Summary
Målet med denne protokollen er å indusere transient in vivo produksjon av ikke-dødelige nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) i musehud, noe som ytterligere fremmer fysiologiske responser i vevet.
Abstract
Her beskriver vi en protokoll for å indusere byttbar in vivo fotogenerering av endogene reaktive oksygenarter (ROS) i musehud. Denne forbigående produksjonen av ROS in situ aktiverer effektivt celleproliferasjon i stamcellenisjer og stimulerer vevregenerering som sterkt manifestert gjennom akselerasjon av brannheling og hårsekkvekstprosesser. Protokollen er basert på en regulerbar fotodynamisk behandling som behandler vevet med forløpere til den endogene fotosensibilisatoren protoporfyrin IX og videre bestråler vevet med rødt lys under tett kontrollerte fysisk-kjemiske parametere. Samlet sett utgjør denne protokollen et interessant eksperimentelt verktøy for å analysere ROS-biologi.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) er resultatet av kjemisk reduksjon av molekylært oksygen for å danne vann, og inkluderer singlet oksygen, superoksidanion, hydrogenperoksid og hydroksylradikalet 1,2,3. ROS har svært kort levetid på grunn av deres ekstremt kjemiske reaktive natur. I aerobe organismer dannes ROS tilfeldigvis inne i cellene som et stort lekkende biprodukt av aerob respirasjon (elektrontransportkjede) i mitokondriene. Forbigående akkumulering av høye nivåer av ROS i cellen resulterer i en oksidativ stresstilstand som kan provosere irreversibel inaktivering av proteiner, lipider og sukkerarter og innføring av mutasjoner i DNA-molekylet 2,3,4,5. Den gradvise akkumuleringen av oksidativ skade i celler, vev og hele organismer øker jevnt med tiden og har vært assosiert med induksjon av celledødsprogrammer, flere patologier og aldringsprosessen 2,3,4,6.
Aerobe organismer har stadig utviklet effektive molekylære mekanismer for å takle overflødig ROS-akkumulering i celler og vev. Disse mekanismene inkluderer medlemmer av superoksiddismutase (SOD) proteinfamilien, som katalyserer superoksydradikaldismutasjon til molekylært oksygen og hydrogenperoksid, samt forskjellige katalaser og peroksidaser som bruker antioksidantbassenget (glutation, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin 7,8) for å katalysere den påfølgende omdannelsen av hydrogenperoksid til vann og molekylært oksygen.
Imidlertid støtter flere rapporter rollen som ROS som nøkkelkomponenter i molekylære kretser som regulerer kritiske cellefunksjoner, inkludert spredning, differensiering og mobilitet 2,3,4. Dette konseptet støttes videre av den første identifiseringen og karakteriseringen av dedikerte ROS-produserende mekanismer i aerobe organismer, inkludert lipoksygenaser, cyklooksygenaser og NADPH-oksidaser 9,10. I denne forstand viser ROS en aktiv rolle under vertebratembryoutvikling 11,12,13 og nøkkelroller for disse molekylene i reguleringen av spesifikke in vivo fysiologiske funksjoner har blitt rapportert i forskjellige eksperimentelle systemer, inkludert differensieringsprogrammet for hematopoietiske forfedre i Drosophila14, helbredende induksjon i sebrafisk eller haleregenerering i Xenopus rumpetroll 15. Hos pattedyr har ROS vært involvert i selvfornyelses-/differensieringspotensialet til nevrale stamceller i en nevrosfæremodell16 og i dereguleringen av intestinal stamcellefunksjon under oppstart av kolorektal kreft17. I huden har ROS-signalering vært assosiert med epidermal differensiering og regulering av hudens stamcellenisje og hårsekkens vekstsyklus18,19.
I dette perspektivet er en stor eksperimentell begrensning for å bestemme de fysiologiske rollene til ROS i biologiske systemer, både under normale eller patologiske forhold, mangelen på tilstrekkelige eksperimentelle verktøy for å indusere kontrollert produksjon av disse molekylene i celler og vev, som nøyaktig ligner deres fysiologiske produksjon som andre signalbudbringere. For tiden involverer de fleste eksperimentelle tilnærminger administrering av eksogen ROS, hovedsakelig i form av hydrogenperoksid. Vi har nylig implementert en eksperimentell tilnærming for å slå på en forbigående, ikke-dødelig in vivo produksjon av endogen ROS i musehuden, basert på administrering av forløpere til den endogene fotosensibilisatoren protoporfyrin IX (PpIX; f.eks. aminolevulinsyre eller dets metylderivat metylaminolevulinat) og ytterligere bestråling av prøven med rødt lys for å indusere in situ-dannelsen av ROS fra intracellulært molekylært oksygen (figur 1). Denne fotodynamiske prosedyren kan effektivt brukes til å stimulere residente stamcellenisjer, og dermed aktivere vevets regenerative programmer19,20 og åpne veien for nye terapeutiske modaliteter i hudregenerativ medisin. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av protokollen, som viser representative eksempler på stimulering av stamcellenisjer, målt som en økning i antall langsiktige 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) etikettholderceller (LRC) i hårsekkens buleområde19,21, og påfølgende aktivering av regenereringsprogrammer (akselerasjon av hårvekst og brennhelingsprosesser) indusert av forbigående, ikke-dødelig ROS-produksjon i huden av C57Bl6 musestamme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for musehold og forsøk skal gjennomføres i samsvar med lokalt, nasjonalt, internasjonalt lovverk og retningslinjer for dyreforsøk.
1. Induksjon av hårvekst, brenninduksjon og identifisering av langsiktige BrdU LRC i halehudepitelet
MERK: Bruk 10-dagers eller 7-ukers gamle C57BL/6-mus, helst kullkamerater, for de eksperimentelle designene beskrevet nedenfor. I alle eksperimentelle prosedyrer vil dyrene bli bedøvet ved 3% isofluran inhalasjon eller avlivet ved cervikal dislokasjon som indikert.
- Induksjon av hårvekst i bakhuden hos mus i den andre telogenfasen (hvilende) (ca. dag 50 etter fødselen)
- Bedøv mus med innånding av 3% isofluran. Bekreft full dypbedøvelse ved mangel på pedalrefleks (fast tåklemme). Barber to uavhengige side om side regioner av bakhuden i hver enkelt mus ved hjelp av hårklippere og hårfjerningskrem (materialfortegnelse). Bruk venstre side for kontroll og høyre side for behandling.
MERK: Kontroller at den underliggende rygghuden etter barbering er rosa og ikke grå/svart, en indikator på melanogenese og inngang i anagen (voksende) fase i denne musestammen. - Vask grundig med PBS for å fjerne alle kremrester og fortsett til induksjon av transient in situ produksjon av ikke-dødelige ROS nivåer som beskrevet i pkt. 2.1.
- Registrer hårsekkvekst gjennom daglig innsamling av høyoppløselige bilder av kontroll- og behandlingshudområdene i hvert dyr (f.eks. ved hjelp av et HD-kamera koblet til en 5-20x kikkertlinse).
- Bedøv mus med innånding av 3% isofluran. Bekreft full dypbedøvelse ved mangel på pedalrefleks (fast tåklemme). Barber to uavhengige side om side regioner av bakhuden i hver enkelt mus ved hjelp av hårklippere og hårfjerningskrem (materialfortegnelse). Bruk venstre side for kontroll og høyre side for behandling.
- Induksjon av 2. grads brannskader i bakhuden hos mus i den andre telogenfasen (hvilende) (ca. dag 50 etter fødselen)
- Bedøv mus. Barber hele rygghudregionen i hver enkelt mus ved hjelp av hårklippere og hårfjerningskrem og vask grundig med PBS for å fjerne alle kremrester.
MERK: Administrer in situ subkutane injeksjoner av lidokain 0,5 % (2 mg/ml) i steril saltvann, som ikke overstiger 7 mg/ml, like før brenneprosedyren. - Forvarm en messingstang (1 cm i tverrsnitt) ved 95 °C ved å senke den i kokende vann og påfør deretter på den sentrale delen av rygghudoverflaten på hver mus i 5 s.
- Like etter brenngenerering, injiser dyrene intraperitonealt med 1 ml fysiologisk løsning (0,9% NaCl) på et elektrisk teppe for å forhindre dehydrering. La dyrene komme seg i 24 timer og fortsett til induksjon av transient in situ produksjon av ikke-dødelige ROS-nivåer som beskrevet i pkt. 2.3.
- Registrere progresjon av brannsår gjennom daglig innsamling av høyoppløselige bilder av kontroll- og bakhudområdene i hvert dyr (f.eks. ved bruk av et HD-kamera koblet til en 5-20x kikkertlinse).
- Bedøv mus. Barber hele rygghudregionen i hver enkelt mus ved hjelp av hårklippere og hårfjerningskrem og vask grundig med PBS for å fjerne alle kremrester.
- Generering og identifisering av langsiktige BrdU LRC i halehudepitelet
- Injiser 10/14 dager gamle kullkamerater intraperitonealt (ingen anestesi) en gang daglig i 4 påfølgende dager med 50 mg / kg kroppsvekt BrdU oppløst i PBS. Etter merkefasen, la mus vokse i 50-60 dager før noen behandling.
MERK: Bruk en ny kanyle til hver injeksjon. - Fortsett som beskrevet i pkt. 2.3 for induksjon av transient in situ ikke-dødelig ROS-produksjon i halehuden på forskjellige tidspunkter før preparering av vev hele.
- For å forberede helmonteringer av halepidermis, avlive mus ved cervikal dislokasjon og klipp halene med kirurgisk saks.
- Bruk en skalpell til å lage et rett langsgående snitt langs halen og skrell hele huden som et enkelt stykke fra ryggraden. Inkuber den skrellede huden i 5 mM EDTA i PBS i 5 ml rør i 4 timer ved 37 °C og skill forsiktig intakte epidermis fra dermis ved hjelp av tang.
- Fest vevet i 4% formaldehyd i PBS i minst 72 timer ved romtemperatur (RT) og fortsett med BrdU-deteksjon ved bruk av passende antistoffer.
- Bruk fluorescens / konfokalmikroskopi for å identifisere og kvantifisere LRC i hver eksperimentell tilstand, inkludert lyskontroller og fotodynamiske behandlinger på forskjellige tidspunkter før fremstilling av vevshele, som tidligere beskrevet i detalj19,20.
MERK: Faste epidermale ark kan oppbevares i PBS inneholdende 0,02 % natriumazid ved 4 °C i opptil tre måneder. Faste epidermale ark kan brukes til immunlokalisering av nødvendige proteiner etter standard histologiske seksjonsprosedyrer.
- Injiser 10/14 dager gamle kullkamerater intraperitonealt (ingen anestesi) en gang daglig i 4 påfølgende dager med 50 mg / kg kroppsvekt BrdU oppløst i PBS. Etter merkefasen, la mus vokse i 50-60 dager før noen behandling.
2. Induksjon av forbigående produksjon av ikke-dødelige ROS-nivåer i musehud
MERK: For å indusere forbigående produksjon av ikke-dødelige ROS-nivåer i musehud, vil en fotodynamisk behandling ved hjelp av en forløper for den endogene fotosensibilisatoren PpIX, i dette tilfellet metylaminolevulinat (mALA), og rødt lys bli brukt.
- For å slå på forbigående ROS-produksjon for induksjon av hårvekst i bakhuden, klargjør dyrene som angitt i pkt. 1.1.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form av aktuell krem (materialfortegnelse) på høyre region, og hold venstre side som en internkontroll for å unngå interindividuelle forskjeller. Inkuber i 2,5 timer i mørket, vask av overflødig krem grundig med PBS. For å bekrefte anestesidybden, følg dyrene hvert 10. minutt til de er fullstendig gjenopprettet.
MERK: Produksjonen av PpIX i bakhuden bør testes in situ ved sin røde fluorescens under eksitasjon av blått lys (407 nm). - Bedøv dyrene.
- Bestråle hele bakhuden med en tilstrekkelig rødlyskilde (materialfortegnelse) for en total dose på 2,5-4 J/cm2. Hold mus på et elektrisk teppe til de er fullstendig gjenopprettet og fortsett som beskrevet i trinn 1.1.3.
MERK: Bestrålingen bør justeres ved å manipulere avstanden mellom lyskilden og vevet og måles ved hjelp av en effektenergimåler (materialfortegnelse). Forsøket anses som ferdig når full hårvekst observeres i noen av de uavhengige barberte områdene til hvert dyr. Hele prosedyren innebærer bare en enkelt fotobehandling.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form av aktuell krem (materialfortegnelse) på høyre region, og hold venstre side som en internkontroll for å unngå interindividuelle forskjeller. Inkuber i 2,5 timer i mørket, vask av overflødig krem grundig med PBS. For å bekrefte anestesidybden, følg dyrene hvert 10. minutt til de er fullstendig gjenopprettet.
- For å slå på forbigående ROS-produksjon for helbredelse av 2. grads brannskader, klargjør dyrene som angitt i pkt. 1.2.
- Påfør ~ 25 mg mALA i form av aktuell krem langs den brente overflaten, som omfatter ca. 4 mm tilstøtende vev. Inkuber i 2,5 timer i mørket, vask av overflødig krem grundig med PBS. For å bekrefte anestesidybden, følg dyrene hvert 10. minutt til de er fullstendig gjenopprettet.
- Bedøv dyrene.
- Bestråle hele bakhuden med en tilstrekkelig rødlyskilde for en total dose på 2,5-4 J/cm2. Hold musene på et elektrisk teppe til de er fullstendig gjenopprettet og fortsett som beskrevet i trinn 1.2.4.
MERK: Den eksperimentelle prosedyren for hvert dyr anses som ferdig når full forbrenning er observert. Hele prosedyren innebærer bare en enkelt fotobehandling.
- For å slå på forbigående ROS-produksjon i halehud, klargjør mus som angitt i pkt. 1.3, påfør ~25 mg mALA i form av aktuell krem langs hele dorsalvevsområdet og fortsett som beskrevet i pkt. 2.1 for bakhud. Utfør fotobehandlinger og korrespondentlyskontroller 24 timer, 48 timer eller 72 timer før avlivning av dyr og videre ekstraksjon av haleskinn hele fester.
MERK: I alle eksperimentelle design, analyser ROS-avhengigheten av prosessen ved å bruke antioksidant ROS scavengers (f.eks. daglig inokulering av 100 mg / kg kroppsvekt N-acetyl-cystein ved intraperitoneal injeksjon av en 20 mg / ml løsning i PBS, pH 7,2, starter 5 dager før mALA behandlinger eller, alternativt, to doser på 100 mg / ml askorbinsyre i 50% etanol, fordelt 30 min, lokalt påført huden i tidsintervallet mellom mALA-behandlingene og rødlysbestråling).
3. ROS-deteksjon i huden
- Ex vivo evaluering av ROS-produksjon i halehud etter fotodynamisk behandling med hydroetidin
MERK: Hydroetidin er et ikke-fluorescerende molekyl som reagerer spesifikt med ROS for å produsere fluorescerende fargestoff 2-hydroksyethidium (hET).- Inkuber hele haleskinn, oppnådd som beskrevet i pkt. 1.3.3, i 3 timer ved 37 °C i 5 mM EDTA i PBS-oppløsning (kontrollprøver) eller i tillegg inneholdende 2 mM mALA (fotodynamiske behandlingsprøver).
- I alle tilfeller tilsettes hydroetidin til en endelig konsentrasjon på 3,2 μM fra en 25 mg/ml stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO) og inkuberes i 1 time i mørket ved RT.
- Strekk prøvene av haleskinnet over en glassoverflate ved hjelp av fingertuppene og bestråle med 636 nm rødt lys ved en fluens på 10 J/cm2 .
- Fortsett umiddelbart for å skille epidermis fra dermis og for å fikse epidermale ark som beskrevet i pkt. 1.3.3.
- Evaluer hET-rødt utslipp under et fluorescens / konfokalmikroskop ved hjelp av grønt spennende lys, ta bilder av høy kvalitet og fortsett med videre analyse.
MERK: Bruk hET-farging av vevsprøver i fravær av fotodynamisk behandling som en negativ kontroll for hET-autoksidasjon.
- In vivo påvisning av ROS-produksjon i bakhuden etter induksjon av hårvekst og branntilheling etterfulgt av fotodynamisk behandling
MERK: Dette trinnet utføres ved bruk av 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat (DHF-DA), en celleperment ikke-fluorescerende forbindelse som, etter spaltning av intracellulære esteraseenzymer, spesifikt reagerer med ROS som gir 2',7'-diklorfluorescein (DCF) fluorescerende fargestoff.- Bruk dyr tilberedt for induksjon av hårvekst (pkt. 1.1) eller branntilheling (pkt. 1.2). Like før topiske mALA-krembehandlinger (se pkt. 2.1 og 2.2), dispenser topisk 100 μL 1 mg/ml i 50% etanol DHF-DA på alle målkontroll-/behandlede hudområder, la huden absorbere materialet fullt ut og fortsett videre med lokal påføring av mALA-krem.
- Inkuber behandlede dyr i 4 timer i mørket, vask den aktuelle mALA-kremen grundig av huden med PBS og dispenser en andre dose på 100 μL DHF-DA-oppløsning på huden. For å bekrefte anestesidybden, følg dyrene hvert 10. minutt til de er fullstendig gjenopprettet.
- Inkuber behandlede dyr i 50 minutter i mørket, bedøv og bestråle hele bakhuden med en fluens fra 2,5 til 4 J / cm2 av 636 nm rødt lys ved hjelp av en LED-lampe.
- Umiddelbart etter bestråling, evaluere ROS-nivåer generert i huden ved hjelp av et in vivo bildesystem (materialfortegnelse). Sett filterboksen for 445-490 nm eksitasjon og 515-575 nm utslipp, ta bilder av høy kvalitet og fortsett med videre analyse.
MERK: Bruk DHF-DA-farging av vevsprøver i fravær av fotodynamisk behandling som negativ kontroll for DHF-DA autoksidasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lokal administrasjon av mALA-forløperen i musens rygg- og halehud resulterer i en signifikant akkumulering av PpIX i hele vevet og, merkbart, i hårsekken, som demonstrert ved rødlig-rosa fluorescens av denne forbindelsen under eksitasjon av blått lys (407 nm) (figur 2A,C). Etterfølgende bestråling av behandlet vev med rødt lys (636 nm) ved en fluence på 2,5-4 J/cm 2 fremmer forbigående produksjon av ROS i vevet, spesielt i utbulningsområdet i hårsekken (figur 2B,D).
Påkobling av ikke-dødelig ROS-produksjon i musehud in vivo fremmer en signifikant økning i antall LRC, kategorisert som somatiske stamceller, i utbulningsområdet i hårsekken to dager etter fotobehandlinger (figur 3, venstre panel). Spesielt er økningen i antall LRC forbigående, og gjenoppretter til normale nivåer 6 dager etter behandlinger (figur 3, høyre panel). Siden denne regionen er en av de viktigste stamcellenisjene i musehud, gjenspeiler en forbigående induksjon av celleproliferasjon i denne regionen hovedsakelig den funksjonelle aktiveringen av bulenisjen og de fastboende stamcelleprogrammene for spredning og differensiering22,23.
Den ROS-avhengige aktiveringen av den bule hårsekknisjen er videre forbundet med fysiologiske responser i huden. Dermed akselererer forbigående ROS-produksjon spesielt hudhelingsprosessen etter en 2. grads forbrenning (figur 4A,B). Kvantifisering av den gradvise reduksjonen av det skadede / skorpehudområdet demonstrerer robustheten og statistisk signifikans av sårhelingsakselerasjonsprosessen indusert av PpIX-avhengig forbigående ROS-produksjon i vevet (figur 4C). På samme måte fremmer ikke-dødelige ROS-nivåer sterkt hårvekst etter barbering under det andre koordinerte telogenet (figur 5A), en fase hvor hårsekken er ildfast for å reagere på vekststimuli22,23, noe som utgjør en tilstrekkelig måte å evaluere potensialet til nye forbindelser og / eller prosesser for å stimulere hårvekst. Spesielt resulterer bruken av antioksidantforbindelser som askorbinsyre (AA) i en statistisk signifikant reduksjon i antall dyr som viser akselerert hårvekst (figur 5B). I tillegg reduseres ROS-produksjonen i huden etter fotobehandlinger, kvantifisert av fluorescerende utslipp av DHF i huden, også betydelig av antioksidantforbindelser (figur 5C). Sammen viser disse resultatene at ROS-produksjon etter PpIX-baserte fotobehandlinger er strengt nødvendig for å indusere en fysiologisk respons i vevet.
Figur 1: Teoretisk bakgrunn for kontrollert påkobling av endogen fotodynamisk produksjon av ROS in situ i celler og vev ved bruk av biosyntetisk hemebane. (A) Skjematisk fremstilling av de grunnleggende fotokjemiske reaksjonene som resulterer i eksitasjon av molekylært oksygen under fotodynamiske behandlinger. Ved absorpsjon av lys med passende λ gjennomgår et fotosensibiliseringsmolekyl (PS) i grunntilstanden S0 en overgang til en eksitert singlettilstand S1. Siden enhver eksitert tilstand er energisk mindre å foretrekke enn grunntilstanden, går molekylet tilbake til S0 etter kort tid. De fleste PS har en høy kvanteeffektivitet for overgangen fra S 1 til tripletttilstanden T1, generelt preget av en relativ lang levetid. Aktivert PS i eksitert tripletttilstand kan reagere med andre molekyler via to forskjellige veier. En type I fotokjemisk reaksjon er overføring av elektroner til tilstøtende molekyler for å danne radikale arter; Disse radikalene vil sannsynligvis reagere med molekylært oksygen for å produsere ROS, inkludert superoksidanion (•O2-), hydrogenperoksid (H2O2) og hydroksylradikal (•OH). En type II fotokjemisk reaksjon representerer den dominerende prosessen for de fleste PS ansatt i PDT. Under denne reaksjonen driver overføringen av energi (ikke elektroner) til molekylært oksygen (hvis konfigurasjon i grunntilstanden er tripletten, 3O 2) dannelsen av det ikke-radikale, men svært reaktive singlet oksygen (1O2). Fotoproduktene dannet under disse reaksjonene utløser en kaskade av biokjemiske hendelser som resulterer i et oksidativt stress som til slutt forårsaker celledød eller som potensielt kan stimulere cellevekst. (B) 5-aminolevulinsyre (ALA) er en naturlig forløper i heme biosyntetiske vei, som involverer både mitokondrielle og cytosoliske cellulære rom. ALA-syntaseenzymaktiviteten reguleres av en negativ tilbakemeldingskontroll hvorved fri heme, sluttproduktet av denne banen, hemmer syntesen av ALA fra glycin og succinyl CoA. Administrasjonen av eksogent ALA eller dets derivat metylaminolevulinat (mALA) omgår det regulatoriske tilbakemeldingssystemet, slik at nedstrøms metabolitter, spesielt protoporfyrin IX (PpIX), akkumuleres i cellen som induserer fotosensibilisering. De hastighetsbegrensende egenskapene til ferrochelatase, katalysatorenzymet for jerninnsettingen i PpIX, fremmer akkumuleringen av denne endogene PS-forbindelsen. PBG = porfobilinogen. Denne figuren er modifisert fra Carrasco et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fotodynamisk behandling med mALA og rødt lys induserer forbigående produksjon av ROS i huden. (A) Akkumulering av endogen PpIX etter behandling med mALA-emne i rygghud. Venstre side i samme dyr ble brukt som kontroll. (B) Venstre panel: PpIX-avhengig ROS (mALA + Light) produksjon overvåket av DHF-DA. Høyre panel: tidsforløpsanalyse av relativ ROS-produksjon i bakhud; den relative integrerte tettheten av DHF-DA fluorescerende utslipp av mALA + lys versus lette regioner i hvert dyr ble kvantifisert på forskjellige tidspunkter etter bestråling og normalisert som beskrevet i metodikk. Gjennomsnittlig ± SE var representert (n = 4 for hvert tidspunkt). (C) Lokalisering av PpIX i halehud (fluorescensmikroskopibilder). (D) ROS-produksjon i halehud etter mALA+Light som avslørt av hET som viser en økt og vedvarende akkumulering i utbulingsområdet i hårsekken. Representative konfokalmikroskopibilder (maksimale projeksjoner) vises. Skala bar = 100 μm. Denne figuren er modifisert fra Carrasco et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påkobling av in situ ROS-produksjon i huden fremmer en signifikant økning av stamceller i buleområdet i hårsekknisjen. Venstre paneler: representative konfokale mikroskopibilder (maksimale projeksjoner) som viser lokaliseringen av BrdU-etikettholderceller (LRC) i musehalehud hele fester og den tydelige økningen av LRC i utbulningsområdet av hårsekkene 2 dager etter PpIX-baserte fotobehandlinger. Høyre panel: kvantifisering av antall LRC i hårsekken bule regionen. Gjennomsnittet + SE (n = 4) er representert. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er modifisert fra Carrasco et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påkobling av in situ ROS-produksjon i huden akselererer branntilheling. (A) PpIX-produksjon indusert av mALA i brannskadede områder i behandlede dyr sammenlignet med kontrollprøver. (B) Brenne helbredende evolusjon i mALA + Lysbehandlede og kontrolldyr. (C) Kvantifisering av tidsforløp av brente områder (venstre panel) som viser akselerert branntilheling hos mALA+Lysbehandlede dyr; gjennomsnittet + SE (n = 4) av uhelbredet område er representert. Areal-under-kurven-analyse (høyre panel) som viser statistiske forskjeller mellom begge tidsløpskurvene (p ≤ 0,06). Denne figuren er modifisert fra Carrasco et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påkobling av in situ ROS-produksjon i huden stimulerer hårveksten. (A) Øverste rad: Induksjon av hårvekst under den ildfaste telogenfasen av mALA + Light (høyre side av dorsalhud) sammenlignet med lyskontrollområdet (venstre side). Nederste rad: Både ROS-produksjonen i huden og akselerasjonen av hårvekst indusert av mALA + Light hemmes av askorbinsyre (AA) antioksidantbehandling. (B) Kvantifisering av % av dyr som viser akselerert hårvekst i mALA-PT sammenlignet med kontrollområdet i fravær eller tilstedeværelse av antioksidanten AA (n = 4 i 3 uavhengige eksperimenter). (C) Kvantifisering av ROS-produksjonshemming i dorsalhud indusert av AA under mALA-PT (n = 4). I alle tilfeller representerer stolper gjennomsnitt + SE. Denne figuren er modifisert fra Carrasco et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en metodikk som tillater en forbigående aktivering av endogen ROS-produksjon in vivo i musehud med fysiologiske effekter. Metodikken er basert på en fotodynamisk prosedyre for å indusere en kontrollert og lokal stimulering av det endogene fotosensibilisatoren PpIX (figur 1B). Denne eksperimentelle tilnærmingen er et interessant verktøy for å studere ROS-biologi i in vivo eksperimentelle systemer som utgjør et betydelig fremskritt i forhold til metoder ved bruk av eksterne ROS-kilder (vanligvis hydrogenperoksid) og tillater kontrollert og lokal produksjon av ROS i vev / prøve.
Gitt at aminolevulinatbaserte forløpere administreres i overskudd for å fremme akkumulering av PpIX inne i cellene, er et kritisk trinn i denne metoden etablering av en tilstrekkelig lysdose for å indusere forbigående produksjon av ROS-nivåer i vevet under skadegrensen, men viser en sterk stimulerende effekt. For tiden er det ingen tilgjengelige teknologier for direkte å kvantifisere den nøyaktige mengden av noen type ROS som produseres i celler og vev. I vår metodikk er det fortsatt ikke mulig å etablere en direkte sammenheng mellom en gitt lysdose, den eksakte mengden ROS produsert og en gitt biologisk effekt (f.eks. celledød eller celleproliferasjon). Av denne grunn bør lysdosen (fluens) for en bestemt eksperimentell modell etableres empirisk av forskeren ved hjelp av kvalitative eller semikvalitative parametere som er valgt for hver situasjon. Når det gjelder musehud, velger vi en lett målbar overgang mellom celledød og vevsskade og induksjon av en signifikant og forbigående proliferativ bølge.
Metoden som presenteres her har vist seg å være svært effektiv i forbedringen av hudregenerering i forskjellige prosesser, inkludert brannheling og hårsekkvekst. Disse observasjonene baner vei for implementering av terapeutiske anvendelser av denne teknologien i klinikker for behandling av tilfeldige eller kroniske brannsår og sår eller for forskjellige patologier hud og spesielt av hårsekken som involverer en defekt stamcellefunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle kommersielle anvendelser av prosedyrene beskrevet i dette arbeidet er beskyttet av et CSIC-UAM-patent (EP2932967A1) forfattet av EC, MIC og JE og lisensiert til Derma Innovate SL for kommersiell utnyttelse. JE og JJM har en rådgivende stilling i Derma Innovate SL.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt støttet av tilskudd fra Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 til JE) og Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 til JE) i Spania. EC har blitt støttet av Atracción de Talento Investigador grant 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid og UAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
