Summary
Her leverer vi protokoller til at udføre tre simple skade-induceret axon degeneration (axon død) analyser i Drosophila melanogaster at evaluere morfologiske og funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser.
Abstract
Axon degeneration er en fælles funktion i neurodegenerative sygdomme, og når nervesystemet er udfordret af mekaniske eller kemiske kræfter. Men vores forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for axondegeneration, er fortsat begrænset. Skade-induceret axon degeneration tjener som en simpel model til at studere, hvordan afhuggede axoner udføre deres egen demontering (axon død). I løbet af de seneste år er en evolutionært bevaret axon død signalering kaskade blevet identificeret fra fluer til pattedyr, som er nødvendig for den separerede axon at degenerere efter skade. Omvendt, svækket axon død signalering resulterer i morfologiske og funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser. Her præsenterer vi tre enkle og nyligt udviklede protokoller, der giver mulighed for observation af axonal morfologi, eller axonal og synaptisk funktion af afhuggede axoner, der er blevet afskåret fra den neuronale cellekroppen, i frugtfluen Drosophila. Morfologi kan observeres i vingen, hvor en delvis skade resulterer i axon død side om side af uskadte kontrol axoner inden for samme nerve bundt. Alternativt kan axonal morfologi også observeres i hjernen, hvor hele nervebundtet gennemgår øksedød udløst af antennal ablation. Funktionel bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser kan vurderes ved en simpel optogenetisk tilgang kombineret med en post-synaptisk grooming adfærd. Vi præsenterer eksempler ved hjælp af en highwire tab-of-funktion mutation og ved over-ekstyrer dnmnat, begge i stand til at forsinke axon død i uger til måneder. Det er vigtigt, at disse protokoller kan bruges ud over skade; de letter karakteriseringen af neuronal vedligeholdelse faktorer, axonal transport, og axonal mitokondrier.
Introduction
Den morfologiske integritet af neuroner er afgørende for vedvarende nervesystem funktion gennem hele livet. Langt størstedelen af det neuronale volumen tages af axoner1,2; således livslang vedligeholdelse af særligt lange axoner er en stor biologisk og bioenergisk udfordring for nervesystemet. Der er identificeret flere aksonale og glial-ydre støttemekanismer, der sikrer livslang aksonal overlevelse. Deres svækkelse resulterer i axon degeneration3, som er et fælles træk ved nervesystemet bliver udfordret i sygdom, og ved mekaniske eller kemiske kræfter4,5. De underliggende molekylære mekanismer for axondegeneration er dog stadig dårligt forstået i enhver sammenhæng, hvilket gør udviklingen af effektive behandlinger til at blokere axon tab udfordrende. Udviklingen af effektive behandlinger mod disse neurologiske tilstande er vigtig, da de skaber en enorm byrde i vores samfund6.
Skade-induceret axon degeneration tjener som en simpel model til at undersøge, hvordan afhuggede axoner udføre deres egen demontering. Opdaget af og opkaldt efter Augustus Waller i 1850, Wallerian degeneration (WD) er en paraply betegnelse, der omfatter to forskellige, molekylært adskillelige processer7. For det første, efter axonal skade, axoner adskilt fra deres celle organer aktivt udføre deres egen selvdestruktion (axon død) gennem en evolutionært bevaret axon død signalering kaskade inden for en dag efter skade8. For det andet, omkringliggende glia og specialiserede fagocytter engagere og rydde den resulterende axonal vragrester inden for tre til fem dage. Dæmpningen af axon dødssignalering resulterer i afhuggede axoner , der forbliver konserveret i uge9,10,11,12, mens dæmpningen af glial opgulfment kulminerer i axonal vragrester , der varer i ugevis in vivo13,14,15.
Forskning i fluer, mus, rotter og zebrafisk afslørede flere evolutionært bevarede og væsentlige mediatorer af axon død signalering8. Axon død mutanter indeholder afhuggede axoner og synapser, der undlader at gennemgå axon død; de forbliver morfologisk og funktionelt bevaret i ugevis, i mangel af cellekroppenstøtte9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Opdagelsen og karakteriseringen af disse mæglere førte til definitionen af en molekylær vej, der udfører axon død. Vigtigere er det, axon død signalering aktiveres ikke kun, når axon er skåret, knust eller strakt24,25; Det synes også at være en bidragyder i forskellige dyremodeller af neurologiske tilstande (f.eks. hvor axoner degenererer på en skadesuafhængig måde4, men med en række gavnlige resultater4,8). Derfor, forstå, hvordan axon død udfører axon degeneration efter skade kan tilbyde indsigt ud over en simpel skade model; Det kunne også være mål for terapeutisk intervention.
Frugtfluen Drosophila melanogaster (Drosophila) har vist sig at være et uvurderligt system til axon død signalering. Forskning i fluen afslørede fire væsentlige evolutionært bevarede axon død gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 og axundead (axed)12. Ændringen af disse mediatorer - tab-of-funktion mutationer af hiw, dsarm og øksede,og over-udtryk for dnmnat - potent blokerer axon død for levetiden af fluen. Mens afhuggede vilde type axoner gennemgå axon død inden for 1 dag, afhuggede axoner og deres synapser mangler hiw, dsarm eller økse forbliver ikke kun morfologisk, men også funktionelt bevaret i uger. Om funktionel konservering også kan opnås gennem høje niveauer af dnmnat, der skal bestemmes.
Her vil vi præsentere tre enkle og nyligt udviklede protokoller til at studere axon død (f.eks morfologi og funktion af afhuggede axoner og deres synapser over tid) i mangel af celle krop støtte. Vi viser, hvordan svækket axon død resulterer i afhuggede axoner, som er morfologisk bevaret med en hiw tab-of-funktion mutation (hiw▲N), og hvordan svækket axon død resulterer i afhuggede axoner og synapser, der forbliver funktionelt bevaret i mindst 7 dage med over-udtryk for dnmnat (dnmnatOE). Disse protokoller giver mulighed for observation af individuelle axonale og synaptiske morfologi enten i det centrale eller perifere nervesystem (CNS og PNS, henholdsvis)13,14, mens den funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser i CNS kan visualiseres ved brug af en simpel optogenetisk opsætning kombineret med grooming som en adfærdsmæssig udlæsning12.
Protocol
1. Observation af Axon Morfologi under Axon Død i PNS
- Vingeskade: delvis skade af axon bundter
- Brug 5 jomfruhunner og 5 hanner fra højre genotype(Figur 4A, P0 generation) til at udføre kors ved stuetemperatur (RT). Pass P0 i nye hætteglas hver 3-4 dage. Saml frisk lukket voksen afkom (F1 generation) dagligt og alder dem i 7-14 dage.
- Bedøve fluer på CO2 puder. Brug mikrosaks til at skære den anteriorske vingevene nogenlunde midt i vingen (Figur 1A). Brug den ene vinge til skaden og den anden fløj som en aldersmatchet uskadt kontrol. Påfør en skade pr. vinge, og sørg for at få tilstrækkeligt med vinger skadet (ca. 15 vinger).
BEMÆRK: Hele vingen kan skæres igennem, men det er tilstrækkeligt kun at skære den første vingevene. Dette er den stærkeste del af vingen. - Gendan fluerne i madholdige hætteglas.
- Vingedissektion og visualisering af axoner
- Spred 10 μL halocarbonolie 27 med en pipette langs et helt glasskred (Figur 1B).
- Skær den tilskadekomne, samt, den uskadte kontrol fløj på de ønskede tidspunkter (f.eks 1 eller 7 dage efter skade). Brug mikro saks til at skære, og pincet til at få fat i vingen. Monter maksimal 4 vinger i halocarbon olie 27 (Figur 1B) og dække dem med et dæksel dias.
- Billede vingen straks ved hjælp af en roterende disk mikroskop. Anskaf en række optiske sektioner langs z-aksen med 0,33 μm trinstørrelse, og z-stakke komprimeres i en enkelt fil til efterfølgende analyser.
BEMÆRK: Tag ikke fat i den foranderlige vinge, hvor cellelegemer og axoner er opstaldet. Tag vingen i midten. Vævet i vinger er ikke fast; holde tiden fra montering vinger til billeddannelse disse under 8 min.
Figur 1: Observation af axon morfologi under axon død i vingen. (A) Skematisk flyvevinge med to sparsomt GFP-mærkede sensoriske neuroner, som også er angivet separat nedenfor. Skadestedet og observationsområdet er angivet. (B) Skemasættende opsætning til vingebilleder. Tilskadekomne og uskadte kontrolvinger (grå) er monteret i halocarbonolie 27 (rød) på en glasrutsjebane (lyseblå) og dækket med et dækseldias (sort). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Observation af Axon og Synapse Morfologi under Axon Død i CNS
- Antennal ablation: skade af hele axon bundter
- Brug 5 jomfruhunner og 5 hanner fra højre genotype(Figur 5A, P0 generation) til at udføre kors på RT. Pass P0 i nye hætteglas hver 3-4 dage. Saml frisk lukket voksen afkom (F1 generation) dagligt og lad dem alder i 7 op til 14 dage.
- Bedøve fluer på CO2 puder. Brug pincet til at ablate højre 3rd antennal segment for ensidig ablation; eller både venstre og højre 3rd antennesegmenter for bilateral ablation (Figur 2A-C). Dette vil fjerne GFP-mærket neuronal celle organer, mens deres axonal fremskrivninger forbliver i CNS.
BEMÆRK: Antenneablation udskilles hele axonbundtet. Hvis der udføres ensidig ablation, fungerer axonbundtet på den kontralaterale side (den uopklarede antenne) som intern kontrol. Sørg for at udføre tilstrækkelige antenner ablations (ca. 15 dyr). - Gendan fluerne i madholdige hætteglas.
- Hjernedissektion og visualisering af axoner
- Bland silikoneelastomerbasen (9 ml) og hærdningsmiddel (1 ml) i et volumenforhold på 10:1. Overfør hver 5 ml blanding til en 35 mm vævskulturplade, og reducer luft, der indføres ved at blande med blid omrøring i røgemhætten natten over. Blandingen størkner inden for 24 timer.
BEMÆRK: Dissektionsplader må kun fremstilles én gang og må anvendes flere gange. - Bedøve fluer på CO2 puder og halshugge voksne hoveder ved hjælp af to pincet på de ønskede tidspunkter (f.eks 1 eller 7 dage efter antennel ablation). Brug en pincet til at gribe fat i halsen, og den anden pincet til at fastsætte brystkassen. Træk forsigtigt i nakken og hovedet af brystkassen.
BEMÆRK: Lad de halshuggede2 hoveder være på CO 2-puden, indtil det ønskede tal er nået, men sørg for at gå videre til næste trin inden for 30 minutter. - Alle hoveder overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder 1 ml fastgørelsesopløsning, der indeholder 4% paraformaldehyd (PFA) og 0,1% Triton X-100 i fosfatbufferet saltvand (PBS) ved hjælp af pincet, der er blevet dyppet i fastgørelsesopløsningen.
BEMÆRK: Fluehoveder sidder godt fast på våde pincet. Det gør det muligt let at overføre alle hoveder til mikrocentrifugerøret. - Sæt hovederne i 20 minutter med let omrøring ved RT. Sæt mikrocentrifugerøret på is, hovederne vil gravitere til bunden af mikrocentrifugerøret. Supernatanten fjernes med en pipette, og denne procedure gentages med fem 2 min vaske med 1 ml vaskebuffer indeholdende 0,1% Triton X-100 i PBS med forsigtig omrøring ved RT for at fjerne restfastgørelsesopløsningen.
BEMÆRK: Videoer om, hvordan man dissekere voksne Drosophila hjerner er let tilgængelige27. - Overfør hovederne med en glaspipette til en dissektionsplade fyldt med vaskebuffer. Brug en pincet til at få fat i og trække snabel fra hovedet, mens du holder hovedet med den anden pincet. Dette vil efterlade et hul var snabel var knyttet til exoskelet.
- Brug to pincet til at fjerne exoskelet mellem hullet og hver sammensatte øje. Dette vil gøre det muligt at åbne hovedet struktur med både pincet, og forsigtigt skrabe hjernen i.
- Rengør hver hjerne ved at fjerne luftrør eller fedt fast til det(Figur 2D, top). Når hjernen er rengjort, sætte det i en ny mikrocentrifuge rør, der indeholder 1 ml vaske buffer på is.
BEMÆRK: Beskadigede eller tabte optiske lapper vil ikke påvirke olfaktoriske lap i midten af hjernen(Figur 2D, top). - Udskift vaskebufferen med 1 ml fastgørelsesopløsning, når alle hjerner er opsamlet og akkumuleret i bunden af mikrocentrifugerøret. Fix hjerner i 10 min med vuggende på RT, efterfulgt af fem 2 min vasker i 1 ml vask buffer med vuggende på RT.
- Påfør primære antistoffer (1:500) i vaskebuffernatten med rokkende ved 4 °C, efterfulgt af 10 vaske over 2 timer ved hjælp af 1 ml vaskebuffer med rokkende ved RT.
- Påfør sekundære antistoffer (1:500) i vaskebuffer 2 timer med rokkende ved RT og wrap mikrocentrifuge rør i aluminiumsfolie til at blokere lys. Hold mikrocentrifugerøret dækket med aluminiumsfolie i resten af proceduren. Påfør ti vaske med 1 ml vaskebuffer over 2 timer med rokkende ved RT.
- Fjern supernatanten og brug en enkelt dråbe antifade reagens til at dække hjernen i mikrocentrifugerøret. Inkuber hjerner i mindst 30 minutter ved 4 °C, før de forberedes til montering og billeddannelse.
- Forbered et dæksel slide, stick lab tape på det, og skåret ud en "T"-lignende form fra båndet (Figur 2D, bund). Den resulterende plads fungerer som område, hvor hjerne-holdige antifade reagens28 vil blive pipetted i, helst i begge kamre.
BEMÆRK: Brug en 20-200 μL pipettespids, hvor 3 mm af spidsen er blevet afskåret for at udvide åbningen af pipetten. Dette vil gøre det muligt at pipette den hjerneholdige antifade reagens. Dæk forsigtigt hjernen med et dækseldias. - Brug ler til at forberede to små lige ruller. Sørg for, at lerrullerne ikke er højere end højden på et glasskred. Stik lerrullerne på glasrutsjebanen(Figur 2D, bund). Placer hjerne-holdige dække slide sandwich på lerruller.
BEMÆRK: GFP-mærkede axoner og deres synapser er placeret foran i hjernen. Det er derfor lettere at forestille sig dem forfra. Dog vil hjerner enten vende op, eller med billedsiden nedad på dækslet slide sandwich. Ler ruller tjene som sandwich indehavere, og under billedbehandling, kan sandwich vendes på hovedet. Dette vil gøre det muligt at erhverve billeder fra forsiden fra hver hjerne. - Anskaf en række optiske sektioner langs z-aksen med en trinstørrelse på 1,0 μm ved hjælp af et konfokalmikroskop, og der komprimeres z-stakke i en enkelt fil til efterfølgende analyser for at vurdere antallet af aksonale projektioner, der forbliver intakte.
- Bland silikoneelastomerbasen (9 ml) og hærdningsmiddel (1 ml) i et volumenforhold på 10:1. Overfør hver 5 ml blanding til en 35 mm vævskulturplade, og reducer luft, der indføres ved at blande med blid omrøring i røgemhætten natten over. Blandingen størkner inden for 24 timer.
Figur 2: Observation af axon og synapse morfologi under axon død i hjernen. (A) Sidevisning af et skematisk fluehoved med GFP-mærkede cellelegemer, axoner og synapser. (B)Høj forstørrelse front visning af GPF-mærket olfaktoriske receptor neuroner og deres axoner og synapser. Celleorganer er anbragt i 3rd antennal segment, og deres axoner projekt i CNS. Axoner danner synapser i en glomerulus i venstre olfaktoriske lap, krydse midterlinjen og danne synapser i glomerulus på den kontralaterale olfaktoriske lap. (C) Eksempler på fluehoveder med ensidig antenneablation. Top: Uskadt kontrol. Midt: Ablation af 3rd antennal segmentet. Bund: Ablation af 2nd (og dermed også 3rd) antennal segment. (D) Forberedelse af hjernen. Top: Skematisk dissekeret flyve hjerne med angivet olfaktoriske lapper og axonale fremskrivninger i synsfeltet. Bund: Skematisk opsætning til hjernebilleddannelse. To lerruller (grøn) er monteret på en glasrutsjebane (lyseblå), de bærer en coverslide sandwich, som indeholder fluehjerner (grå). Hjerner er monteret i antifade reagens (lilla), omgivet af en lab tape (orange), og dækket af to dækdias (sort). Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Grooming Induceret af Optogenetics som en udlæsning for Axon og Synapse Funktion
- Optogenetisk opsætning
- Udfør det optogenetiske eksperiment i et mørkt rum. Sørg for, at opsætningen består af en 850 nm infrarød (IR) LED spotlight til at belyse fluer i mørke (Figur 3A), en blinkende 660 nm rød LED spotlight til at aktivere neuroner udtrykke CsChrimson, og en monokrom kamera med en 700 nm longpass filter, som forhindrer optagelse af rødt lys blinker.
- Brug en 3D-printer til at generere et lille cirkulært adfærdskammer med en diameter på 1 cm, dække det med et dæksel, og placer en 860 nm-udleder, der er koblet til det røde LED-spotlight ved siden af kammeret (Figur 3B).
BEMÆRK: Emitteren angiver, hvornår det røde LED-spotlight er tændt, hvorved neuronerne aktiveres. - Monter LED-spotlights og kameraet oven på kammeret (Figur 3A, C).
- Aktiver neuroner med 10 Hz blinker i løbet af 10 s. Aktiveringens varighed kan justeres i henhold til forsøgsdesignet.
- Forberedelse af fluer til optogenetik
- Smelt fluemad i en mikrobølgeovn. Efter at maden er kølet ned, før størkning, tilsættes 1:100 af 20 mM alle trans-retinale i ethanol (EtOH) til en endelig koncentration på 200 μM. Bland godt, og hæld straks maden i tomme hætteglas.
BEMÆRK: Undgå at tilføje alle trans-retinal til varm mad, kan dette resultere i mindre effektive optogenetics. - Dæk hætteglas, der indeholder størknet mad med stik eller vatkugler. Wrap hætteglas med aluminiumsfolie. Opbevar derefter de madholdige hætteglas i et mørkt, koldt rum.
- Brug 5 jomfruhunner og 5 hanner (Figur 6A, generation P0) fra højre genotype til at udføre kors på RT. Pass P0 i nye hætteglas hver 3-4 dag. Saml frisklukket voksenafkom (generation F1)på en daglig base, og lad dem ældes i 7 op til 14 dage i aluminiumsdækkede hætteglas, der indeholder 200 μM alle trans-nethinde i fluefoder.
- Saml fluer ved at tappe dem fra madholdige hætteglas til et tomt hætteglas uden mad. Afkøles hætteglasset ned i isholdigt vand i ca. 30 s. Fluer falder i søvn. Sæt individuelle fluer hurtigt ind i små kamre dækket med et dækseldias (Figur 3B).
BEMÆRK: Så snart fluer varme op, de vågner op. Det er afgørende hurtigt at sprede individuelle fluer i enkelte kamre hver. Undgå CO2 puder til at bedøve fluer, vil dette påvirke deres adfærd. - Udfør optogenetik at fremkalde antennal grooming. Her består protokollen af følgende intervaller: 30 s, hvor det røde lys er fraværende, efterfulgt af 10 s af rødt lys eksponering på 10 Hz. Gentag denne procedure tre gange i alt, efterfulgt af en yderligere 30 s interval, hvor det røde lys er fraværende12,29,30.
BEMÆRK: Denne protokol kan justeres efter den eksperimentelle præference. - Saml individuelle fluer fra hvert kammer på CO2 puder. Udsætte dem for antenner skade. Ablate både venstre og højre2 nd antennal segmenter (Figur 2C). Dette vil fjerne celleligene af Johnstons orgel (JO) neuroner, mens de aksonale fremskrivninger forbliver i CNS. Efterdan fluerne i aluminiumsbeklædte hætteglas indeholdende 200 μM alle trans-retinale.
BEMÆRK: For antennal grooming induceret af optogenetics, den sensoriske neuron celle organer er anbragt i 2nd antennal segment (Figur 2C). - På tilsvarende tidspunkter (f.eks. 7 dages postantenneablation) skal der være fluer til en anden grooming-analyse (gå tilbage til trin 3.2.4).
- Smelt fluemad i en mikrobølgeovn. Efter at maden er kølet ned, før størkning, tilsættes 1:100 af 20 mM alle trans-retinale i ethanol (EtOH) til en endelig koncentration på 200 μM. Bland godt, og hæld straks maden i tomme hætteglas.
Figur 3: Optogenetisk opsætning for at fremkalde grooming som en udlæsning for axon og synapse funktion. (A) Illustration af samlede komponenter, der kræves til optogenetik. Infrarødt (IR) LED-spotlight, kamera og rødt LED-spotlight (fra henholdsvis venstre mod højre). Komponenterne, herunder en detaljeret beskrivelse , er angivet i materialetabellen. (B) Illustration i topvisning af et adfærdskammer, herunder en Infrarød emitter, der angiver aktivering af rødt LED-spotlight. (C) Illustration af en enkelt monteringsopsætning. Der kræves i alt tre monteringsopsætninger til henholdsvis de to LED-spotlights og kameraet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Ovenfor, Vi beskrev tre metoder til at studere morfologi og funktion af afhuggede axoner og deres synapser. Den første metode giver mulighed for observation af individuelle axoner i PNS i høj opløsning. Det kræver kloner genereret af MARCM teknik14,31. Her udførte vi kors for at generere vilde type og highwire mutant MARCM kloner (Figur 4A). Et simpelt snit i midten af vingen inducerer axon skade af neuroner opstaldet distale (f.eks på den ydre side af vingen), mens proksimale neuroner (f.eks mellem afskæringstedet og brystkassen) forbliver uskadt. Denne fremgangsmåde gør det muligt at observere axon død side om side af uskadte kontrol axoner i samme nerve bundt (Figur 1A, Figur 4B). Her brugte vi en genetisk baggrund, der resulterede i et lavt antal GFP-mærkede kloner (f.eks. to i hvert eksperiment14). Vi præsenterer eksempler på 1 og 7 dage efter skade af vilde type axoner, at give eksempler på kontrol axoner, axoner under døden axon død, og axonal fragmenter bliver ryddet af omkringliggende Glia, henholdsvis. Derudover gentog vi axonal skade i highwire mutanter, hvor vi analyserede resultatet 7 dage efter skade.
Uskadte kontrolvinger huser to vilde kloner, således to GFP-mærket wild-type axoner (Figur 4B, vilde type, uskadt kontrol). En dag efter at skære midten af vingen ved hjælp af mikro saks, axon død er induceret i GFP-mærket axoner, hvor celleorganer er distale til afskårne stedet, mens axoner fra proximally opstaldet celle organer tjene som en intern kontrol inden for samme nerve bundt (Figur 4B, vilde type, 1 dag efter skade). Bemærk axonal rester spor i den øverste del angivet med pilen. 7 dage efter axonal skade, GFP-mærket axonal vragrester er ryddet af omkringliggende glia, mens GFP mærket uskadt kontrol axoner forblive i nerve bundt(Figur 4B, vilde type, 7 dage efter skade, pil). I modsætning hertil forbliver highwire mutant axoner, der er blevet afskåret i 7 dage morfologisk bevaret, i overensstemmelse med tidligere resultater11,14 (Figur 4B, highwire, 7 dage efter skade, pil). Disse resultater viser den kraftfulde visuelle opløsning af Drosophila fløj. Axon død kan observeres side om side af uskadtkontrol i samme nerve bundt. Mens vilde axoner gennemgår axondød inden for 1 dag efter skade, og det highwire resulterende snavs ryddes inden for 7 dage, forbliver axondødsmangelfuldhighwire-mutanter morfologisk bevaret i 7 dage.
Figur 4: Tilgang til at studere axon død af GFP-mærket sensoriskneuron axoner i vingen. (A) Skematisk krydser for at generere vilde type og highwire kloner i vingen (P0 og F1 generation, henholdsvis). Jomfru hunner er til venstre, hanner til højre. Se Materialetabel for genotypedetaljer. (B) Eksempler på kontrol og tilskadekomne GFP-mærkede axoner. Synsfeltet er angivet i (Figur 1A). Fra venstre mod højre: uskadte vilde type kontrol axoner, vilde type axoner 1-dages efter skade, vilde type axoner 7 dage efter skade, highwire mutant axoner 7 dage efter skade, henholdsvis. Pile angiver afhuggede axoner, Scale bar = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den anden metode beskriver, hvordan man visualisere hele axon bundter projicere ind i CNS, hvor de danner synapser, som hører til neuroner til huse i både venstre og højre antenner (Figur 2A-C). Her udførte vi kors for at generere vilde type og highwire mutant MARCM kloner (Figur 5A). Uskadt, GFP-mærket axoner og deres synapser kan visualiseres i løbet af dage til uger, i mangel af skade(Figur 5B, Wild type, uskadt kontrol). Alternativt kan dyr udsættes for 3rd antennal segment ablation, og afhuggede GFP-mærket axoner og deres synapser kan observeres i løbet af et tidsforløb over timer til dage. Vi fokuserede på 7 dage efter antennal ablation, fordi på dette tidspunkt, axoner og deres synapser har gennemgået axon død, og deraf følgende vragrester er ryddet af omkringliggende glia. Hvis ensidig ablation af højre antenne udføres, så højre axon bundt er afskåret og vil adskille og den resulterende snavs er helt ryddet 7 dage efter skade(Figur 5B, vilde type, ensidig ablation, 7 dage efter skade, pile), i overensstemmelse med tidligere resultater13. Alternativt kan både højre og venstre antenner ablates, som vil bryde både axon bundter, og 7 dage efter skade, axoner og deres synapser forsvandt(Figur 5B, vilde type, bilaterale ablation, 7 dage efter skade, pil). I modsætning hertil resulterer ensidig ablation af højre antenner i highwire mutanter i afhuggede axoner, der forbliver bevaret 7 dage efter skade, i overensstemmelse med tidligere resultater11,14 (Figur 5B, highwire, ensidig ablation, 7 dage efter skade, pil). Disse resultater viser, at afhuggede vilde-type axoner gennemgår axon død og den resulterende snavs er ryddet inden for 7 dage, mens axon død mangelfuld highwire mutanter undlader at gennemgå axon død og forblive morfologisk bevaret i 7 dage.
Figur 5: Tilgang til at studere axon død af GFP-mærket sensoriskneuron axoner i hjernen. (A) Skematisk krydser for at generere vilde type og highwire kloner i hjernen (P0 og F1 generation, henholdsvis). Jomfru hunner er til venstre, hanner til højre. Se Materialetabel for genotypedetaljer. (B) Eksempler på kontrol og tilskadekomne GFP-mærkede axoner. Fra venstre mod højre: uskadte vilde type kontrol, vilde type 7 dage post ensidig antennel ablation, vilde type 7 dage post bilaterale antennel ablation, og highwire mutanter 7 dage efter ensidige antennal ablation, henholdsvis. Pile angiver afhuggede axon bundter, Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den tredje metode gør det muligt at observere funktionel konservering af afhuggede axoner og deres synapser i CNS. Den er afhængig af manipulation af en delmængde af JO neuroner til huse i 2nd antennal segment, som er tilstrækkelige til at fremkalde antennal grooming. Udtryk for en rød-flyttet channelrhodopsin (CsChrimson) i JO neuroner, kombineret med kosttilskud af alle trans-retinale, er tilstrækkelig til at fremkalde en simpel post-synaptisk grooming adfærd ved rødt lys eksponering12,30. Her udførte vi kors for at generere vilde type JO neuroner, og JO neuroner over-ekspresning dnmnat (dnmnatOE) (Figur 6A). Vilde type fluer eller fluer, der indeholder JO neuroner med svækket axon død (dnmnatOE), begge havnen en potent grooming adfærd før skade. Men 7 dage efter skade (f.eks bilaterale ablation af 2nd antennal segment), grooming undlader at blive fremkaldt af optogenetics i vilde type fluer på grund af skade-induceret axon og synapse degeneration, mens dyr med svækket axon død fortsætte med at soignere (Figur 6B, Movie 1,2). Svækket axon død er derfor i stand til funktionelt at bevare afhuggede axoner og deres synapser i 7 dage.
Figur 6: Fremgangsmåde til visualisering af aksonal og synaptisk funktion efter axotomy. (A) Schematic krydser for at generere vilde type og dnmnat over-ekspresning JO sensoriske neuroner (P0 og F1 generation, henholdsvis). Jomfru hunner er til venstre, hanner til højre. Se Materialetabel for genotypedetaljer. (B) Individuelle ettogrammer af grooming adfærd induceret af optogenetics. Top: individuelle etogrammer af vild type flyver før og 7 dage efter skade (blå). Bund: individuelle etogrammer af fluer over-ekspresning dnmnat (dnmnatOE) i JO neuroner før og 7 dage efter skade (rød). Hver placering angiver mindst 1 plejeadfærd inden for 1 s. Den sorte linje angiver summen af alle placeringer. (C) Kvantificering af grooming adfærd. Data vises som gennemsnitlig ± standardafvigelse, p > 0,001 (envejs ANOVA, multipel sammenligning med Tukey's post hoc-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Repræsentant vilde type grooming adfærd fremkaldt af optogenetics før og 7 dage efter antennal ablation. Klik her for at downloade denne video.
Movie 2: Repræsentant grooming adfærd fremkaldt af optogenetics i fluer over-ekspresning dnmnat i JO neuroner før og 7 dage efter antennal ablation. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
De protokoller, der er beskrevet her, giver mulighed for en robust og reproducerbar observation af morfologi samt funktionen af axoner og deres synapser adskilt fra deres cellelegemer i Drosophila. Vingeanalysen gør det lettere at observatione axondød side om side af uskadte kontrolaksoner i PNS14, mens antennal-analysen gør det lettere at observatione hele nervebundter af GFP-mærkede axoner og deres synapser for at vurdere både morfologi og funktion i hjernen (CNS)12. Der er kritiske skridt og visse fordele for hver tilgang til at studere morfologi, der skal tages i betragtning, når designe eksperimenter.
For at observere axon morfologi i PNS i vingen, kan eksperimenter let udføres, på grund af gennemsigtigheden af vingen: det gør det muligt at omgå dissektion og immunhistokemi. Men på grund af den manglende fiksering skal vingerne afbildes umiddelbart efter montering14. I øjeblikket anvendes der ofte to forskellige Gal4-drivere, enten ok371Gal4 eller dpr1Gal4, og begge referencer tilbyder forskellige tilgange til kvantificering af degeneration14,26. Sparse mærkning af et par neuroner anbefales, ved hjælp af "Mosaic Analyse med en repressible Cell Marker (MARCM)"14,31, som opløsningen af axonal morfologi er uden fortilfælde. I modsætning hertil er observation af synapser ikke muligt i vinger, de er placeret i ventrale nerveledning inde i brystkassen af fluerne. Desuden kan yderligere axonale markører ikke visualiseres ved immunhistokemi: den voksagtige kutikel gør det umuligt for diffusion af fiksatorer og antistoffer i det underliggende væv.
For at observere axon og synapse morfologi i CNS, hjerne dissektioner skal udføres. De giver den fordel at visualisere yderligere axonale og synaptiske markører ved hjælp af immunhistokemi, og synapser kan observeres sammen med axoner i samme synsfelt10,13. En stor samling af karakteriseret olfaktoriske receptor neuron (ORN) Gal4 drivere er let tilgængelige32, og ofte, OR22aGal4 er føreren af valg. For antenneablation er cellekroppe af OR22a neuroner anbragt i 3rd segmentet (Figur 2B). Der anvendes en fluorescensintensitetsbaseret kvantificering til kvantificering af degenerationen af enten axoner eller synapser13. Omvendt, eksperimenter er tidskrævende på grund af hjernendissektion og antistof farvning.
At visualisere axonal og synaptisk funktion efter axotomy, optogenetics bruges til at udløse antennal grooming: det tjener som en udlæsning for funktionel bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser12. Plejekredsløbet og de tilhørende sensoriske, inter- og motorneurongal4-førere er blevet grundigt beskrevet29,,30. GMR60E02Gal4 etiketter en delmængde af Johnston's orgel (JO) sensoriske neuroner, som er nødvendige og tilstrækkelige til grooming29,30. For antenneablation er cellekroppe af JO neuroner anbragt i detandet antennesegment (Figur 2B). En optogenetisk opsætning kan let bygges fra bunden, eller en eksisterende opsætning justeret. Det er vigtigt, at eksperimenter skal udføres i et mørkt rum, og flyver således visualiseret med en infrarød (IR) LED spotlight. Når du bruger CsChrimson som en kanal, er det afgørende at forsyne maden med alle trans-retinale og en rød LED spotlight for at aktivere JO neuroner29. Alternativt kan blå lysfølsomme kanaler og et blåt LED-spotlight eller TrpA1-kanalen og -temperaturen bruges til neuronal aktivering29,33. Kvantificeringen af grooming adfærd er allerede blevet beskrevet12,29.
Når disse analyser anvendes til specifikt at studere axon død, er det vigtigt at bemærke, at fænotypen af morfologisk eller funktionel konservering bør være robust over tid. Der er tilfælde, hvor axon død fører til en konsekvent endnu mindre udtalt fænotype i morfologisk konservering34,35, og om en sådan fænotype udmønter sig i funktionel konservering er endnu ikke fastlagt.
Axon død fænotyper er også blevet observeret i neuroner under udviklingen af Drosophila larver, hvor nerver blev knust i stedet for såret11,23. Her fokuserede vi specifikt på voksne Drosophila neuroner, som afsluttede udviklingen. I denne sammenhæng kan brugen af RNA-interferens36eller vævsspecifik CRISPR/Cas937 let implementeres. Vigtigere er det, kan ovennævnte teknikker anvendes i en axon død uafhængig sammenhæng: de letter karakterisering af neuronal vedligeholdelse faktorer38, axonal transport39, aldersafhængige axonal mitokondrier ændringer40, og morfologi af axonal mitokondrier41.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke hele Neukomm lab for bidrag. Dette arbejde blev støttet af en swiss National Science Foundation (SNSF) adjunktpris (tilskud 176855), Den Internationale Fond for Forskning i Paraplegi (IRP, tilskud P180), SNSF Spark (tilskud 190919) og af støtte fra Universitetet i Lausanne og Institut for Grundlæggende Neurovidenskab (État de Vaud) til LJN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
| MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
| 35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
| High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
| Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
| 850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
| T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
| 150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
| Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
| Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
| M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
| USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
| 20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
| IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
| cable | - | - | Misc |
| All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
| Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Mowiol | Merk | 81381 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
| Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
| FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
| FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
| hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
| hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
| tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
| w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
| 20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
| 5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
| 5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
| 5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
| ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
| CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
| dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
| OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
| ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
| GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
| TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |
References
- Matsuda, W., et al. Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Wedel, M. J. A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs. Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).
- Mariano, V., Domínguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons. Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).
- Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).
- Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).
- Gustavsson, A., et al. Cost of disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).
- Rosell, A. L., Neukomm, L. J. Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease. Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).
- Mack, T. G., et al. Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene. Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).
- Osterloh, J. M., et al. dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway. Science. 337 (6093), New York, NY. 481-484 (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).
- Neukomm, L. J., et al. Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly. Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
- Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nature Communications. 8, 14355 (2017).
- Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve. The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).
- Adalbert, R., et al. A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses. The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).
- Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137 (23), Cambridge, England. 3985-3994 (2010).
- Feng, Y., et al. Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish. Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).
- Gilley, J., Coleman, M. P. Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons. PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).
- Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction. Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).
- Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions. The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).
- Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction. Science. 348 (6233), New York, NY. 453-457 (2015).
- Bridge, P. M., et al. Nerve crush injuries--a model for axonotmesis. Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).
- Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis. Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).
- Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection. , Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2015).
- Cold Spring Harbor. Mowiol mounting medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. eLife. 3, 02951 (2014).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. eLife. 4, 08758 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102 (2), 147-159 (2000).
- Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila. eLife. 6, (2017).
- Farley, J. E., et al. Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).
- Wang, H., et al. Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration. Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. bioRxiv. 102, 636076 (2019).
- Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).
- Vagnoni, A., Bullock, S. L. A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons. Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).
- Cao, X., et al. In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging. Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).
- Smith, G. A., et al. Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation. Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).
