Summary
Formålet med denne protokol er at fremkalde forbigående in vivo-produktion af ikke-dødelige niveauer af reaktive iltarter (ROS) i musehud, hvilket yderligere fremmer fysiologiske reaktioner i vævet.
Abstract
Her beskriver vi en protokol til at inducere omskiftelig in vivo fotogenerering af endogene reaktive iltarter (ROS) i musehud. Denne forbigående produktion af ROS in situ aktiverer effektivt celleproliferation i stamcellenicher og stimulerer vævsregenerering som stærkt manifesteret gennem acceleration af brandheling og hårfollikelvækstprocesser. Protokollen er baseret på en regulerbar fotodynamisk behandling, der behandler vævet med forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX og yderligere bestråler vævet med rødt lys under tæt kontrollerede fysisk-kemiske parametre. Samlet set udgør denne protokol et interessant eksperimentelt værktøj til at analysere ROS-biologi.
Introduction
Reaktive iltarter (ROS) er resultatet af den kemiske reduktion af molekylært ilt til dannelse af vand og inkluderer singlet oxygen, superoxidanion, hydrogenperoxid og hydroxylradikalet 1,2,3. ROS har en meget kort levetid på grund af deres ekstremt kemiske reaktive natur. I aerobe organismer dannes ROS tilfældigvis inde i cellerne som et stort utæt biprodukt af aerob respiration (elektrontransportkæde) i mitokondrierne. Forbigående akkumulering af høje niveauer af ROS i cellen resulterer i en oxidativ stresstilstand, der kan fremkalde irreversibel inaktivering af proteiner, lipider og sukkerarter og introduktion af mutationer i DNA-molekylet 2,3,4,5. Den gradvise akkumulering af oxidativ skade i celler, væv og hele organismer stiger støt med tiden og har været forbundet med induktion af celledødsprogrammer, flere patologier og aldringsprocessen 2,3,4,6.
Aerobe organismer har støt udviklet effektive molekylære mekanismer til at tackle overskydende ROS-akkumulering i celler og væv. Disse mekanismer omfatter medlemmer af superoxiddismutase (SOD) proteinfamilien, som katalyserer superoxidradikal dismutation til molekylært ilt og hydrogenperoxid, samt forskellige katalaser og peroxidaser, der bruger antioxidantpuljen (glutathion, NADPH, peroxiredoxin, thioredoxin 7,8) til at katalysere den efterfølgende omdannelse af hydrogenperoxid til vand og molekylært oxygen.
Imidlertid understøtter flere rapporter ROS's rolle som nøglekomponenter i molekylære kredsløb, der regulerer kritiske cellefunktioner, herunder spredning, differentiering og mobilitet 2,3,4. Dette koncept understøttes yderligere af den indledende identifikation og karakterisering af dedikerede ROS-producerende mekanismer i aerobe organismer, herunder lipoxygenaser cyclooxygenaser og NADPH-oxidaser 9,10. I denne forstand udviser ROS en aktiv rolle under hvirveldyrs embryoudvikling 11,12,13, og nøgleroller for disse molekyler i reguleringen af specifikke in vivo fysiologiske funktioner er blevet rapporteret i forskellige eksperimentelle systemer, herunder differentieringsprogrammet for hæmatopoietiske forfædre i Drosophila14, helbredende induktion i zebrafisk eller haleregenerering i Xenopus haletudser 15. Hos pattedyr har ROS været involveret i neurale stamcellers selvfornyelse/differentieringspotentiale i en neurosfæremodel16 og i dereguleringen af tarmens stamcellefunktion under initiering af kolorektal cancer17. I huden har ROS-signalering været forbundet med epidermal differentiering og regulering af hudens stamcelleniche og hårsækkens vækstcyklus18,19.
I dette perspektiv er en væsentlig eksperimentel begrænsning for at bestemme ROS's fysiologiske roller i biologiske systemer, både under normale eller patologiske forhold, manglen på tilstrækkelige eksperimentelle værktøjer til at inducere kontrolleret produktion af disse molekyler i celler og væv, der nøjagtigt ligner deres fysiologiske produktion som anden signalbudbringer. På nuværende tidspunkt involverer de fleste eksperimentelle tilgange administration af eksogen ROS, hovedsagelig i form af hydrogenperoxid. Vi har for nylig implementeret en eksperimentel tilgang til at tænde for en forbigående, ikke-dødelig in vivo-produktion af endogen ROS i musehuden baseret på administration af forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX (PpIX; f.eks. aminolaevulinsyre eller dets methylderivat methylaminolevulinat) og yderligere bestråling af prøven med rødt lys for at inducere in situ-dannelse af ROS fra intracellulært molekylært ilt (figur 1). Denne fotodynamiske procedure kan effektivt anvendes til at stimulere residente stamcellenicher og dermed aktivere vævets regenerative programmer19,20 og åbne vejen for nye terapeutiske modaliteter inden for hudregenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af protokollen, der viser repræsentative eksempler på stimulering af stamcellenicher, målt som en stigning i antallet af langsigtede 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) etiketfastholdende celler (LRC'er) i udbulningsområdet i hårsækken19,21 og efterfølgende aktivering af regenereringsprogrammer (acceleration af hårvækst og brandhelingsprocesser) induceret af forbigående, ikke-dødelig ROS-produktion i huden på C57Bl6-musestammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musehold og forsøg skal udføres i overensstemmelse med lokal, national, international lovgivning og retningslinjer for dyreforsøg.
1. Induktion af hårvækst, forbrænding, induktion og identifikation af langsigtede BrdU LRC'er i hele halehudens epitel
BEMÆRK: Brug 10 dage eller 7 uger gamle C57BL/6-mus, helst kuldkammerater, til de eksperimentelle designs, der er beskrevet nedenfor. I alle forsøgsprocedurer vil dyrene blive bedøvet ved 3% isofluranindånding eller aflivet ved cervikal dislokation som angivet.
- Induktion af hårvækst i ryghuden hos mus i den anden telogen (hvile) fase (ca. dag 50 efter fødslen)
- Bedøv mus med indånding af 3% isofluran. Bekræft fuld dyb bedøvelse ved manglende pedalrefleks (fast tåklemme). Barber to uafhængige områder side om side af baghuden i hver enkelt mus ved hjælp af hårklippere og hårfjerningscreme (materialetabel). Brug venstre side til kontrol og højre side til behandling.
BEMÆRK: Kontroller, at den underliggende ryghud efter barbering er lyserød og ikke grå/sort, en indikator for melanogenese og indgang til den anagene (voksende) fase i denne musestamme. - Der vaskes grundigt med PBS for at fjerne alle cremerester og fortsættes med induktion af forbigående in situ-produktion af ikke-dødelige ROS-niveauer som beskrevet i pkt. 2.1.
- Registrer hårsækkens vækst gennem daglig erhvervelse af billeder i høj opløsning af kontrol- og behandlede ryghudområder hos hvert dyr (f.eks. ved hjælp af et HD-kamera koblet til en 5-20x kikkertlinse).
- Bedøv mus med indånding af 3% isofluran. Bekræft fuld dyb bedøvelse ved manglende pedalrefleks (fast tåklemme). Barber to uafhængige områder side om side af baghuden i hver enkelt mus ved hjælp af hårklippere og hårfjerningscreme (materialetabel). Brug venstre side til kontrol og højre side til behandling.
- Induktion af 2. grads forbrændinger læsioner i ryghuden hos mus i den anden telogen (hvile) fase (ca. dag 50 efter fødslen)
- Bedøv mus. Barber hele ryghudsregionen i hver enkelt mus ved hjælp af hårklippere og hårfjerningscreme og vask grundigt med PBS for at fjerne alle cremerester.
BEMÆRK: Administrer in situ subkutane injektioner af lidokain 0,5% (2 mg / ml) i sterilt saltvand, ikke over 7 mg / ml, lige før brændingsproceduren. - Forvarm en messingstang (1 cm i tværsnit) ved 95 °C ved nedsænkning i kogende vand, og påfør derefter på det centrale område af den dorsale baghudoverflade på hver mus i 5 sekunder.
- Lige efter forbrændingsgenerering injiceres dyrene intraperitonealt med 1 ml fysiologisk opløsning (0,9% NaCl) på et elektrisk tæppe for at forhindre dehydrering. Dyrene lades restituere i 24 timer, og der indledes en forbigående in situ-produktion af ikke-dødelige ROS-niveauer som beskrevet i pkt. 2.3.
- Optag progression af brandsår gennem daglig erhvervelse af billeder i høj opløsning af kontrol- og behandlede ryghudområder hos hvert dyr (f.eks. ved hjælp af et HD-kamera koblet til en 5-20x kikkertlinse).
- Bedøv mus. Barber hele ryghudsregionen i hver enkelt mus ved hjælp af hårklippere og hårfjerningscreme og vask grundigt med PBS for at fjerne alle cremerester.
- Generering og identifikation af langsigtede BrdU LRC'er i haleskindets epitel
- Injicer 10/14 dage gamle kuldkammerater intraperitonealt (ingen bedøvelse) én gang dagligt i 4 på hinanden følgende dage med 50 mg/kg legemsvægt BrdU opløst i PBS. Efter mærkningsfasen skal du lade mus vokse i 50-60 dage før enhver behandling.
BEMÆRK: Brug en frisk nål til hver injektion. - Der fortsættes som beskrevet i pkt. 2.3 for induktion af forbigående in situ nonletal ROS-produktion i halehuden på forskellige tidspunkter før klargøring af helvævsvæv.
- For at forberede hele mounts af haleepidermis skal du aflive mus ved cervikal dislokation og klippe halerne med kirurgisk saks.
- Brug en skalpel til at lave et lige langsgående snit langs halen og skræl hele huden som et enkelt stykke fra rygraden. Den skrællede hud inkuberes i 5 mM EDTA i PBS i 5 ml reagensglas i 4 timer ved 37 °C, og intakte epidermisplader adskilles forsigtigt fra dermis med pincet.
- Vævet fastgøres i 4% formaldehyd i PBS i mindst 72 timer ved stuetemperatur (RT) og fortsæt til BrdU-detektion ved hjælp af passende antistoffer.
- Brug fluorescens/konfokalmikroskopi til at identificere og kvantificere LRC'er i hver eksperimentel tilstand, herunder lyskontroller og fotodynamiske behandlinger på forskellige tidspunkter før fremstillingen af vævshelmonteringer, som tidligere beskrevet detaljeret19,20.
BEMÆRK: Faste epidermale plader kan opbevares i PBS indeholdende 0,02% natriumazid ved 4 °C i op til tre måneder. Faste epidermale plader kan anvendes til immunlokalisering af krævede proteiner efter standard histologiske sektioner procedurer.
- Injicer 10/14 dage gamle kuldkammerater intraperitonealt (ingen bedøvelse) én gang dagligt i 4 på hinanden følgende dage med 50 mg/kg legemsvægt BrdU opløst i PBS. Efter mærkningsfasen skal du lade mus vokse i 50-60 dage før enhver behandling.
2. Induktion af forbigående produktion af ikke-dødelige ROS-niveauer i musehud
BEMÆRK: For at inducere forbigående produktion af ikke-dødelige ROS-niveauer i musehud anvendes en fotodynamisk behandling ved hjælp af en forløber for det endogene fotosensibilisator PpIX, i dette tilfælde methylaminolevulinat (mALA), og rødt lys.
- For at aktivere forbigående ROS-produktion til induktion af hårvækst i ryghuden skal dyrene tilberedes som angivet i pkt. 1.1.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form af topisk creme (materialetabel) på højre region, og hold venstre side som en intern kontrol for at undgå forskelle mellem enkeltpersoner. Inkuber i 2,5 timer i mørke, vask overskydende creme grundigt med PBS. For at bekræfte anæstesidybden skal du overvåge dyrene hvert 10. minut, indtil de er helt genoprettet.
BEMÆRK: Produktionen af PpIX i ryghuden bør testes in situ ved dens røde fluorescens under blåt lys (407 nm) excitation. - Bedøv dyrene.
- Bestråle hele ryghuden med en passende kilde til rødt lys (materialetabel) til en samlet dosis på 2,5-4 J/cm2. Opbevar musene på et elektrisk tæppe, indtil de er helt raske, og fortsæt som beskrevet i trin 1.1.3.
BEMÆRK: Bestråling skal justeres ved at manipulere afstanden mellem lyskilden og vævet og måles ved hjælp af en effektenergimåler (materialetabel). Eksperimentet betragtes som færdigt, når fuld hårvækst observeres i et af de uafhængige barberede områder af hvert dyr. Hele proceduren involverer kun en enkelt fotobehandling.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form af topisk creme (materialetabel) på højre region, og hold venstre side som en intern kontrol for at undgå forskelle mellem enkeltpersoner. Inkuber i 2,5 timer i mørke, vask overskydende creme grundigt med PBS. For at bekræfte anæstesidybden skal du overvåge dyrene hvert 10. minut, indtil de er helt genoprettet.
- For at aktivere forbigående ROS-produktion til helingsforbedring af 2. grads forbrændinger skal dyrene klargøres som angivet i pkt. 1.2.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form af topisk creme langs hele den brændte overflade, der omfatter ca. 4 mm tilstødende væv. Inkuber i 2,5 timer i mørke, vask overskydende creme grundigt med PBS. For at bekræfte anæstesidybden skal du overvåge dyrene hvert 10. minut, indtil de er helt genoprettet.
- Bedøv dyrene.
- Bestråle hele ryghuden med en passende kilde til rødt lys til en samlet dosis på 2,5-4 J/cm2. Opbevar musene på et elektrisk tæppe, indtil de er helt raske, og fortsæt som beskrevet i trin 1.2.4.
BEMÆRK: Forsøgsproceduren for hvert dyr betragtes som afsluttet, når fuld brandheling observeres. Hele proceduren involverer kun en enkelt fotobehandling.
- For at aktivere forbigående ROS-produktion i halehuden skal du forberede mus som angivet i pkt. 1.3, anvende ~25 mg mALA i form af topisk creme langs hele rygvævsområdet og fortsætte som beskrevet i pkt. 2.1 for baghuden. Udfør fotobehandlinger og korrespondentlyskontroller 24 timer, 48 timer eller 72 timer før dyredødshjælp og yderligere ekstraktion af halehuden hele monteringer.
BEMÆRK: I alle eksperimentelle designs assay ROS-afhængigheden af processen ved hjælp af antioxidant ROS scavengers (fx daglig podning af 100 mg / kg legemsvægt N-acetylcystein ved intraperitoneal injektion af en 20 mg / ml opløsning i PBS, pH 7,2, startende 5 dage før mALA behandlinger eller alternativt to doser af 100 mg / ml ascorbinsyre i 50% ethanol, med en afstand på 30 minutter, topisk påført huden i tidsintervallet mellem mALA-behandlingerne og bestråling med rødt lys).
3. ROS-detektion i huden
- Ex vivo-evaluering af ROS-produktion i halehuden efter fotodynamisk behandling med hydroethhidin
BEMÆRK: Hydroethidin er et ikke-fluorescerende molekyle, der reagerer specifikt med ROS for at producere fluorescerende farvestof 2-hydroxyethidium (hET).- Der inkuberes hele haleskind opnået som beskrevet i punkt 1.3.3 i 3 timer ved 37 °C i 5 mM EDTA i PBS-opløsning (kontrolprøver) eller yderligere indeholdende 2 mM mALA (fotodynamiske behandlingsprøver).
- I alle tilfælde tilsættes hydroethidin til en slutkoncentration på 3,2 μM fra en 25 mg/ml stamme i dimethylsulfoxid (DMSO) og inkuberes i 1 time i mørke ved RT.
- Haleskindsprøverne strækkes over en glasoverflade ved hjælp af fingerspidserne, og bestråles med 636 nm rødt lys ved et fluens på 10 J/cm2 .
- Der fortsættes straks med at adskille epidermis fra dermis og fastgøres epidermale plader som beskrevet i punkt 1.3.3.
- Evaluer den røde hET-emission under et fluorescens/konfokalmikroskop ved hjælp af grønt spændende lys, tag billeder i høj kvalitet og fortsæt med yderligere analyse.
BEMÆRK: Brug hET-farvning af vævsprøver i fravær af fotodynamisk behandling som negativ kontrol for hET-autoxidation.
- In vivo påvisning af ROS-produktion i baghuden efter induktion af hårvækst og brandsårsheling efterfulgt af fotodynamisk behandling
BEMÆRK: Dette trin udføres under anvendelse af 2′,7′-dichlordihydrofluoresceindiacetatet (DHF-DA), en celleperment ikke-fluorescerende forbindelse, der efter spaltning af intracellulære esteraseenzymer specifikt reagerer med ROS, der giver 2′,7′-dichlorfluorescein (DCF) fluorescerende farvestof.- Brug dyr, der er forberedt til induktion af hårvækst (punkt 1.1) eller brandheling (pkt. 1.2). Lige før topiske mALA creme behandlinger (se pkt. 2.1 og 2.2), topisk dispenseres 100 μL 1 mg/ml i 50% ethanol af DHF-DA på alle mål kontrol / behandlede hudområder, lad huden absorbere materialet fuldt ud og fortsæt med topisk mALA creme ansøgning.
- Inkuber behandlede dyr i 4 timer i mørke, vask den topiske mALA creme grundigt af huden med PBS og dispenser en anden dosis på 100 μL DHF-DA opløsning på huden. For at bekræfte anæstesidybden skal du overvåge dyrene hvert 10. minut, indtil de er helt genoprettet.
- Inkuber behandlede dyr i 50 minutter i mørke, bedøvelse og bestråle hele ryghuden med en fluens fra 2,5 til 4 J / cm2 med 636 nm rødt lys ved hjælp af en LED-lampe.
- Umiddelbart efter bestråling evalueres ROS-niveauer, der genereres i huden, ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem (materialetabel). Indstil filterboksen til 445-490 nm excitation og 515-575 nm emission, tag billeder i høj kvalitet og fortsæt med yderligere analyse.
BEMÆRK: Brug DHF-DA-farvning af vævsprøver i fravær af fotodynamisk behandling som negativ kontrol for DHF-DA-autoxidation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Topisk administration af mALA-prækursoren i musens ryg- og halehud resulterer i en signifikant ophobning af PpIX i hele vævet og mærkbart i hårsækken, som demonstreret ved den rødlig-lyserøde fluorescens af denne forbindelse under blåt lys (407 nm) excitation (figur 2A,C). Efterfølgende bestråling af behandlet væv med rødt lys (636 nm) ved en fluens på 2,5-4 J/cm2 fremmer forbigående produktion af ROS i vævet, især i hårsækkens buleområde (figur 2B,D).
Aktivering af ikke-dødelig ROS-produktion i musehud in vivo fremmer en signifikant stigning i antallet af LRC'er, kategoriseret som somatiske stamceller, i hårsækkens buleområde to dage efter fotobehandlinger (figur 3, venstre paneler). Især er stigningen i antallet af LRC'er forbigående og vender tilbage til normale niveauer 6 dage efter behandlingerne (figur 3, højre panel). Da denne region er en af de vigtigste stamcellenicher i musehud, afspejler en forbigående induktion af celleproliferation i denne region hovedsageligt den funktionelle aktivering af bulenichen og af de residente stamcelleprogrammer for spredning og differentiering22,23.
Den ROS-afhængige aktivering af den bule hårfollikelniche er yderligere forbundet med fysiologiske reaktioner i huden. Således fremskynder forbigående ROS-produktion især hudens helingsproces efter en 2. grads forbrænding (figur 4A, B). Kvantificering af den gradvise reduktion af det beskadigede/skorpede hudområde viser robustheden og den statistiske betydning af sårhelingsaccelerationsprocessen induceret af PpIX-afhængig forbigående ROS-produktion i vævet (figur 4C). På samme måde fremmer ikke-dødelige ROS-niveauer stærkt hårvækst efter barbering under den anden koordinerede telogen (figur 5A), en fase, hvor hårsækken er ildfast for at reagere på vækststimuli22,23, hvilket udgør en passende måde at evaluere potentialet for nye forbindelser og / eller processer til at stimulere hårvækst. Især resulterer brugen af antioxidantforbindelser som ascorbinsyre (AA) i en statistisk signifikant reduktion i antallet af dyr, der viser accelereret hårvækst (figur 5B). Derudover reduceres ROS-produktionen i huden efter fotobehandlinger, kvantificeret ved fluorescerende emission af DHF i huden, også signifikant af antioxidantforbindelser (figur 5C). Tilsammen viser disse resultater, at ROS-produktion efter PpIX-baserede fotobehandlinger er strengt nødvendig for at fremkalde en fysiologisk reaktion i vævet.
Figur 1: Teoretisk baggrund for kontrolleret tænding af endogen fotodynamisk produktion af ROS in situ i celler og væv ved hjælp af hæmbiosyntesevejen. A) Skematisk gengivelse af de grundlæggende fotokemiske reaktioner, der resulterer i molekylær oxygenexcitation under fotodynamiske behandlinger. Ved absorption af lys med det passende λ gennemgår et fotosensibilisatormolekyle (PS) i jordtilstanden S0 en overgang til en exciteret singlet tilstand S1. Da enhver exciteret tilstand er energisk mindre foretrukket end grundtilstanden, vender molekylet tilbage til S0 efter en kort periode. De fleste PS har en høj kvanteeffektivitet for overgangen fra S 1 til triplettilstanden T1, generelt kendetegnet ved en relativ lang levetid. Aktiveret PS i den ophidsede triplettilstand kan reagere med andre molekyler via to forskellige veje. En type I fotokemisk reaktion er overførslen af elektroner til tilstødende molekyler til dannelse af radikale arter; disse radikaler vil sandsynligvis reagere med molekylært ilt for at producere ROS, herunder superoxidanion (•O2-), hydrogenperoxid (H2O2) og hydroxylradikal (•OH). En type II fotokemisk reaktion repræsenterer den dominerende proces for de fleste PS anvendt i PDT. Under denne reaktion driver overførslen af energi (ikke elektroner) til molekylært oxygen (hvis konfiguration i jordtilstanden er triplet, 3O2) dannelsen af det ikke-radikale, men meget reaktive singlet oxygen (1O2). De fotoprodukter, der dannes under disse reaktioner, udløser en kaskade af biokemiske hændelser, hvilket resulterer i en oxidativ stress, der endelig forårsager celledød, eller som potentielt kan stimulere cellevækst. (B) 5-aminolevulinsyre (ALA) er en naturlig forløber i hæmbiosyntetisk vej, som involverer både mitokondrie og cytosoliske cellulære rum. ALA-syntaseenzymaktiviteten reguleres af en negativ feedback-kontrol, hvorved fri hæm, det endelige produkt af denne vej, hæmmer syntesen af ALA fra glycin og succinyl CoA. Administration af eksogen ALA eller dets derivat methylaminolevulinat (mALA) omgår det regulatoriske feedbacksystem, således at nedstrøms metabolitter, især protoporphyrin IX (PpIX), akkumuleres i cellen, der inducerer fotosensibilisering. De hastighedsbegrænsende egenskaber ved ferrochelatase, katalysatorenzymet for jernindsættelsen i PpIX, fremmer akkumuleringen af denne endogene PS-forbindelse. PBG = porphobilinogen. Dette tal er ændret fra Carrasco et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fotodynamisk behandling med mALA og rødt lys inducerer forbigående produktion af ROS i huden. (A) Akkumulering af endogen PpIX efter mALA emnebehandling i baghuden. Den venstre side i samme dyr blev brugt som kontrol. (B) Venstre panel: PpIX-afhængig ROS (mALA+Light) produktion overvåget af DHF-DA. Højre panel: tidsforløbsanalyse af relativ ROS-produktion i baghuden; den relative integrerede tæthed af DHF-DA-fluorescerende emission af mALA+lys versus lysområder i hvert dyr blev kvantificeret på forskellige tidspunkter efter bestråling og normaliseret som beskrevet i metodologi. Den gennemsnitlige ± SE var repræsenteret (n = 4 for hvert tidspunkt). (C) Lokalisering af PpIX i halehuden (fluorescensmikroskopibilleder). (D) ROS-produktion i halehuden efter mALA+Light som afsløret af hET, der viser en øget og vedvarende ophobning i hårsækkens buleområde. Repræsentative konfokale mikroskopibilleder (maksimale fremskrivninger) vises. Skalabjælke = 100 μm. Dette tal er ændret fra Carrasco et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Aktivering af in situ ROS-produktion i huden fremmer en signifikant stigning i stamceller i udbulningsområdet i hårsækkenichen. Venstre paneler: repræsentative konfokale mikroskopibilleder (maksimale projektioner), der viser lokaliseringen af BrdU-etiketfastholdende celler (LRC) i musehalehuden hele monteringer og den tydelige stigning i LRC i hårsækkenes buleområde 2 dage efter PpIX-baserede fotobehandlinger. Højre panel: kvantificering af antallet af LRC i hårsækkens buleområde. Middelværdien + SE (n = 4) er repræsenteret. Skalabjælke = 50 μm. Dette tal er ændret fra Carrasco et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Aktivering af in situ ROS-produktion i huden fremskynder brandsårshelingen. A) PpIX-produktion induceret af mALA i brændskadede områder hos behandlede dyr sammenlignet med kontrolprøver. (B) Burn healing evolution i mALA+Light behandlede og kontrol dyr. (C) Tidsforløbskvantificering af brændte områder (venstre panel), der viser accelereret brandsårsheling hos mALA+Light behandlede dyr; gennemsnittet + SE (n = 4) af uhelet areal er repræsenteret. Areal-under-kurven-analyse (højre panel), der viser statistiske forskelle mellem begge tidsforløbskurver (p ≤ 0,06). Dette tal er ændret fra Carrasco et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Aktivering af in situ ROS-produktion i huden stimulerer hårvækst. (A) Øverste række: Induktion af hårvækst under den ildfaste telogenfase af mALA+Light (højre side af dorsal hud) sammenlignet med lyskontrolområdet (venstre side). Nederste række: Både ROS-produktionen i huden og accelerationen af hårvækst induceret af mALA+Light hæmmes af ascorbinsyre (AA) antioxidantbehandling. (B) Kvantificering af procentdelen af dyr, der udviser accelereret hårvækst i mALA-PT sammenlignet med kontrolregionen ved fravær eller tilstedeværelse af antioxidanten AS (n = 4 ud af 3 uafhængige forsøg). C) Kvantificering af ROS-produktionshæmningen i dorsal hud induceret af AS under mALA-PT (n = 4). I alle tilfælde repræsenterer søjler middelværdi + SE. Dette tal er ændret fra Carrasco et al.19. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en metode, der tillader en forbigående aktivering af endogen ROS-produktion in vivo i musehud med fysiologiske virkninger. Metoden er baseret på en fotodynamisk procedure til at inducere en kontrolleret og lokal stimulering af det endogene fotosensibilisator PpIX (figur 1B). Denne eksperimentelle tilgang er et interessant værktøj til at studere ROS-biologi i in vivo-eksperimentelle systemer, der udgør et betydeligt fremskridt i forhold til metoder, der bruger eksterne ROS-kilder (normalt hydrogenperoxid) og muliggør kontrolleret og lokal produktion af ROS i vævet / prøven.
Da aminolevulinatbaserede prækursorer administreres i overskud for at fremme akkumuleringen af PpIX inde i cellerne, er et kritisk skridt i denne metode etablering af en passende lysdosis til at inducere forbigående produktion af ROS-niveauer i vævet under skadetærsklen, men udviser en stærk stimulerende virkning. I øjeblikket er der ingen tilgængelige teknologier til direkte at kvantificere den nøjagtige mængde af enhver form for ROS, der produceres i celler og væv. I vores metode er det stadig ikke muligt at etablere en direkte sammenhæng mellem en given lysdosis, den nøjagtige mængde ROS produceret og en given biologisk effekt (f.eks. Celledød eller celleproliferation). Af denne grund bør lysdosis (fluens) for en bestemt eksperimentel model etableres empirisk af forskeren ved hjælp af kvalitative eller semikvalitative parametre, der vælges for hver situation. I tilfælde af musehud vælger vi en let målbar overgang mellem celledød og vævsskade og induktion af en signifikant og forbigående proliferativ bølge.
Den metode, der præsenteres her, har vist sig at være meget effektiv til forbedring af hudregenerering i forskellige processer, herunder brandheling og hårfollikelvækst. Disse observationer baner vejen for implementering af terapeutiske anvendelser af denne teknologi i klinikker til behandling af tilfældige eller kroniske forbrændinger og sår eller for forskellige patologier hud og især hårsækken, der involverer en defekt stamcellefunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle kommercielle anvendelser af de procedurer, der er beskrevet i dette værk, er beskyttet af et CSIC-UAM-patent (EP2932967A1) forfattet af EC, MIC og JE og licenseret til Derma Innovate SL til kommerciel udnyttelse. JE og JJM har en rådgivende stilling i Derma Innovate SL.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 til JE) og Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 til JE) i Spanien. EF er blevet støttet af Atracción de Talento Investigador-tilskuddet 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid og UAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
