यहां हम चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके जगह वरीयता प्रतिमान के लिए दो आसान-से-टू-स्टेप प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इन दो अलग-अलग सेटअप का उपयोग करना, वरीयता और परिहार व्यवहार को उच्च स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता के साथ एक ही उपकरण के भीतर और सीधे तरीके से ठोस रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।
यह समझना कि न्यूरोनल सक्रियण विशिष्ट व्यवहार उत्पादन की ओर कैसे जाता है, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान के लिए मौलिक है। मान्य प्रतिमान में व्यवहार परीक्षण के साथ कृंतक में ऑप्टोजेनेटिक्स का संयोजन उच्च स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता के साथ वास्तविक समय में अलग न्यूरॉन्स की उत्तेजना पर व्यवहार परिणामों की माप की अनुमति देता है, और इस प्रकार की स्थापना न्यूरोनल सक्रियण और व्यवहार के बीच कारण संबंध। यहां, हम एक वास्तविक समय स्थान वरीयता (आरटी-पीपी) प्रतिमान, शास्त्रीय वातानुकूलित स्थान वरीयता (सीपीपी) परीक्षण का एक संशोधित संस्करण के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। आरटी-पीपी एक तीन डिब्बे तंत्र में किया जाता है और अगर एक विशिष्ट तंत्रिका आबादी के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना पुरस्कृत या प्रतिकूल है जवाब देने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हम आरटी-पीपी प्रोटोकॉल के एक वैकल्पिक संस्करण, तथाकथित तटस्थ कंपार्टमेंट वरीयता (एनसीपी) प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग घृणा की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। दो दृष्टिकोण व्यवहार फार्माकोलॉजी से उत्पन्न शास्त्रीय पद्धति के विस्तार और तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र के भीतर ऑप्टोजेनेटिक्स के हालिया कार्यान्वयन पर आधारित हैं। वास्तविक समय में जगह वरीयता को मापने के अलावा, ये सेटअप वातानुकूलित व्यवहार के बारे में भी जानकारी दे सकते हैं। हम अपने डेटा के उदाहरणों के साथ आसानी से अनुवर्ती कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और इस प्रकार के प्रयोगों को लागू करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं पर चर्चा करते हैं।
ऑप्टोजेनेटिक्स का कार्यान्वयन, एक आधुनिक तंत्रिका विज्ञान प्रयोगात्मक उपकरण जिसमें तंत्रिका गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश का उपयोग किया जाता है, ने हाल के वर्षों में यह समझने में प्रमुख प्रगति की है कि विशिष्ट न्यूरोनल आबादी व्यवहार1,2,3को कैसे प्रभावित करती है। ऑप्टोजेनेटिक्स की उत्कृष्ट स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता ब्याज और व्यवहार उत्पादन2,3के कोशिका समूहों के उत्तेजना या अवरोध के बीच कारण संबंधों की स्थापना की अनुमति देती है । ऑप्टोजेनेटिक्स में स्थानिक चयनात्मकता आमतौर पर क्रे-लोक्स सिस्टम के माध्यम से सुनिश्चित की जाती है जिसमें क्रे रीकॉम्बिनेज की गतिविधि लोक्स साइटों के बीच मौजूद किसी भी डीएनए दृश्यों का पुनर्संयोजन करती है, जिसे फ्लोक्सेड एलील्स (लोक्स साइटों द्वारा flanked)4कहा जाता है। ऑप्टोजेनेटिक्स में क्रे-लोक्स सिस्टम का उपयोग करने के साथ लक्ष्य अभिव्यक्ति से रहित आसपास के न्यूरॉन्स को छोड़ते हुए ब्याज के विशिष्ट न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक ऑप्सिन एन्कोडिंग एलोडिंग एलोडिंग की अभिव्यक्ति प्राप्त करना है। ऑप्सिन हल्के-संवेदनशील प्रोटीन होते हैं जो विशिष्ट तरंग-लंबाई के प्रकाश-उत्तेजना पर आयन प्रवाह की अनुमति देते हैं जो तंत्रिका उत्तेजना को प्रभावित करता है या डाउनस्ट्रीम प्रभावक रास्तों को मॉड्यूल करके सेलुलर कार्यों को प्रभावित करता है। ऑप्सिन के उपन्यास वेरिएंट जो कार्रवाई (उत्तेजक, निरोधात्मक, मॉड्यूलरी), तंत्र, प्रकाश तरंगदैर्ध्य और गतिज गुणों द्वारा सक्रियता में भिन्न होतेहैं, 5 को विशिष्ट प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की जरूरतों को पूरा करने के लिए लगातार विकसित किया जा रहा है। उत्तेजना के बारे में, एक ध्रुवीकरण या हाइपरपोलारीकरण ऑप्सिन का उपयोग मस्तिष्क3में वितरित एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश उत्तेजना पर न्यूरॉन्स (क्रमशः उत्तेजना या अवरोध) की गतिविधि तय करता है।
चयनात्मक प्रमोटर गतिविधि क्रे की अभिव्यक्ति को ब्याज के न्यूरॉन्स को पुनः संयोजन का निर्देश देती है। ब्याज के ऑप्सिन के एक floxed एलील को लागू करके, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन यह सुनिश्चित करेगा कि ऑप्सिन को चुनिंदा न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाए जो सह-एक्सप्रेस क्रे रिकॉम्बिनेज़3,6। स्थानिक चयनात्मकता के लिए डबल ट्रांसजेनिक्स का यह उपयोग ऑप्टोजेनेटिक्स में बहुत कुशल साबित हुआ है। इस प्रकार, जबकि ऑप्टिन को सक्रिय करने के लिए प्रकाश-उत्तेजना मोटे तौर पर एक प्रकाश स्रोत (एलईडी या लेजर)3से जुड़े एक इंट्राट्रेब्रोरैली प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर के माध्यम से वितरित की जाती है, केवल न्यूरॉन्स क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन एलील दोनों को व्यक्त करते हैं, इस उत्तेजना का जवाब देंगे। कृंतक में क्रे-लोक्स सिस्टम को केवल ट्रांसजेनिक्स (क्रे रिकॉम्बिनेज और फ्लोक्सेड ऑप्सिन बिल्डिंग दोनों ट्रांसजेनिक जानवरों में इनकोडेड हैं) का उपयोग करके विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, केवल वायरल इंजेक्शन (क्रे रिकॉम्बिनेज और फ्लोक्सेड ऑप्सिन के लिए डीएनए निर्माण दोनों वायरल वाहक के माध्यम से वितरित किए जाते हैं), या दोनों का संयोजन (उदाहरण के लिए, क्रे रीकॉम्बिनेज को ट्रांसजेनिक जानवर द्वारा एन्कोड किया जाता है जिसे फ्लोक्स्ड ऑप्सिन निर्माण ले जाने वाले वायरस के साथ इंजेक्ट किया जाता है)5। floxed ऑप्सिन डीएनए निर्माण आमतौर पर एक रिपोर्टर जीन के साथ फ्रेम में क्लोन किया जाता है ताकि ऊतक वर्गों में क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के दृश्य को सक्षम किया जा सके। जबकि चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स भी किया जा सकता है, चूहों के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल उत्पन्न किए गए हैं। सादगी के लिए, क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन दोनों को ले जाने वाले चूहों को “ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों” के रूप में जाना जाएगा। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में, ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों को मिश्रित ट्रांसजेनिक (क्रे दो अलग-अलग प्रमोटरों के नियंत्रण में क्रे पुनर्संयोजन) और वायरल (एक एडेनो-संबद्ध वायरस, एएवी का उपयोग करके, फ्लोक्सेड ऑप्सिन डीएनए निर्माण देने के लिए उत्पन्न किया गया है – हमारे मामले में ChR2/H134R) दृष्टिकोण। ट्रांसजेनिक माउस लाइनों को प्राप्त करना और बनाए रखना कार्यप्रणाली का एक अनिवार्य हिस्सा है। क्रे-ड्राइवर और फ्लोक्स्ड ऑप्सिन ट्रांसजेनिक चूहों को प्रत्येक उद्देश्य के लिए उत्पादित किया जा सकता है, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होने पर खरीदा जा सकता है, जैसा कि डीएनए दृश्यों को ले जाने वाले वायरस की एक श्रृंखला क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन को विभिन्न रूपों में एन्कोडिंग कर सकती है।
व्यवहार परीक्षण के साथ मिलकर ऑप्टोजेनेटिक्स विशेष प्रकार के व्यवहार में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों, या असतत न्यूरोनल आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हुआ है। इनाम से संबंधित व्यवहार के संदर्भ में, ऑप्टोजेनेटिक्स ने व्यवहार फार्माकोलॉजी और प्रायोगिक मनोविज्ञान के क्षेत्र में पिछले निष्कर्षों के सत्यापन को सक्षम किया है, और कुछ न्यूरॉन्स व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं, इसमें स्थानिक-अस्थायी प्रासंगिक विच्छेदन के एक नए स्तर की अनुमति भी दी है। एक विधि जिसका उपयोग इनाम से संबंधित व्यवहार का आकलन करने के लिए कई अध्ययनों में किया गया है, शास्त्रीय विधि का एक संशोधित संस्करण है जिसे वातानुकूलित प्लेस प्रिफरेंस (सीपीपी) के रूप में जाना जाता है। शास्त्रीय सीपीपी का उपयोग7,8 पर्यावरण के संकेतों के साथ पावलोवियन संघों को प्रेरित करने की क्षमता के माध्यम से दुर्व्यवहार की दवाओं के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों का आकलन करने के लिए किया गयाहै। पावलोवियन शब्दों में, दवा एक अशर्त उत्तेजना है क्योंकि यह क्रमशः पुरस्कृत या प्रतिकूल होने पर दृष्टिकोण या वापसी प्राप्त कर सकती है। विभिन्न तटस्थ उत्तेजनाओं के साथ दवा की निरंतर बांधना, कि खुद को किसी भी प्रतिक्रिया प्रकाश में नहीं आती है, केवल पहले तटस्थ की प्रस्तुति पर दृष्टिकोण या वापसी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन बांधना के बाद, इसलिए वातानुकूलित उत्तेजनाओं 9कहा जाता है । सीपीपी विश्लेषण आमतौर पर एक ही आकार के दो डिब्बों वाले उपकरण में किया जाता है, लेकिन जहां प्रत्येक डिब्बे को अलग विशेषताओं द्वारा परिभाषित किया जाता है, जैसे फर्श बनावट, दीवार पैटर्न और रोशनी (तटस्थ उत्तेजनाएं)। दोनों डिब्बे या तो गलियारे से जुड़े होते हैं या डिब्बों के बीच खुलने से । कंडीशनिंग के दौरान, विषय, आमतौर पर एक छोटा कृंतक, एक दवा के निष्क्रिय इंजेक्शन प्राप्त करता है, जबकि दो मुख्य डिब्बों में से एक तक ही सीमित है और खारा जबकि दूसरे डिब्बे तक ही सीमित है । दवा के पुरस्कृत प्रभावों को बाद में दवा मुक्त सत्र में मूल्यांकन किया जाता है जब विषय को स्वतंत्र रूप से पूरे उपकरण का पता लगाने की अनुमति दी जाती है। पहले दवा-बनती डिब्बे (वातानुकूलित प्रतिक्रिया) में बिताए गए समय की मात्रा को दवा के पुरस्कृत प्रभावों और इसके प्रशासन(वातानुकूलित उत्तेजनाओं) से जुड़े डिब्बे के संकेतों के बीच मध्यस्थता करने वाले पावलोवियन सीखने के तंत्र को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है। यदि जानवर दवा-जोड़ी डिब्बे में अधिक समय बिताता है, तो दवा ने एक वातानुकूलित स्थान वरीयता को प्रेरित किया है जिसका अर्थ है कि इसका व्यवहार पर पुरस्कृत प्रभाव पड़ता है। दूसरी ओर, यदि दवा को प्रतिकूल माना जाता है, तो जानवर दवा-जोड़ी वाले डिब्बे से बच जाएगा और खारा-जोड़ी वाले डिब्बे में अधिक समय बिताएगा, जो वातानुकूलित स्थान घृणा (सीपीए)8,9,10,11का संकेत देगा।
चूंकि ऑप्टोजेनेटिक्स को “वास्तविक समय” में न्यूरोनल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए लागू किया जा सकता है, इसलिए समान व्यवहार प्रतिमान का उपयोग, लेकिन अलग से, सीपीपी सेटअप प्रत्यक्ष न्यूरोनल सक्रियण पर जगह वरीयता की माप के लिए अनुमति देता है। इसलिए स्थान वरीयता के ऑप्टोजेनेटिक्स-संचालित विश्लेषण को अक्सर वास्तविक समय की जगह वरीयता (आरटी-पीपी) विश्लेषण प्रतिमान के रूप में जाना जाता है। आरटी-पीपी प्रतिमान में, क्रे-लोक्स प्रणाली के माध्यम से अलग न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना शास्त्रीय सीपीपी में प्रदर्शन की गई दवा की प्रणालीगत डिलीवरी की जगह ले जाती है, ताकि आरटी-पीपी प्रतिमान के बजाय उपाय करें यदि ऑप्टोजेनेटिकली प्रेरित न्यूरोनल उत्तेजना है पुरस्कृत या प्रतिकूल के रूप में माना जाता है। वर्तमान विवरण ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों पर ध्यान केंद्रित करेगा, लेकिन समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों का परीक्षण भी किया जा सकता है।
शास्त्रीय सीपीपी प्रतिमान के रूप में एक समय में एक डिब्बे में कंडीशनिंग के बजाय, आरटी-पीपी प्रतिमान में ऑप्टोजेनेटिक्स माउस को पूरे तंत्र में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति है और व्यवहार पूरे सत्र में दर्ज किया जाता है। डिब्बों में से एक में प्रवेश इंट्राक्रैनियल प्रकाश उत्तेजना के साथ जोड़ा जाता है। उचित प्रकाश उत्तेजना मापदंडों के तहत, न्यूरॉन्स जो एक उत्तेजक ऑप्सिन को व्यक्त करते हैं, इस तरह सक्रिय हो जाएंगे। यदि प्रकाश-उत्तेजना को पुरस्कृत माना जाता है, तो ऑप्टोजेनेटिक्स माउस प्रकाश-जोड़ी वाले डिब्बे में रहेगा, जबकि यदि प्रकाश-उत्तेजना को प्रतिकूल माना जाता है, तो माउस उत्तेजना से बचने के लिए डिब्बे से बाहर निकल जाएगा। विश्लेषण के इस प्रकार आकस्मिक सीखने का आकलन करने के लिए अनुमति देता है: विषय प्रकाश उत्तेजना और इसलिए एक डिब्बे में प्रवेश करके तंत्रिका सक्रियण ट्रिगर कर सकते हैं, और एक वाद्य कार्य के दौरान लीवर दबाने के समान डिब्बे से बाहर निकलकर उत्तेजना को रोकते हैं । इसके अलावा, साहचर्य सीखने के तंत्र का मूल्यांकन बाद के सत्रों के दौरान किया जा सकता है जहां उत्तेजना के अभाव में प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय को मापा जाता है। इस तरह, शोधकर्ता ब्याज के न्यूरॉन्स की उत्तेजना और12से संबंधित साहचर्य स्मृति गठन पर तुरंत पुरस्कृत प्रभावों के बीच अलग कर सकते हैं ।
वर्तमान अध्ययन में, हम स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों के ऑप्टोजेनेटिक्स-संचालित जगह वरीयता व्यवहार के लिए दो कदम-दर-कदम सेटअप प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पहला प्रोटोकॉल तीन डिब्बे वाले उपकरण के भीतर आरटी-पीपी का वर्णन करता है और हाल ही में रूट और सहयोगियों द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आधार पर रेखांकित किया गया है 13 और अन्य लेखकों12, 14,15,16,17,18। प्रयोग में दो चरण होते हैं जिनमें कई दैनिक सत्र (चित्रा 1Aमें दिखाए गए) शामिल हैं। प्रत्येक सत्र को विभिन्न उद्देश्यों के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक डिब्बे के साथ युग्मन उत्तेजना के मापदंडों को तदनुसार बदल दिया जाता है। पहला सत्र,प्रीटेस्ट,विषय की प्रारंभिक वरीयता का आकलन करने के लिए या तो एक डिब्बे के लिए उपयोग किया जाता है। पैच कॉर्ड से कनेक्ट करते समय, विषय को 15 मिन के लिए उत्तेजना के अभाव में स्वतंत्र रूप से उपकरण का पता लगाने की अनुमति है। यदि किसी भी एक डिब्बे के लिए प्रारंभिक वरीयता 80% से अधिक है, माउस विश्लेषण से बाहर रखा गया है क्योंकि प्रारंभिक पक्ष पूर्वाग्रह विश्लेषण तिरछा हो सकता है। ‘प्रीटेस्ट’के बाद‘फेज 1’शुरू होता है। पहले भाग में लगातार दो, दैनिक, 30 मिन सत्र“आरटी-पीपी”होते हैं । “चरण1″के दौरान, ऑप्टोजेनेटिक्स माउस पैच कॉर्ड के माध्यम से लेजर स्रोत से जुड़ा हुआ है और इसे स्वतंत्र रूप से तलाशने के लिए क्षेत्र में रखा जाता है। माउस मुख्य डिब्बों में से एक में प्रवेश पर इंट्राक्रैनियल लेजर उत्तेजना प्राप्त करता है। पायलट प्रयोगों को यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कौन सा डिब्बे लेजर-जोड़ी के रूप में सौंपा जाएगा और जो अपेयर के रूप में। यदि उत्तेजना को पुरस्कृत दिखाया गया है, तो लेजर को“प्रीटेस्ट”के दौरान सबसे कम पसंदीदा डिब्बे में जोड़ा जाएगा और यदि उत्तेजना प्रतिकूल है तो सबसे पसंदीदा होगा। इस प्रकार, प्रस्तुत आरटी-पीपी प्रोटोकॉल इस अर्थ में एक पक्षपातपूर्ण डिजाइन का पालन करता है कि लेजर उत्तेजना बेतरतीब ढंग से दो मुख्य डिब्बों (निष्पक्ष डिजाइन) में से किसी को नहीं सौंपा जाता है, लेकिन माउस की किसी भी प्रारंभिक वरीयता से बचने के लिए चुना जाता है। दो मुख्य डिब्बों को जोड़ने वाले अन्य मुख्य डिब्बे या तटस्थ डिब्बे में प्रवेश इंट्राक्रैनियल प्रकाश उत्तेजना को जन्म नहीं देता है और इस प्रकार हल्के-जोड़े नहीं होते हैं। ये सत्र विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की उत्तेजना के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों के वास्तविक समय के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। ‘फेज1′के आखिरी दिन बिना किसी उत्तेजना के 15 सीन सेशन होता है। यह सत्र वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं(“सीआर”)को संबोधित करने का कार्य करता है जो उत्तेजना और पर्यावरण के बीच साहचर्य सीखने से परिणाम देता है जहां यह प्राप्त हुआ था। ‘चरण1′के कम से कम तीन दिन बाद‘रिवर्सल फेज’होता है जो चरण1के समान संरचना का अनुसरण करता है लेकिन पहले गैर-जोड़ी वाले मुख्य डिब्बे को अब हल्की उत्तेजना के साथ जोड़ा जाता है। ‘फेज1′के मामले में भीदोउत्तेजना सत्र ों के बाद सीआर सेशन होता है। “रिवर्सल चरण”का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि माउस का व्यवहार ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना पर आकस्मिक है और यादृच्छिक मापदंडों से संबंधित नहीं है। आरटी-पीपी प्रयोग के प्रत्येक सत्र को ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर अलग से प्रोग्राम करना होगा। वर्तमान प्रोटोकॉल एक विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के भीतर ऐसी सेटिंग्स का वर्णन करता है, लेकिन प्रकाश स्रोत पर ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर-लॉजिक (टीटीएल) मॉड्यूलेशन सिग्नल भेजने में सक्षम कोई अन्य ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर उपयोग किया जा सकता है।
दूसरा प्रोटोकॉल न्यूट्रल कंपार्टमेंट प्रिफरेंस (एनसीपी) प्रतिमान करार देने वाले उपन्यास सेटअप का वर्णन करता है। आरटी-पीपी का यह संशोधित प्रोटोकॉल कनेक्टिंग कॉरिडोर के छोटे आकार और पारदर्शिता का लाभ उठाता है जो स्वाभाविक रूप से अपनी संकीर्ण और पारदर्शी संरचना के कारण माउस द्वारा बचा जाता है। दोनों मुख्य डिब्बों को हल्की उत्तेजना के साथ बांधना और केवल हल्के-उत्तेजना से मुक्त गलियारा छोड़कर, एनसीपी सेटअप का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कि क्या ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना माउस को प्राप्त करने से बचने के लिए गलियारे में अधिक समय बिताने के लिए मजबूर करेगी ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना। गलियारे में बिताए गए समय के साथ दो प्रकाश-जोड़ी वाले डिब्बों में बिताए गए समय की तुलना करके, ऑप्टोजेनेटिकली-प्रेरित घृणा का सत्यापन किया जा सकता है। एनसीपी प्रयोग लगातार दो दैनिक सत्रों के होते हैं, जहां ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों उत्तेजना (30 min प्रत्येक) प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में वरीयता को मापने, और एक लेजर मुक्त सत्र (15 min) आरटी-पीपी में लोगों के लिए इसी तरह वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल.
नीचे दिए गए आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल को हाल ही में हमारी प्रयोगशाला में इस अध्ययन में मान्य किया गया था कि वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) में स्थित विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स इनाम से संबंधित व्यवहार12के विभिन्न पहलुओं में कैसे शामिल हैं । यहां आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल के क्रियान्वयन की मिसाल बनाने के लिए डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT-Cre19 और वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2 (VGLUT2)- Cre20 ट्रांसजेनिक चूहों को वीटीए में फ्लोक्स्ड चैनलोडोप्सिन 2 (ChR2) डीएनए निर्माण करने वाले एएवी के साथ स्टीरियोप्लााइज किया गया था, जिस पर वीटीए के ऊपर एक ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपित किया गया था । प्रदान किए गए आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन चूहों के विश्लेषण पर प्राप्त व्यवहार प्रतिक्रियाओं से पता चलता है कि वीटीए के भीतर डोपमिनेर्गिक और ग्लूटामिग्शियल न्यूरॉन्स की सक्रियता विभिन्न व्यवहार प्रतिक्रियाओं(चित्रा 1)की ओर जाती है।
आरटी-पीपी और एनसीपी प्रतिमान के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों, स्टीरियोटैक्सिक वायरल इंजेक्शन और फाइबरऑप्टिक्स प्लेसमेंट के जीनोटीपिंग से लेकर लेजर-कंट्रोल और व्यवहार के लिए ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की प्रोग्रामिंग तक की जानकारी प्रदान की जाती है । मूल्यांकन. इसके अलावा, उत्तेजना मापदंडों और प्रयोगात्मक पहलुओं के संदर्भ में प्रोटोकॉल के संशोधनों के लिए सुझावों पर चर्चा की जाती है जो वैज्ञानिक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । जबकि प्रोटोकॉल वीटीए के संदर्भ में वर्णित हैं, उन्हें किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र या न्यूरोनल आबादी पर लागू किया जा सकता है, बशर्ते प्रासंगिक क्रे-ड्राइवर और फ्लोक्सेड ऑप्सिन जैसे प्रासंगिक ऑप्टोजेनेटिक्स टूल उपलब्ध हों।
वर्तमान अध्ययन में, हम चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के स्थान वरीयता विश्लेषण करने के दो चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग वीटीए न्यूरॉन्स(चित्रा 1 और चित्रा 6)12के पुरस्कृत या प्रतिकूल व्यवहार फेनोटाइप का आकलन करने के लिए किया गया था, लेकिन अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की व्यवहार भूमिका का पता लगाने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।
हाल के कई अध्ययनों में दो डिब्बे 23,24और तीन डिब्बे वालेउपकरणों मेंआरटी-पीपी प्रतिमान ों का वर्णन किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक तीन डिब्बे तंत्र में आरटी पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत सेटअप का वर्णन पारंपरिक रूप से सीपीपी प्रयोगों में इस्तेमाल किया दुरुपयोग की दवाओं के प्रशासन पर व्यवहार प्रभाव का आकलन करने के लिए उन जैसी । जबकि परिणाम केवल यहां प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए माउस के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर कई अन्य व्यवहार मापदंडों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जैसे क्षेत्रों में संक्रमण, वेग, समय स्थिर और अधिक खर्च किया जाता है। विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।
वर्तमान आरटी-पीपी प्रोटोकॉल लचीले हैं और यदि विभिन्न प्रकार के उत्तेजना पैटर्न में पुरस्कृत प्रभाव होते हैं तो परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। लेजर नियंत्रण के मापदंडों को आसानी से या तो माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड की स्क्रिप्ट के माध्यम से या ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर बदला जा सकता है, सेटअप की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। हम एक 20 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति का सुझाव देते हैं जो सीमा के भीतर है, और कभी-कभी कम, डोपामिनर्जिक और ग्लूटामिजर न्यूरॉन्स और उनकेटर्मिनलों 13,14,16,17,18,23,24, 25,26,27का अध्ययन करने के लिए एक ही ऑप्सिन संस्करण (ChR2/H134R) का उपयोग करके पिछले अध्ययनों में लागू आवृत्तियों का। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि उच्च उत्तेजना आवृत्तियों कम लोगों की तुलना में व्यवहार पर विपरीत प्रभाव हो सकता है, और है कि इन प्रभावों को एक ध्रुवीकरण28उच्च आवृत्तियों की वजह से ब्लॉक के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं । इसी तरह, पार्श्व प्रीप्टिक क्षेत्र15में ग्लूटार्गिक और गैबार्गिक न्यूरॉन्स को उत्तेजित करते समय व्यवहार उत्पादन में अंतर दिखाया गया है। इन अध्ययनों में वीटीए की तुलना में विभिन्न क्षेत्रों के न्यूरॉन्स की जांच की गई और गैर – ग्लूटाएग्नेस न्यूरॉन्स15,28की उच्च आवृत्तियों पर सबसे बड़ा प्रभाव देखा गया । 20 हर्ट्ज पर हमारी पसंद ग्लूटाएर्गिक और डोपामिनर्जिक वीटीए न्यूरॉन्स के पिछले अध्ययनों पर आधारित है जो यह प्रदर्शित करती है कि उत्तेजना आवृत्तियों को अलग करके, इनाम से संबंधित व्यवहार उत्पादन24,26में काफी परिवर्तन नहीं किया जाता है।
एक अतिरिक्त पैरामीटर जिसे समायोजित किया जा सकता है और जो प्रायोगिक परिणाम को प्रभावित कर सकता है वह प्रकाश स्रोत की शक्ति है। उच्च लेजर शक्ति प्रकाश-उत्तेजित क्षेत्र के आकार को बढ़ा सकती है, जो कुछ प्रकार के प्रयोगों में फायदेमंद हो सकती है लेकिन तापमान5में वृद्धि की कमी के साथ। दरअसल, हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि तापमान में लेजर प्रेरित वृद्धि मस्तिष्क शरीर विज्ञान को बदल सकते है और व्यवहार माप29को प्रभावित करते हैं । ये टिप्पणियां प्रायोगिक डिजाइन में ऑप्सिन-नकारात्मक नियंत्रण ों को शामिल करने के महत्व को उजागर करती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने 10 मिलीआर लेजर पावर का उपयोग किया जो समान है और पहले वीटीए16,24,26में डोपामिनेर्गिक और ग्लूटामिजर न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने में प्रभावी दिखाया गया है। प्रयोगों की स्थापना करते समय, उस क्षेत्र के आकार पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है जिसमें ब्याज की कोशिकाएं स्थित हैं और फाइबर-ऑप्टिक्स और पैच कॉर्ड गुण (संख्यात्मक एपर्चर, कोर व्यास)। लेजर पावर से संबंधित गणना ओं को निष्पादित करते समय इन मापदंडों को ध्यान में रखना आवश्यक है। विवरण के लिए, कार्ल डिसेरोथ की प्रयोगशाला(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)द्वारा विकसित कैलकुलेटर का उपयोग किया जा सकता है।
ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों को लागू करते समय क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन एक और महत्वपूर्ण पहलू है। पुनर्संयोजन दक्षता का सत्यापन हमेशा जानवरों के एक बड़े समूह में किसी भी व्यवहार प्रयोगों की शुरुआत से पहले एक पायलट पलटन में होना चाहिए। यह नैतिक कारणों के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन अनुकूलित प्रयोगात्मक उत्पादन के लिए भी। प्रत्येक वायरल निर्माण अलग न्यूरोनल प्रकार के लिए और विभिन्नक्षेत्रों5 में चर विशिष्टता दिखा सकता है, एक पैरामीटर जो अप्रत्याशित और यहां तक कि भ्रामक तरीकों से प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, हमने पहले डैट-क्रे चूहों के वीटीए में AAV5 वायरस के क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन पैटर्न को मान्य किया है और पाया है कि एकतरफा इंजेक्शन ब्याज के अधिकांश क्षेत्र को लक्षित करने के लिए पर्याप्त थे। जब हमने वीटीए के भीतर स्थानिक रूप से प्रतिबंधित उपआबादी का अध्ययन किया, जैसे कि न्यूरोडी6 अभिव्यक्ति की विशेषता, हमने देखा कि द्विपक्षीय वायरल इंजेक्शन ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश-उत्तेजना12पर अधिक स्पष्ट व्यवहार प्रभाव देने वाले न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या को लक्षित करने के लिए अधिक कुशल थे। इसके अलावा, सर्जरी से व्यवहार प्रयोगों की दीक्षा के लिए समय को ध्यान से संबोधित किया जाना है । दो सप्ताह के लिए पर्याप्त समय के लिए एक ChR2 डीएनए निर्माण सेल निकायों में व्यक्त किया जा सकता है के रूप में हम यहां दिखाने के लिए, लेकिन अब प्रतीक्षा समय (~ 8 सप्ताह) की जरूरत हो सकती है अगर अन्वेषक प्रक्षेपण क्षेत्रों में उत्तेजना के प्रभाव का परीक्षण कर रहा है13,14,15, 17।
यह देखने लायक है कि वीटीए में न्यूरॉन्स का अध्ययन करते समय इंजेक्शन वायरस की मात्रा (हमारे मामले में 300 एनएल) उपयुक्त हो सकती है, लेकिन ट्रांसडक्शन की दक्षता और अध्ययन की गई संरचना के आकार के आधार पर मात्रा और टिटर को समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, औसत दर्जे की धुरी से दूरी पर स्थित द्विपक्षीय संरचनाओं के लिए, द्विपक्षीय इंजेक्शन करना और दोनों गोलार्द्धों में सक्रियण/अवरोध सुनिश्चित करने के लिए द्विपक्षीय रूप से फाइबरऑप्टिक्स को प्रत्यारोपित करना भी आवश्यक हो सकता है ।
अंत में, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन की दक्षता को मान्य और पुष्टि करने और इच्छित स्थान पर ऑप्टिक फाइबर की सही प्रत्यारोपण साइट को सत्यापित करने के लिए पोस्टमार्टम हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करना हमेशा आवश्यक होता है। अप्रत्याशित, अधिक प्रतिबंधित या अत्यधिक क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन अभीष्ट क्षेत्र की सीमाओं के बाहर क्रे व्यक्त न्यूरॉन्स के अज्ञात वितरण के कारण हो सकता है, या वायरस सेरोटाइप में मतभेदों के कारण, वायरस की खराब हैंडलिंग, के क्लोजिंग वायरस डिलीवरी या सर्जरी से जुड़ी अन्य समस्याओं के लिए सिरिंज। सुरक्षित निष्कर्ष निकालने के लिए व्यवहार आकलन के किसी भी सांख्यिकीय परिणामकी पुष्टि करने के लिए संतोषजनक क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन और सही फाइबरऑप्टिक्स-प्रत्यारोपण का सत्यापन किया जाना चाहिए।
यहां उपलब्ध कराए गए आंकड़ों के संदर्भ में दो व्यवहार प्रतिमानों का उपयोग कैसे किया जा सकता है, आरटी-पीपी प्रतिमान में डैट-क्रे चूहों का विश्लेषण करके वीटीए में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना द्वारा प्राप्त प्रकाश-जोड़ी पक्ष को महत्वपूर्ण वरीयता पिछले निष्कर्षों के आधार पर23,24,25,26,27 की उम्मीद थी जबकि VGLUT2-क्री2-चूहों द्वारा दिखाए गए इस पक्ष से परिहार की आशंका नहीं थी। वीटीए के VGLUT2 न्यूरॉन्स और उनके अनुमानों को इनाम और घृणा16,17,24,30,31दोनों में शामिल दिखाया गया है, और इसलिए हमने वर्तमान आरटी-पीपी सेटअप में देखे गए स्पष्ट परिहार व्यवहार का अधिक विस्तार से आकलन करने के लिए एनसीपी विश्लेषण किया। वीटीए ग्लूटाएटलार्ग न्यूरॉन्स की उत्तेजना के प्रतिकूल गुणों की पुष्टि करने के लिए एकमात्र गैर-प्रकाश युग्मित डिब्बे के रूप में संकीर्ण, पारदर्शी गलियारे का उपयोग करके, यह स्पष्ट है कि इस विशेष तीन-डिब्बे सेटअप में, इन न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया का कारण बनती है। ये प्रयोग, जो यहां उन स्थितियों का उदाहरण देने के लिए दिखाए गए थे जो आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल दोनों का उपयोग करने से लाभान्वित हो सकते हैं, हाल ही में प्रकाशित अध्ययन का हिस्सा थे, और इन निष्कर्षों के बारे में पूर्ण डेटा सेट के साथ-साथ चर्चाएं इस प्रकाशन12में पाई जा सकती हैं ।
एनसीपी के अलावा, घृणा की पुष्टि करने के वैकल्पिक तरीकों में एक खुले क्षेत्र क्षेत्र के भीतर एक क्षेत्र की मजबूत रोशनी शामिल है, जबकि बाकी क्षेत्र को लेजर सक्रियण के लिए बांधना, या एक सक्रिय परिहार कार्य करना है जिसमें माउस को लेजर उत्तेजना15को समाप्त करने के लिए व्यवहार का एक विशिष्ट पैटर्न करना पड़ता है।
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल इनाम और घृणा में न्यूरोनल सक्रियण की भूमिका को जानने के लिए सबसे कुशल तरीके से आरटी-पीपी और एनसीपी विश्लेषण को सफलतापूर्वक करने के तरीके की महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। वैज्ञानिक परिकल्पना के आधार पर, इन प्रोटोकॉलों का उपयोग करके कई मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है, और प्रत्येक प्रोटोकॉल को विशिष्ट मस्तिष्क को संबोधित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स को लागू करने वाले अनुकूलित व्यवहार विश्लेषणों के लिए अन्य मान्य प्रतिमानों के साथ भी जोड़ा जा सकता है क्षेत्रों और ब्याज के न्यूरॉन्स।
The authors have nothing to disclose.
हमारे वित्तपोषण स्रोतों को कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है: उपसाला विश्वविद्यालय, वेटेन्सकापस्रैडेट (स्वीडिश रिसर्च काउंसिल), Hjärnfonden, पार्किंसंसफोडेन, बर्टिल हैल्स्टन, ओई & एडला जोहानसन, ज़ूलोगिस्क फोर्सेंजिंग और Åhlén के रिसर्च फाउंडेशन। उपसाला विश्वविद्यालय में जानवरों को रखा गया था और उपसाला विश्वविद्यालय व्यवहार सुविधा में प्रयोग किए गए थे।
AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | – | a great variety of viruses to suit any project's needs |
Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
Nucleic Acid gel stain – GelRed | Biotium | 41003-T | |
PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
Power meter | Thorlabs | PM100D | |
Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |