden gebruikt om residente stamcelniches te stimuleren, waardoor de regeneratieve programma's van het weefselworden geactiveerd 19,20 en de weg wordt geopend voor nieuwe therapeutische modaliteiten in de huidregeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van het protocol, met representatieve voorbeelden van stimulatie van stamcelniches, gemeten als een toename van het aantal langdurige 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) labelbehoudende cellen (LRC's) in het uitstulpende gebied van de haarfollikel19,21, en daaropvolgende activering van regeneratieprogramma's (versnelling van haargroei en brandwondgenezingsprocessen) geïnduceerd door voorbijgaande, niet-dodelijke ROS-productie in de huid van de C57Bl6-muizenstam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor het houden van muizen en experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale, nationale, internationale wetgeving en richtlijnen voor dierproeven.
1. Inductie van haargroei, brandwondinductie en identificatie van langdurige BrdU LRC's in het epitheel van de staarthuid
OPMERKING: Gebruik 10 dagen of 7 weken oude C57BL/6-muizen, bij voorkeur nestgenoten, voor de hieronder beschreven experimentele ontwerpen. In alle experimentele procedures zullen dieren worden verdoofd door 3% isofluraaninhalatie of geëuthanaseerd door cervicale dislocatie zoals aangegeven.
- Inductie van haargroei in de rughuid van muizen in de tweede telogene (rust) fase (ongeveer dag 50 postnataal)
- Verdoof muizen met inhalatie van 3% isofluraan. Bevestig volledige diepe anesthesie door het ontbreken van een pedaalreflex (stevige teenknijp). Scheer twee onafhankelijke naast elkaar gelegen delen van de rughuid in elke afzonderlijke muis met behulp van tondeuses en ontharingscrème (materiaaltabel). Gebruik de linkerkant voor de controle en de rechterkant voor de behandeling.
OPMERKING: Controleer of de onderliggende rughuid na het scheren roze is en niet grijs/zwart, een indicator van melanogenese en toegang tot de anagene (groei)fase in deze muizenstam. - Was grondig met PBS om alle crèmeresten te verwijderen en ga over tot inductie van voorbijgaande in situ productie van niet-dodelijke ROS-niveaus zoals beschreven in rubriek 2.1.
- Registreer de haarfollikelgroei door dagelijkse acquisitie van beelden met hoge resolutie van de controle- en behandelde rughuidgebieden in elk dier (bijvoorbeeld met behulp van een HD-camera gekoppeld aan een 5−20x binoculaire lens).
- Verdoof muizen met inhalatie van 3% isofluraan. Bevestig volledige diepe anesthesie door het ontbreken van een pedaalreflex (stevige teenknijp). Scheer twee onafhankelijke naast elkaar gelegen delen van de rughuid in elke afzonderlijke muis met behulp van tondeuses en ontharingscrème (materiaaltabel). Gebruik de linkerkant voor de controle en de rechterkant voor de behandeling.
- Inductie van 2e graads brandwonden in de rughuid van muizen in de tweedetelogene (rust) fase (ongeveer dag 50 postnataal)
- Verdoof muizen. Scheer het hele achterste huidgebied in elke afzonderlijke muis met tondeuses en ontharingscrème en was grondig met PBS om alle crèmeresten te verwijderen.
OPMERKING: Dien in situ subcutane injecties van lidocaïne 0,5% (2 mg/ml) toe in steriele zoutoplossing, niet meer dan 7 mg/ml, vlak voor de verbrandingsprocedure. - Verwarm een messing staaf (1 cm in doorsnede) voor op 95 °C door onder te dompelen in kokend water en breng vervolgens gedurende 5 s aan op het centrale deel van het rughuidoppervlak van elke muis.
- Net na het ontstaan van brandwonden, injecteer de dieren intraperitoneaal met 1 ml fysiologische oplossing (0,9% NaCl) op een elektrische deken om uitdroging te voorkomen. Laat de dieren gedurende 24 uur herstellen en ga over tot inductie van voorbijgaande in situ productie van niet-dodelijke ROS-niveaus zoals beschreven in rubriek 2.3.
- Registreer de progressie van brandwonden door dagelijkse acquisitie van beelden met hoge resolutie van de controle- en behandelde rughuidgebieden bij elk dier (bijvoorbeeld met behulp van een HD-camera gekoppeld aan een 5−20x binoculaire lens).
- Verdoof muizen. Scheer het hele achterste huidgebied in elke afzonderlijke muis met tondeuses en ontharingscrème en was grondig met PBS om alle crèmeresten te verwijderen.
- Generatie en identificatie van langdurige BrdU LRC's in het epitheel van de staarthuid
- Injecteer 10/14 dagen oude nestgenoten intraperitoneaal (geen anesthesie) eenmaal per dag gedurende 4 opeenvolgende dagen met 50 mg/kg lichaamsgewicht BrdU opgelost in PBS. Laat muizen na de etiketteringsfase 50-60 dagen vóór elke behandeling groeien.
OPMERKING: Gebruik een nieuwe naald voor elke injectie. - Ga te werk zoals beschreven in rubriek 2.3 voor de inductie van voorbijgaande in situ niet-dodelijke ROS-productie in de staarthuid op verschillende tijdstippen vóór de bereiding van weefsels.
- Om hele mounts van staartepidermis voor te bereiden, euthanaseer muizen door cervicale dislocatie en knip de staarten met een chirurgische schaar.
- Gebruik een scalpel om een rechte longitudinale incisie langs de staart te maken en pel de hele huid als een enkel stuk van de ruggengraat. Incubeer de geschilde huid in 5 mM EDTA in PBS in 5 ml tubes gedurende 4 uur bij 37 °C en scheid zorgvuldig intacte vellen opperhuid van de dermis met behulp van een tang.
- Fixeer het weefsel in 4% formaldehyde in PBS gedurende ten minste 72 uur bij kamertemperatuur (RT) en ga verder met BrdU-detectie met behulp van geschikte antilichamen.
- Gebruik fluorescentie/confocale microscopie om LRC's in elke experimentele toestand te identificeren en te kwantificeren, inclusief lichtcontroles en fotodynamische behandelingen op verschillende tijdstippen vóór de bereiding van weefsel wholemounts, zoals eerder in detail beschreven19,20.
OPMERKING: Vaste epidermale vellen mogen gedurende maximaal drie maanden worden bewaard in PBS met 0,02% natriumazide bij 4 °C. Vaste epidermale vellen kunnen worden gebruikt voor immunolocalisatie van vereiste eiwitten volgens standaard histologische sectieprocedures.
- Injecteer 10/14 dagen oude nestgenoten intraperitoneaal (geen anesthesie) eenmaal per dag gedurende 4 opeenvolgende dagen met 50 mg/kg lichaamsgewicht BrdU opgelost in PBS. Laat muizen na de etiketteringsfase 50-60 dagen vóór elke behandeling groeien.
2. Inductie van voorbijgaande productie van niet-dodelijke ROS-niveaus in de huid van muizen
OPMERKING: Om voorbijgaande productie van niet-dodelijke ROS-niveaus in de huid van muizen te induceren, zal een fotodynamische behandeling met behulp van een voorloper van de endogene fotosensitizer PpIX, in dit geval methyl-aminolevulinaat (mALA), en rood licht worden gebruikt.
- Om de transiënte ROS-productie voor de inductie van haargroei in de rughuid in te schakelen, bereidt u de dieren voor zoals aangegeven in rubriek 1.1.
- Breng ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème (materiaaltabel) op het rechtergebied, waarbij de linkerkant als interne controle wordt gebruikt om interindividuele verschillen te voorkomen. Incubeer gedurende 2,5 uur in het donker, was de overtollige crème grondig af met PBS. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.
OPMERKING: De productie van PpIX in de rughuid moet in situ worden getest door de rode fluorescentie onder excitatie van blauw licht (407 nm). - Verdoof de dieren.
- Bestraal de hele rughuid met een adequate roodlichtbron (Table of Materials) voor een totale dosis van 2,5−4 J/cm2. Houd muizen op een elektrische deken totdat ze volledig zijn hersteld en ga verder zoals beschreven in stap 1.1.3.
OPMERKING: De bestralingssterkte moet worden aangepast door de afstand tussen de lichtbron en het weefsel te manipuleren en te meten met behulp van een vermogensenergiemeter (materiaaltabel). Het experiment wordt als voltooid beschouwd wanneer volledige haargroei wordt waargenomen in een van de onafhankelijke geschoren regio's van elk dier. De hele procedure omvat slechts één fotobehandeling.
- Breng ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème (materiaaltabel) op het rechtergebied, waarbij de linkerkant als interne controle wordt gebruikt om interindividuele verschillen te voorkomen. Incubeer gedurende 2,5 uur in het donker, was de overtollige crème grondig af met PBS. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.
- Om voorbijgaande ROS-productie in te schakelen voor genezingsverbetering van2e graads brandwonden, bereidt u de dieren voor zoals aangegeven in rubriek 1.2.
- Breng ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème langs het verbrande oppervlak, dat ongeveer 4 mm aangrenzend weefsel omvat. Incubeer gedurende 2,5 uur in het donker, was de overtollige crème grondig af met PBS. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.
- Verdoof de dieren.
- Bestraal de hele rughuid met een adequate roodlichtbron voor een totale dosis van 2,5−4 J/cm2. Houd de muizen op een elektrische deken totdat ze volledig hersteld zijn en ga verder zoals beschreven in stap 1.2.4.
OPMERKING: De experimentele procedure voor elk dier wordt als voltooid beschouwd wanneer volledige brandwondengenezing wordt waargenomen. De hele procedure omvat slechts één fotobehandeling.
- Om voorbijgaande ROS-productie in de staarthuid in te schakelen, bereidt u muizen voor zoals aangegeven in rubriek 1.3, brengt u ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème langs het hele dorsale weefselgebied en gaat u te werk zoals beschreven in rubriek 2.1 voor de rughuid. Voer fotobehandelingen en corresponderende lichtcontroles uit 24 uur, 48 uur of 72 uur vóór euthanasie bij dieren en verdere extractie van de hele staarthuid.
OPMERKING: Test in alle experimentele ontwerpen de ROS-afhankelijkheid van het proces met behulp van antioxidant ROS-aaseters (bijv. Dagelijkse inenting van 100 mg / kg lichaamsgewicht N-acetyl-cysteïne door intraperitoneale injectie van een 20 mg / ml oplossing in PBS, pH 7,2, beginnend 5 dagen vóór mALA-behandelingen of, als alternatief, twee doses van 100 mg / ml ascorbinezuur in 50% ethanol, 30 min, topisch aangebracht op de huid in het tijdsinterval tussen de mALA-behandelingen en roodlichtbestraling).
3. ROS-detectie in de huid
- Ex vivo evaluatie van ROS-productie in staarthuid na fotodynamische behandeling met hydro-ethidine
OPMERKING: Hydro-ethidine is een niet-fluorescerend molecuul dat specifiek reageert met ROS om fluorescerende kleurstof 2-hydroxyethidium (hET) te produceren.- Incubeer hele staarthuiden, verkregen zoals beschreven in punt 1.3.3, gedurende 3 uur bij 37 °C in 5 mM EDTA in PBS-oplossing (controlemonsters) of aanvullend met 2 mM mALA (fotodynamische behandelingsmonsters).
- Voeg in alle gevallen hydro-ethidine toe tot een eindconcentratie van 3,2 μM uit een voorraad van 25 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO) en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT.
- Strek de staarthuidmonsters met vingertoppen over een glazen oppervlak en bestraal met 636 nm rood licht bij een fluence van 10 J/cm2 .
- Ga onmiddellijk verder met het scheiden van de epidermis van de dermis en het fixeren van de epidermale vellen zoals beschreven in punt 1.3.3.
- Evalueer de hET-rode emissie onder een fluorescentie / confocale microscoop met behulp van groen opwindend licht, leg beelden van hoge kwaliteit vast en ga verder met verdere analyse.
OPMERKING: Gebruik hET-kleuring van weefselmonsters bij afwezigheid van fotodynamische behandeling als een negatieve controle voor hET-autoxidatie.
- In vivo detectie van ROS-productie in de rughuid na inductie van haargroei en brandwondengenezing gevolgd door fotodynamische behandeling
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DHF-DA), een celdoordringende niet-fluorescerende verbinding die, na splitsing door intracellulaire esterase-enzymen, specifiek reageert met ROS die de 2′,7′-dichloorfluoresceïne (DCF) fluorescerende kleurstof geeft.- Gebruik dieren die zijn voorbereid op inductie van haargroei (rubriek 1.1) of brandwondgenezing (rubriek 1.2). Vlak voor topische mALA-crèmebehandelingen (zie rubrieken 2.1 en 2.2), doseer topisch 100 μL van 1 mg / ml in 50% ethanol van DHF-DA op alle doelcontrole/ behandelde huidgebieden, laat de huid het materiaal volledig absorberen en ga verder met het aanbrengen van actuele mALA-crème.
- Incubeer behandelde dieren gedurende 4 uur in het donker, was de actuele mALA-crème grondig van de huid met PBS en doseer een tweede dosis van 100 μL DHF-DA-oplossing op de huid. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.
- Incubeer behandelde dieren gedurende 50 minuten in het donker, verdoof en bestraal de hele rughuid met een vloeiendheid variërend van 2,5 tot 4 J / cm2 van 636 nm rood licht met behulp van een LED-lamp.
- Evalueer onmiddellijk na de bestraling de ROS-niveaus die in de huid worden gegenereerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (materiaaltabel). Stel de filterbox in voor 445−490 nm excitatie en 515−575 nm emissie, leg beelden van hoge kwaliteit vast en ga verder met verdere analyse.
OPMERKING: Gebruik DHF-DA-kleuring van weefselmonsters in afwezigheid van fotodynamische behandeling als negatieve controle voor DHF-DA-autoxidatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De topische toediening van de mALA-voorloper in de rug- en staarthuid van de muis resulteert in een significante accumulatie van PpIX in het hele weefsel en, merkbaar, in de haarfollikel, zoals aangetoond door de roodroze fluorescentie van deze verbinding onder excitatie van blauw licht (407 nm) (figuur 2A,C). Latere bestraling van behandeld weefsel met rood licht (636 nm) bij een fluence van 2,5−4 J/cm 2 bevordert de voorbijgaande productie van ROS in het weefsel, met name in het uitstulpende gebied van de haarfollikel (figuur 2B,D).
Het inschakelen van niet-dodelijke ROS-productie in muizenhuid in vivo bevordert een significante toename van het aantal LRC's, gecategoriseerd als somatische stamcellen, in het uitstulpende gebied van het haarzakje twee dagen na fotobehandelingen (figuur 3, linkerpanelen). Met name de toename van het aantal LRC's is van voorbijgaande aard en herstelt zich 6 dagen na de behandelingen tot normale niveaus (figuur 3, rechterpaneel). Aangezien dit gebied een van de belangrijkste stamcelniches in de huid van muizen is, weerspiegelt een voorbijgaande inductie van celproliferatie in dit gebied voornamelijk de functionele activering van de uitstulpende niche en van de residente stamcelprogramma's van proliferatie en differentiatie22,23.
De ROS-afhankelijke activering van de uitpuilende haarfollikelniche wordt verder geassocieerd met fysiologische reacties in de huid. Zo versnelt voorbijgaande ROS-productie het huidgenezingsproces na een2e graads brandwond aanzienlijk (figuur 4A,B). Kwantificering van de geleidelijke vermindering van het beschadigde/korstige huidgebied toont de robuustheid en statistische significantie van het wondgenezingsversnellingsproces geïnduceerd door PpIX-afhankelijke voorbijgaande ROS-productie in het weefsel (figuur 4C). Op dezelfde manier bevorderen niet-dodelijke ROS-niveaus de haargroei na het scheren tijdens het tweede gecoördineerde telogene (figuur 5A), een fase waarin de haarfollikel ongevoelig is om te reageren op groeistimuli22,23, wat een adequate manier is om het potentieel van nieuwe verbindingen en / of processen om de haargroei te stimuleren te evalueren. Met name het gebruik van antioxidanten zoals ascorbinezuur (AA) resulteert in een statistisch significante vermindering van het aantal dieren met een versnelde haargroei (figuur 5B). Bovendien wordt de ROS-productie in de huid na fotobehandelingen, gekwantificeerd door de fluorescerende emissie van DHF in de huid, ook aanzienlijk verminderd door antioxidanten (figuur 5C). Samen tonen deze resultaten aan dat ROS-productie na ppIX-gebaseerde fotobehandelingen strikt noodzakelijk is om een fysiologische respons in het weefsel te induceren.
Figuur 1: Theoretische achtergrond voor het gecontroleerd inschakelen van endogene fotodynamische productie van ROS in situ in cellen en weefsels met behulp van de heembiosynthetische route. (A) Schematische weergave van de fundamentele fotochemische reacties die resulteren in moleculaire zuurstofexcitatie tijdens fotodynamische behandelingen. Na absorptie van licht met de juiste λ ondergaat een photosensitizermolecuul (PS) in de grondtoestand S0 een overgang naar een aangeslagen singlettoestand S1. Omdat elke aangeslagen toestand energetisch minder de voorkeur heeft dan de grondtoestand, keert het molecuul na een korte periode terug naar S0. De meeste PS hebben een hoge kwantumefficiëntie voor de overgang van S 1 naar de triplettoestand T1, over het algemeen gekenmerkt door een relatief lange levensduur. Geactiveerde PS in de aangeslagen triplettoestand kan via twee verschillende routes reageren met andere moleculen. Een type I fotochemische reactie is de overdracht van elektronen naar aangrenzende moleculen om radicale soorten te vormen; deze radicalen reageren waarschijnlijk met moleculaire zuurstof om ROS te produceren, waaronder superoxide-anion (•O 2-), waterstofperoxide (H 2O2) en hydroxylradicaal (•OH). Een type II fotochemische reactie vertegenwoordigt het dominante proces voor de meeste PS die in PDT worden gebruikt. Tijdens deze reactie drijft de overdracht van energie (geen elektronen) naar moleculaire zuurstof (waarvan de configuratie in de grondtoestand het triplet is, 3O 2) de vorming van de niet-radicale maar zeer reactieve singletzuurstof (1O2). De fotoproducten die tijdens deze reacties worden gevormd, veroorzaken een cascade van biochemische gebeurtenissen die resulteren in een oxidatieve stress die uiteindelijk celdood veroorzaakt of die mogelijk de celgroei kan stimuleren. (B) 5-aminolevulinezuur (ALA) is een natuurlijke voorloper in de heembiosynthetische route, die zowel mitochondriale als cytosolische cellulaire compartimenten omvat. De ALA-synthase-enzymactiviteit wordt gereguleerd door een negatieve feedbackcontrole waarbij vrij heem, het eindproduct van deze route, de synthese van ALA uit glycine en succinyl CoA remt. De toediening van exogene ALA of zijn derivaat methylaminolevulinaat (mALA) omzeilt het regulerende feedbacksysteem, zodat downstream metabolieten, met name protoporfyrine IX (PpIX), worden geaccumuleerd in de cel die fotosensibilisatie induceert. De snelheidsbeperkende eigenschappen van ferrochelatase, katalysatorenzym van de ijzerinbrenging in PpIX, bevorderen de accumulatie van deze endogene PS-verbinding. PBG = porfobilinogeen. Dit cijfer is aangepast van Carrasco et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fotodynamische behandeling met mALA en rood licht induceert voorbijgaande productie van ROS in de huid. (A) Accumulatie van endogene PpIX na mALA-onderwerpbehandeling in de rughuid. De linkerkant bij hetzelfde dier werd gebruikt als controle. (B) Linkerpaneel: PpIX-afhankelijke ROS-productie (mALA+Light) bewaakt door DHF-DA. Rechterpaneel: tijdsverloopanalyse van relatieve ROS-productie in de rughuid; de relatieve geïntegreerde dichtheid van DHF-DA fluorescerende emissie van mALA+Licht versus Licht gebieden in elk dier werd gekwantificeerd op verschillende tijdstippen na bestraling en genormaliseerd zoals beschreven in de methodologie. Het gemiddelde ± SE werd weergegeven (n = 4 voor elk tijdspunt). (C) Lokalisatie van PpIX in de staarthuid (fluorescentiemicroscopiebeelden). (D) ROS-productie in de staarthuid na mALA+Light zoals onthuld door hET die een verhoogde en aanhoudende accumulatie in het uitstulpende gebied van het haarzakje laat zien. Representatieve confocale microscopiebeelden (maximale projecties) worden getoond. Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is aangepast van Carrasco et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het inschakelen van in situ ROS-productie in de huid bevordert een significante toename van stamcellen in het uitstulpende gebied van de haarfollikelnis. Linkerpanelen: representatieve confocale microscopiebeelden (maximale projecties) die de lokalisatie van BrdU-labelbehoudcellen (LRC) in hele huidsteunen van muizenstaarten en de duidelijke toename van LRC in het uitstulpende gebied van haarzakjes 2 dagen na ppIX-gebaseerde fotobehandelingen laten zien. Rechterpaneel: kwantificering van het aantal LRC in het haarfollikeluitstulpingsgebied. Het gemiddelde + SE (n = 4) wordt weergegeven. Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is aangepast van Carrasco et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het inschakelen van in situ ROS-productie in de huid versnelt de genezing van brandwonden. (A) PpIX-productie geïnduceerd door mALA in brandwonden in behandelde dieren in vergelijking met controlemonsters. (B) Burn healing evolutie bij mALA+Light behandelde en controledieren. (C) Kwantificering van het tijdsverloop van verbrande gebieden (linkerpaneel) met versnelde brandwondengenezing bij mALA+Licht behandelde dieren; het gemiddelde + SE (n = 4) van het niet-genezen gebied wordt weergegeven. Area-under-the-curve analyse (rechterpaneel) die statistische verschillen tussen beide tijdsloopcurven aantoont (p ≤ 0,06). Dit cijfer is aangepast van Carrasco et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het inschakelen van in situ ROS-productie in de huid stimuleert de haargroei. (A) Bovenste rij: Inductie van haargroei tijdens de refractaire telogene fase door mALA+Light (rechterkant van de dorsale huid) in vergelijking met het lichte controlegebied (linkerkant). Onderste rij: Zowel de ROS-productie in de huid als de versnelling van de haargroei geïnduceerd door mALA + Light worden geremd door ascorbinezuur (AA) antioxidantbehandeling. (B) Kwantificering van het percentage dieren met een versnelde haargroei in mALA-PT in vergelijking met het controlegebied in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant AA (n = 4 in 3 onafhankelijke experimenten). (C) Kwantificering van de ROS-productieremming in de dorsale huid geïnduceerd door AA tijdens mALA-PT (n = 4). In alle gevallen vertegenwoordigen staven gemiddelde + SE. Dit cijfer is aangepast van Carrasco et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methodologie die een voorbijgaande activering van endogene ROS-productie in vivo in muizenhuid met fysiologische effecten mogelijk maakt. De methodologie is gebaseerd op een fotodynamische procedure om een gecontroleerde en lokale stimulatie van de endogene fotosensitizer PpIX te induceren (figuur 1B). Deze experimentele benadering is een interessant hulpmiddel om ROS-biologie te bestuderen in in vivo experimentele systemen die een aanzienlijke vooruitgang betekenen ten opzichte van methodologieën die externe ROS-bronnen (meestal waterstofperoxide) gebruiken en gecontroleerde en lokale productie van ROS in het weefsel / monster mogelijk maken.
Aangezien precursoren op basis van aminolevulinaat te veel worden toegediend om de accumulatie van PpIX in de cellen te bevorderen, is een cruciale stap in deze methodologie de vaststelling van een adequate lichtdosis om voorbijgaande productie van ROS-niveaus in het weefsel onder de schadedrempel te induceren, maar met een sterk stimulerend effect. Momenteel zijn er geen beschikbare technologieën om direct de exacte hoeveelheid van elk type ROS dat in cellen en weefsels wordt geproduceerd, te kwantificeren. In onze methodologie is het nog steeds niet mogelijk om een directe correlatie vast te stellen tussen een bepaalde lichtdosis, de exacte hoeveelheid geproduceerde ROS en een bepaald biologisch effect (bijvoorbeeld celdood of celproliferatie). Om deze reden moet de lichtdosis (fluence) voor een bepaald experimenteel model empirisch worden vastgesteld door de onderzoeker met behulp van kwalitatieve of semikwalitatieve parameters naar keuze voor elke situatie. In het geval van muizenhuid kiezen we voor een gemakkelijk meetbare overgang tussen celdood en weefselbeschadiging en de inductie van een significante en voorbijgaande proliferatieve golf.
De hier gepresenteerde methodologie heeft bewezen zeer effectief te zijn in de verbetering van huidregeneratie in verschillende processen, waaronder brandwondengenezing en haarfollikelgroei. Deze observaties effenen de weg voor de implementatie van therapeutische toepassingen van deze technologie in klinieken voor de behandeling van incidentele of chronische brandwonden en wonden of voor verschillende pathologieën huid en, in het bijzonder, van de haarfollikel met een defecte stamcelfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle commerciële toepassingen van de procedures beschreven in dit werk zijn beschermd door een CSIC-UAM patent (EP2932967A1) geschreven door EC, MIC en JE en in licentie gegeven aan Derma Innovate SL voor commerciële exploitatie. JE en JJM hebben een adviserende functie in Derma Innovate SL.
Acknowledgments
Dit werk is ondersteund door subsidies van Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 aan JE) en Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 aan JE) van Spanje. EC is ondersteund door de Atracción de Talento Investigador grant 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid en UAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
