Summary
여기에서 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경 설정 패러다임에 대한 2개의 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 두 가지 설정을 사용하여, 선호도 및 회피 거동은 높은 공간 및 시간 선택성을 가진 동일한 장치 내에서, 그리고 간단한 방식으로 단단히 평가될 수 있다.
Abstract
신경 활성화가 특정 행동 출력으로 어떻게 이끌어 내는지 이해하는 것은 현대 신경 과학을 위한 근본입니다. 설치류의 광유전학과 검증된 패러다임의 행동 테스트를 결합하면 높은 공간 및 시간적 선택성과 실시간으로 독특한 뉴런을 자극할 때 행동 결과를 측정할 수 있으며, 따라서 설치 신경 활성화와 행동 사이의 인과 관계. 여기서, 우리는 실시간 장소 기본 설정(RT-PP) 패러다임, 고전적인 조건부 배치 기본설정(CPP) 테스트의 수정된 버전에 대한 단계별 프로토콜을 설명한다. RT-PP는 3구획 장치에서 수행되며 특정 뉴런 집단의 광유전학적 자극이 보람 있거나 비열한 경우 응답하는 데 활용될 수 있다. 우리는 또한 RT-PP 프로토콜의 대체 버전을 설명, 소위 중립 구획 환경 설정 (NCP) 프로토콜, 혐오를 확인하는 데 사용할 수있는. 2개의 접근은 행동 약리학에서 유래한 고전적인 방법론의 확장및 신경과학 필드 내의 optogenetics의 최근 구현에 근거를 두습니다. 이러한 설정은 장소 선호도를 실시간으로 측정하는 것 외에도 조건부 동작에 대한 정보를 제공할 수도 있습니다. 당사는 자체 데이터의 예와 함께 따라하기 쉬운 단계별 프로토콜을 제공하고 이러한 유형의 실험을 적용할 때 고려해야 할 중요한 측면에 대해 논의합니다.
Introduction
광유전학의 구현, 빛이 신경 활동을 제어하는 데 사용되는 현대 신경 과학 실험 도구, 최근 몇 년 동안 특정 신경 인구가 행동에 미치는 영향을 이해하는 주요 발전을 주도하고있다1,2,3. 광유전학의 뛰어난 공간및 시간적 선택성은 관심있는 세포 집단과 행동 출력의 세포 그룹의 여기 또는 억제 사이의 인과 관계의 확립을허용2,3. 광유전학에 있는 공간 선택성은 일반적으로 Cre-Lox 시스템을 통해 보장되는 Cre-Lox의 활동은 Lox 사이트 사이 존재하는 어떤 DNA 서열의 재결합으로 이끌어 내는, 소위 floxed alleles (lox 사이트에 의해 옆으로)4. 광유전학에 있는 Cre-Lox 시스템을 사용하는 목표는 주위 신경을 표현이 결여된 떠나는 동안 관심있는 특정 뉴런에 optogenetic opsins를 코딩하는 뚜약의 표현을 달성하는 것입니다. Opsins는 특정 파장의 광 자극시 신경 흥분성에 영향을 미치거나 다운스트림 이펙터 경로를 조절하여 세포 기능에 영향을 미치는 이온 흐름을 허용하는 빛에 민감한 단백질입니다. 작용(흥분제, 억제, 변조)이 다른 옵신의 새로운 변이체는 광파장 및 역학 특성에 의한활성화,5는 특정 실험 접근법의 요구를 충족시키기 위해 지속적으로 개발되고 있다. 흥분성에 관하여, 탈분극 또는 과분극 opsin을 사용하여 뇌내로 전달되는 특정 파장에서 광 자극에 대한 뉴런의 활성(각각 여기 또는 억제)을 지시한다3.
선택적 프로모터 활성은 관심 있는 뉴런에 Cre 재조합아제의 발현을 지시한다. 관심 있는 옵신의 플록스 형 알레를 구현함으로써, Cre-mediaed 재조합은 Opsin이 Cre recombinase3,6을공동 발현하는 뉴런에서 선택적으로 발현되도록 할 것이다. 공간 선택성을 직접 이중 형질전환의 사용은 광유전학에서 매우 효율적인 것으로 입증되었습니다. 따라서, 광-자극이 광원(LED 또는 레이저)에 연결된 내심성 이식광섬유를 통해 광범위하게 전달되는 반면3,Cre recombinase 및 플로싱 된 opsin 알레를 모두 발현하는 뉴런만이 이러한 자극에 반응할 것이다. 설치류의 Cre-Lox 시스템은 트랜스제닉(Cre recombinase 및 floxed opsin 구성모두 형질전환 동물에서 인코딩됨), 바이러스 주사(Cre 재조합 및 플록스 옵신에 대한 DNA 구성물 모두 바이러스 캐리어를 통해 전달됨) 또는 두 가지의 조합(예를 들어, 둘 다)을 사용하여 다양한 방식으로 달성될 수 있습니다( 예를들어, Cre 재조합아제는 플록스옵신 구조를 운반하는 바이러스로 주입되는 형질전환 동물에 의해 인코딩된다)5. floxed opsin DNA 구성은 일반적으로 조직 단면도에 있는 Cre 중재한 재조합의 가시화를 가능하게 하기 위하여 리포터 유전자를 가진 프레임에서 복제됩니다. 광유전학은 또한 쥐에서 수행될 수 있는 동안, 제시된 프로토콜은 마우스를 위해 생성되었습니다. 단순화를 위해, Cre 재조합 및 floxed opsin을 모두 운반하는 마우스는 "광유전학 마우스"로 지칭될 것이다. 아래에 기술된 프로토콜에서, 광유전학 마우스는 혼합형 트랜스제닉(Cre recombinase 의 두 가지 다른 프로모터의 통제하에) 및 바이러스(아데노 관련 바이러스, AAV를 사용하여, 플로크스 opsin DNA 구성물을 전달하기 위해-우리의 경우 ChR2/H134R) 접근법에 의해 생성되었다. 형질전환 마우스 라인을 획득하고 유지하는 것은 방법론의 필수적인 부분입니다. Cre-드라이버 및 floxed opsin 트랜스제닉 마우스는 각 목적을 위해 생산될 수 있고, 시판되는 경우 구입될 수 있으며, 다양한 형태의 Cre 재조합 및 플록스 옵신을 인코딩하는 DNA 서열을 운반하는 다양한 바이러스가 있을 수 있다.
행동 테스트와 결합된 광유전학은 특정 유형의 행동에서 뚜렷한 뇌 영역 또는 이산 신경 집단의 역할을 연구하는 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 보상 관련 행동의 맥락에서, optogenetics는 행동 약리학 및 실험 심리학의 필드에 있는 이전 사실 인정의 확인을 가능하게 하고, 또한 특정 뉴런이 행동에 어떻게 영향을 미치는지에 spatio 관련 해부의 새로운 수준을 허용했습니다. 보상 관련 행동을 평가하기 위해 여러 연구에서 사용된 한 가지 방법은 조건부 장소 환경 설정(CPP)으로 알려진 고전적인 방법의 수정된 버전입니다. 고전적 CPP는 환경의 단서와 파블로비아의 연관성을 유도하는 능력을 통해 남용 약물의 보람 또는 비애적 특성을 평가하는 데 사용되어 왔다7,8. 파블로비안 용어에서, 약물은 무조건 자극 접근 또는 철수 를 유도 할 수 있기 때문에 그것은 보람 또는 전복, 각각. 다양한 중립 자극과 약물의 지속적인 페어링, 그 자체가 어떤 반응을 유도하지 않는, 접근 또는 철수로 이어질 수 있습니다 단지 이전에 중립의 프리젠 테이션에, 하지만 페어링 후, 소위 조건부 자극9. CPP 해석은 일반적으로 동일한 크기의 두 구획을 포함하는 장치에서 수행되지만 각 구획은 바닥 질감, 벽 패턴 및 조명 (중립 자극)과 같은 뚜렷한 특성에 의해 정의됩니다. 두 개의 구획은 복도 또는 구획 사이의 개구부로 연결됩니다. 컨디셔닝 하는 동안, 피험자, 일반적으로 작은 설치류, 다른 구획으로 제한하는 동안 두 개의 주요 구획 및 식염수 중 하나에 제한하면서 약물의 수동 주사를받습니다. 약물의 보람있는 효과는 피험체가 전체 장치를 자유롭게 탐색 할 수 있을 때 약물없는 세션에서 이후에 평가됩니다. 이전에 약물 쌍을 이루는 구획에서 소요된 시간의 양(조건부 반응)은 약물의 보람있는 효과와 투여와 관련된 구획의단서(조건부 자극) 사이에서 매개된 파블로비안 학습 메커니즘을 반영하는 것으로 간주된다. 동물 약물 쌍 구획에 더 많은 시간을 보내는 경우, 약물은 행동에 보람 있는 효과 의미 하는 조건 부 장소 환경 설정을 유도 했다. 한편, 약물이 비약으로 인식되는 경우, 동물은 약물 짝이 결합된 구획을 피하고 식염수 쌍 구획에서 더 많은 시간을 보내고, 조건부 장소 혐오(CPA)8,9,10,11을나타낸다.
광유전학은 "실시간"에서 신경 활동을 제어하기 위해 구현될 수 있기 때문에, 행동 패러다임의 사용은 유사하지만 구별되지만, CPP 설정은 직접 뉴런 활성화 시 장소 선호도를 측정할 수 있게 한다. 장소 선호도의 광유전학 중심 분석은 따라서 종종 실시간 장소 선호도(RT-PP) 분석 패러다임이라고 합니다. RT-PP 패러다임에서 Cre-Lox 시스템을 통한 분단 뉴런의 광유전학적 자극은 고전적인 CPP에서 수행되는 약물의 전신 전달을 대체하므로, RT-PP 패러다임이 광유전학적으로 유도된 뉴런 자극이 광유전학적으로 유도된 경우 를 측정하도록 한다. 보람또는 비등한 것으로 인식됩니다. 현재 설명은 광유전학 마우스에 초점을 맞출 것입니다, 그러나 또한 광유전학 쥐는 유사한 프로토콜을 사용하여 시험될 수 있습니다.
고전 적 CPP 패러다임에서와 같이 한 번에 하나의 구획으로 컨디셔닝하는 대신, RT-PP 패러다임의 광유전학 마우스는 전체 장치에서 자유롭게 움직일 수 있고 동작은 세션 전반에 걸쳐 기록된다. 구획 중 하나에 들어가는 것은 두개내 빛 자극과 짝을 이룹니다. 적절한 광 자극 파라미터하에서, 흥분성 옵신을 발현하는 뉴런은 이에 의해 활성화될 것이다. 빛 자극이 보람있는 것으로 인식되는 경우에, 광유전학 마우스는 빛 쌍을 이루는 구획에 남아 있을 것입니다, 빛 자극이 비약적인로 인식되는 경우에, 마우스는 자극을 피하기 위하여 구획을 종료할 것입니다. 이러한 유형의 분석은 우발적 인 학습을 평가 할 수 있습니다 : 피사체는 구획을 입력하여 빛 자극및 따라서 신경 활성화를 트리거 할 수 있으며, 구획을 종료하여 자극을 중지, 도구 작업 중 레버 압착과 유사. 또한, 연관 학습 메커니즘은 각 구획에서 보낸 시간이 자극의 부재에서 측정되는 후속 세션 동안 평가 될 수있다. 이런 식으로, 연구원은 관심의 뉴런의 자극에 즉시 보람 효과와 그것에 관련 된 연관 메모리 형성 사이 해리 수12.
현재 연구에서는, 우리는 자유롭게 움직이는 마우스의 광유전학 중심의 장소 특혜 행동을 위한 2개의 단계별 설치 프로토콜을 기술합니다. 첫 번째 프로토콜은 3구획 장치 내에서 RT-PP를 설명하고 최근 Root 및 동료13 및 기타 저자12,14, 15,16,17,18에의해 제시된 프로토콜에 기초하여 설명되었다. 실험은 여러 일일 세션으로 구성된 두 단계로 구성됩니다(도 1A에도시됨). 각 세션은 서로 다른 목적을 위해 설계및 구획과 결합 자극의 매개 변수는 그에 따라 변경됩니다. 첫 번째 세션인"Pretest"는구획 중 하나에 대한 피험자의 초기 선호도를 평가하는 데 사용됩니다. 패치 코드에 연결된 동안, 피험체는 15분 동안 자극이 없는 상태에서 장치를 자유롭게 탐색할 수 있다. 한 구획에 대한 초기 기본 설정이 80% 이상이면 초기 측면 바이어스가 해석을 왜곡할 수 있기 때문에 마우스가 분석에서 제외됩니다. "사전테스트"후, "단계 1" 시작 됩니다. 첫 번째 부분은"RT-PP"의 두 연속, 매일, 30 분 세션으로 구성되어 있습니다. "단계 1"동안, 광유전학 마우스는 패치 코드를 통해 레이저 소스에 연결하고 자유롭게 탐구하기 위해 경기장에 배치됩니다. 마우스는 주요 구획 중 하나에 입력시 두개내 레이저 자극을 받습니다. 파일럿 실험을 수행하여 레이저 페어링으로 할당할 구획과 페어링되지 않은 구획을 결정할 수 있습니다. 자극이 보람있는 것으로 나타난 경우, 레이저는"Pretest"동안 가장 바람직하지 못한 구획에 결합될 것이며 자극이 비동기인 경우 가장 선호될 것이다. 따라서, 제시된 RT-PP 프로토콜은 레이저 자극이 두 개의 주요 구획(편견 없는 설계) 중 어느 한 개에 무작위로 할당되지 않는다는 의미에서 편향된 설계를 따르지만, 마우스의 초기 선호도를 피하기 위해 선택된다. 두 개의 메인 컴파트먼트를 연결하는 다른 메인 컴파트먼트 또는 중립 구획으로 들어가는 것은 두개내 빛 자극을 초래하지 않으므로 라이트 페어링되지 않습니다. 이 세션은 특정 신경 집단의 자극의 보람 또는 비열한 속성의 실시간 평가를 허용합니다. "1단계"의마지막 날에, 어떤 자극없이 15 분 세션이 일어난다. 이 세션은 자극과 수신된환경 간의 연관 학습에서 비롯된 조건부 응답("CR")을 해결하는 역할을 합니다. "1단계"이후 적어도 3일 후에 "반전 단계"는"1상"과동일한 구조를 따르지만 이전에 는 페어링되지 않은 메인 구획이 광 자극과 쌍을 이룹니다. "1단계"의경우와 같이, 두 자극 세션은"CR"세션이 뒤따릅니다. "반전단계"마우스의 거동이 광유전학적 자극에 따라 우발적이며 무작위 파라미터와 관련이 없는지 확인하는 데 사용됩니다. RT-PP 실험의 각 세션은 추적 소프트웨어 내에서 별도로 프로그래밍되어야 합니다. 현재 프로토콜은 특정 소프트웨어 내에서 이러한 설정을 설명하지만, 광원에 트랜지스터 트랜지스터 논리 (TTL) 변조 신호를 보낼 수있는 다른 추적 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
두 번째 프로토콜은 NCP(중립 구획 기본 설정) 패러다임이라고 하는 새로운 설정을 설명합니다. RT-PP의 이 수정된 프로토콜은 좁고 투명한 조성으로 인해 마우스에 의해 자연스럽게 피할 수 있는 연결 복도의 작은 크기와 투명도를 활용합니다. 두 메인 구획을 광 자극과 페어링하고 복도에 빛 자극이 없는 상태로 두면 NCP 설정은 광유전학 적 자극으로 인해 마우스가 복도에서 더 많은 시간을 보내도록 하는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학 자극. 두 개의 가벼운 페어링 구획에서 소요된 시간을 복도에서 보낸 시간과 비교함으로써 광유전학적으로 유발된 혐오감을 검증할 수 있습니다. NCP 실험은 광유전학 마우스가 실시간으로 선호도를 측정하기 위해 자극(각 30분)을 받는 2개의 연속적인 일일 세션과 RT-PP의 반응과 유사한 조건부 반응을 평가하기 위한 레이저 프리 세션(15분)으로 구성됩니다. 프로토콜.
아래에 제공된 RT-PP 및 NCP 프로토콜은 최근 복부 테그멘탈 영역(VTA)에 위치한 다양한 유형의 뉴런이 보상 관련 행동의 다양한 양상에 관여하는 방법에 대한 연구에서 당사의 실험실에서 검증되었다12. 여기서, RT-PP 및 NCP 프로토콜의 구현을 예시하기 위해, 도파민 수송기(DAT)-Cre19 및 수식 글루타메이트 수송기 2(VGLUT2)-Cre20 형질전환 마우스를 입체적으로 주입하여 VTA 위에 이식된 VTA에 플록스 채널로직근신2(ChR2) DNA 구성을 운반하는 AAV를 주입하였다. 제공된 RT-PP 및 NCP 프로토콜을 사용하여 이들 마우스의 분석시 얻은 행동 반응은 VTA 내의 도파민성 및 글루타마테르기뉴런의 활성화가 어떻게 상이한 행동 반응으로 이어지는지를보여준다(도 1).
RT-PP 및 NCP 패러다임을 위한 단계별 프로토콜은 형질전환 마우스의 유전자 변형, 입체 바이러스 주사 및 광섬유 배치, 레이저 제어 및 행동을 위한 추적 소프트웨어 프로그래밍에 이르는 다양한 정보를 제공합니다. 평가. 또한, 과학적 결과에 영향을 미칠 수 있는 자극 파라미터 및 실험적 측면의 관점에서 프로토콜의 수정에 대한 제안이 논의된다. 프로토콜은 VTA의 맥락에서 설명되어 있지만, 관련 Cre-driver 및 floxed opsins와 같은 관련 광유전학 도구를 사용할 수 있는 경우 모든 뇌 영역 또는 뉴런 집단에 적용할 수 있습니다.
Protocol
본 연구는 남녀 모두의 이형지우리 DAT-Cre19 및 VGLUT2-Cre20 마우스를 사용하여 수행되었으며, 숙성및 8주 및 계량 >20 g. 모든 실험은 스웨덴 (동물 복지법 SFS 1998:56) 및 유럽 연합 법규 (협약 ETS 123 및 지침 2010/63/EU)에 따라 현지 동물 윤리위원회의 허가를 받아 수행되었습니다.
1. 마우스의 게노티핑
- 귀 펀처를 사용하여 귀 생검을 사용하여 형질전환 마우스의 유전자 변형에 사용하십시오.
- 특수 제작된 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 수행하기 위해 귀 펀치를 준비합니다.
참고:이 프로토콜에서는 Cre-directed 프라이머가 사용되었습니다.- 이어 펀치를 함유하는 각 1.5 mL 튜브에 75 μL의 라시스 버퍼(버퍼 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA)를 추가합니다.
- 96°C에서 30분 동안 가열 블록에 인큐베이션합니다.
- 샘플을 5분 동안 식힌 다음 중화 버퍼의 75 μL을 추가합니다(버퍼 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- 표준 절차에 따라 PCR을 수행12,21 적절한 프라이머를 사용하여 (여기: Cre FW 5'-ACGAGTGGGTTCGAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAGAGATTAG-3').
주의: PCR 후드 아래 얼음을 작업하고 시약과 시료를 오염시키지 않도록 주의하십시오.- PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 적절한 제어 샘플을 포함하여 분석할 샘플 수에 따라 다음 볼륨을 곱합니다. 증류수(18.9 μL), MgCl 2(2.5 μL), 10 mM dNTP 믹스(0.5 μL)를 가진 10x 버퍼: 단일 25 μL 최종 부피 반응에 대한 시약을 다음 순서로 혼합합니다.), 10 μM 순방향 프라이머(1 μL), 10 μM 역프라이머(1 μL), 5 U/μL DNA 폴리머라제(0.1 μL), 및 템플릿 DNA(1 μL; 다음 단계에 첨가될 것이다).
참고: 항상 유효한 결과를 보장하기 위해 음수, 양수 및 빈(템플릿 DNA 제외) 컨트롤을 추가합니다. - PCR 튜브에 마스터 믹스 24 μL을 추가합니다.
- 각 PCR 튜브에 템플릿 DNA 1 μL(각 마우스의 귀 펀치에서 나오는)을 추가합니다.
- 템플릿 DNA가 마스터 믹스 내부에 있는지 확인하기 위해 PCR 튜브를 간략하게 원심 분리합니다.
- 표 1의사이클링 프로그램을 사용하여 열 주기로 PCR을 수행합니다.
- PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 적절한 제어 샘플을 포함하여 분석할 샘플 수에 따라 다음 볼륨을 곱합니다. 증류수(18.9 μL), MgCl 2(2.5 μL), 10 mM dNTP 믹스(0.5 μL)를 가진 10x 버퍼: 단일 25 μL 최종 부피 반응에 대한 시약을 다음 순서로 혼합합니다.), 10 μM 순방향 프라이머(1 μL), 10 μM 역프라이머(1 μL), 5 U/μL DNA 폴리머라제(0.1 μL), 및 템플릿 DNA(1 μL; 다음 단계에 첨가될 것이다).
- 전기 동극을 사용하여 샘플을 실행하는 아가로즈 젤을 준비합니다.
참고: 크기는 분석해야 하는 샘플 수에 따라 달라집니다.- 유리 병에 1x 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 버퍼에 1 % w / v 아가로즈 파우더를 추가하십시오. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 가열하여 정기적으로 끓이지 않는지 확인합니다.
주의: 화상을 피하기 위해 주의하십시오. - 겔을 약 50°C까지 식히고 핵산 겔 얼룩(0.5 μL/50 mL의 젤)을 추가합니다.
- 잘 빗을 포함하는 주조 트레이에 젤을 붓고 완전히 고형이 될 때까지 실온에 둡니다. 빗을 부드럽게 제거합니다.
- 전기 동공 탱크를 1 x TAE 버퍼로 채우고 젤을 탱크에 놓습니다.
- DNA 샘플 각각에 1x DNA 로딩 염료 2 μL을 추가합니다.
- 겔의 첫 번째 우물에 DNA 사다리의 4 μL을 적재한 다음 나머지 웰에 샘플의 전체 부피를 로드합니다.
- 전기 동공의 전원을 140V로 설정하고 25-30 분 동안 실행합니다.
- 젤을 UV 소스 아래에 놓고 결과를 촬영합니다.
- 유리 병에 1x 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 버퍼에 1 % w / v 아가로즈 파우더를 추가하십시오. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 가열하여 정기적으로 끓이지 않는지 확인합니다.
2. 입체 외과
- 헤비노티핑 후, Cre에 대해 양성을 유지하는 별도의 마우스. 8주 이상 될 때까지 기다렸다가 수술을 위해 20g의 무게를 달아주십시오.
- 환경을 살균하고 무균 조건하에서 수술을 수행하기 위해 수술 도구를 살균.
- 수술 30분 전에 진통제로 마우스를 피하주사하십시오.
- 이소플루란으로 마우스를 마취 (유도를위한 일반 공기에서 2-3 %, 마취 유지를위한 1.5-2.0 %). 마우스의 발가락을 부드럽게 꼬집어 통증 반사의 부재를 테스트하여 적절한 마취 수준을 달성하십시오. 그에 따라 이소플루란 전달을 조정합니다.
- 마우스를 입체 전지 장치에 놓습니다. 눈 윤활제를 첨가하여 건조로 인한 눈 병변을 방지하고 두개골 상단의 머리카락을 면도하십시오. 가열 패드를 사용하여 마우스의 온도를 안정적으로 유지하십시오.
- 두개골 피부 아래에 국소 마취제 100 μL을 주입하고 5 분 정도 효력을 발휘하십시오.
- 요오드와 교대로 알코올 또는 멸균 식염수의 세 가지 원형 응용 프로그램에 의해 절개 부위를 준비합니다. 멸균 면 팁을 사용하여 절개 라인에서 바깥쪽으로 응용 프로그램을 시작합니다.
- 집게로 피부를 부드럽게 들어 올리고 수술용 가위로 로스트로카우달 축을 따라 ~1.5cm의 절개를 하여 두개골 표면을 드러냅니다.
- 면 스틱을 사용하여 H2O2 용액을 적용하여 섬막을 제거하십시오.
- 멸균 식염수로 두개골을 헹구고 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 건조시면 말립니다.
- 브레그마와 람다를 찾습니다.
- 브레그마와 람다에, 스테레오 택시 프레임에 조정 주입 바늘의 끝을 배치하여 평면 두개골 정렬을 확인합니다. 각 위치에 대한 복부 좌표를 측정하고 비교합니다. 두개골이 평평할 때 bregma와 람다 모두에 대한 복부 좌표는 동일합니다. 그렇지 않은 경우 머리 위치를 조정하고 다시 측정합니다.
- 프랭클린 및 Paxinos22에따르면 브레그마에서 -0.2 mm의 위치를 찾아 표시하고 마이크로 드릴을 사용하여 Cre 의존성 바이러스의 주입 및 이식이 이루어지고 작은 구멍을 만듭니다.
- 정밀 펌프를 사용하여 스테레오택시픽 장치에 장착된 10 μL 주사기에 400 nL의 바이러스를 적재한다.
- 바늘을 낮추고 (34 G, 경사진) 조심스럽게 300 nL의 Cre 의존적 광유전학 바이러스(AAV5-EF1a-DIO-ChR2 (H134)-eYFP [5.6 x 1012 vg/mL]) VTA (AP: -3.45 mm, ML : 정밀 펌프를 사용하여 100 nL / min 주입 속도에서 프랭클린과 Paxinos22에따르면, 브레그마에서 -0.2 mm 및 두개골 표면에서 -4.4 mm.
- 주사 후, 바이러스의 확산을 허용하기 위해 추가로 10 분 동안 바늘을 제자리에 둡니다(그림 2A).
- 주사 사이트에서 천천히 바늘을 철회.
- 광섬유 와 치과 시멘트 복합체를 안정화 앵커 나사에 맞게 마이크로 드릴을 사용하여 작은 구멍을 확인합니다.
- 프랭클린과 팍시노스22에따르면 브레그마 좌표를 다시 가지고 광섬유(직경 200 μm, 0.37 NA)를 삽입한다: AP: -3.45 mm, ML: -0.2 mm 의 브레그마및 -4.0 mm 의 두개골 표면으로부터(그림 2B).
- 치과 시멘트를 사용하여 두개골에 섬유를 고정합니다. 두개골에 고정하기 위해 광섬유 ferule 주위에 충분한 시멘트를 적용하지만 패치 코드의 연결을 허용하기 위해 시멘트의 ferule의 상단의 3-4mm를 두고주의(그림 2C).
참고 : 이것은 뇌 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 시멘트구멍을 채우지 않도록주의하십시오. 지압 재료는 이런 일이 발생하지 않도록 구멍에 추가 할 수 있습니다. - 조직 접착제 또는 흡수성 봉합사를 사용하여 열린 상처를 닫고 동물을 적어도 2 주 동안 회복하십시오. 수술 후 진통제 12-24 h를 추가로 투여하십시오.
3. 레이저 소스의 제어 설정
- 단일 기판 마이크로 컨트롤러를 사용하여 레이저 소스를 제어합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 스크립트를 작성합니다. 컴퓨터에 적절한 연결 케이블을 사용하여 마이크로 컨트롤러 보드에 스크립트를 로드합니다.
참고: 스크립트에는 TTL 박스를 통해 추적 소프트웨어에서 나오는 외부 변조(입력)와 자극 파라미터를 제어하는 레이저출력이 포함되어야 합니다. 20Hz 주파수에서 10ms 펄스 폭의 경우 보조 코딩 파일에있는 스크립트를 사용합니다. - 보드를 추적 하드웨어의 레이저 및 TTL 상자에 연결합니다.
- 네트워크 케이블을 사용하여 TTL 박스를 보드에 연결합니다(제공된 스크립트의 경우 핀 5)(그림 3A, C).
- 레이저가 외부 변조에 의해 제어되도록 설정되어 있는지 확인하고 FC / PC 케이블 (주어진 스크립트에 대한 핀 13)을 사용하여 레이저를 보드에 연결합니다(그림 3B, C).
- 적절한 핀을 보드의 접지 부분에 연결합니다.
- 레이저 소스를 광섬유에 연결합니다.
- 레이저 소스를 회전 조인트에 연결합니다(그림3D).
- 패치코드(그림 3E)를로터리 조인트에 연결합니다.
- 로터리 조인트가 장치 위에 있지만 기록 영역 외부에 있는 것을 안정화합니다. 광섬유 패치 코드의 길이가 경기장에서 어려움 없이 마우스를 움직일 수 있도록 적절한지 확인합니다(그림3F).
4. 추적 소프트웨어 내에서 RT-PP 접근 방식에 대한 실험 설정
- 경기장 설정을 보정합니다. 눈금자를 사용하여 물리적 장치의 특정 부분을 측정하고, 드로잉 스케일 아래의 소프트웨어 내에서 이미지에서 측정된 부분에 해당하는 선을 그려 캘리브레이트 탭을 하고 이미 알려진 값을 입력합니다(도 4의1단계).
- 경기장을 디자인합니다. 마우스의 움직임이 기록될 영역을 그립니다(도 4의2단계).
- 영역을 만듭니다. 결국 레이저 페어링, 레이저 페어링되지 않은 및 "중립"으로 할당될 영역을 그립니다(그림 4의3단계).
- 설치 의 유효성을 검사하여 경기장 외부의 영역과 같은 충돌하는 매개 변수가 없는지 확인합니다(그림 4의4단계).
- 탭 평가판 제어 설정에서 실험 매개 변수를 설정합니다(그림 4의5단계).
- 그림 5의 1단계에서 와 같이 30분 RT-PP 세션에 대해 평가판 시간을 설정합니다.
- "하드웨어 제어"가 활성화되어 있는지 확인하려면 마우스의 항목이 추적 소프트웨어를 통해 마이크로 컨트롤러 보드에 TTL 신호를 트리거하는 레이저 페어링으로 구획을 할당합니다. 도 5(단계 2)에서 레이저-페어링구획은 구획 A이다. 반전 단계의 경우 구획 B가 레이저 페어링되고 구획 A가 페어링되지 않도록 구획을 전환합니다. A를 B와 B로 소프트웨어의 A로 대체합니다.
5. NCP 접근법을 사용하여 자극의 비열특성을 테스트하기 위한 설정 의 수정
- 앞서 설명한 대로 4.1-4.4 단계를 따릅니다.
- "참조" 상자 설정에서 "반복까지" 옵션을 통해 실험 시간을 30분으로 설정합니다(그림 6의1단계).
- A 및 B 구획의 설정과 관련된 조건 상자에 "중심점이 영역 A 및 영역 B에 있을 때"를 추가하여 A 영역과 B 영역을 모두 레이저 페어링으로 지정합니다(그림 6의2단계). 동물이 중립 구획에 있으면 레이저가 꺼집니다.
6. 레이저 자극을 사용하여 실험 수행
- 검색 설정을 설정합니다.
- 적절한 감지 설정을 위해 더미를 사용하여 마우스와 유사하게 합니다.
- 더미를 장치의 한 구획에 놓고 동적 뺄셈이 있는 자동 설정을 사용합니다.
- 더미를 제거하고 반대쪽 구획에 놓습니다. 더미가 완전히 감지되었는지 확인하고 그렇지 않은 경우 소프트웨어를 통해 설정을 조정하여 적절한 감지를 달성하십시오.
- 이 단계에서는 자극이 예상대로 작동하는지 확인합니다. 이전에 구성된 평가판 제어 설정을 사용하여 수집을 시작하고 더미를 레이저 페어링 구획에 배치하고 자극이 예상대로 트리거되는지 확인합니다. 그런 다음 더미를 페어링되지 않은 및/또는 중립 구획에 놓고 자극이 중지되었는지 확인합니다.
- 센서가 있는 파워 미터를 사용하여 레이저의 손잡이를 사용하여 레이저 전력을 10mW로 설정합니다(그림3B). 레이저 자극이 사용될 때마다 이 단계를 수행한다.
주의: 레이저 광에 직접 노출되면 영구적인 눈 손상을 일으킬 수 있으므로 보호 용 눈 장비를 사용하십시오. - 기기에 마우스를 놓습니다.
- 마우스를 케이지에서 부드럽게 꺼내 세라믹 슬리브를 사용하여 광섬유 패치 코드에 연결합니다.
- 마우스를 3구획 장치의 중립 구획에 부드럽게 놓습니다.
- 소프트웨어에서 마우스가 감지될 때까지 기다립니다.
- 동물이 메인 구획에 들어가지 못하도록 하는 수직 슬라이딩 도어를 제거합니다.
- 동물이 방해받지 않고 자유롭게 탐험할 수 있도록 하십시오.
참고 : 동물이 6.2 단계가 필요하지 않고 레이저가 전체 시간 떨어져 있다는 것을 제외하고는 자극을받지 않을 때도 동일한 절차를 따릅니다.
Representative Results
상기 3구획장치(도 3F)는약물의 보람있는 효과를 해결하고 광유전학을 이용하여 뉴런의 직접 자극의 보람또는 비애적 특성을 실시간으로 평가하기에 적합하다. 이 객실은 2개의 메인 컴파트먼트(20cm[W] x 18cm [L] x 25cm[H])와 작은 연결 구획(20cm[W] x 7cm[L] x 25cm[H])으로 구성되어 있습니다. 주요 구획은 연관 학습을 용이하게하기 위해 뚜렷한 벽과 바닥 질감과 패턴을 가지고 있으며, 연결 / 중립 구획은 좁고 투명하여 마우스가 자연스럽게 시간을 덜 보낼 수 있습니다. 전술한 바와 같이, 추적 소프트웨어는 각 구획에서 소요된 움직임 및 시간을 포함하는 마우스의 몇몇 행동 파라미터를 기록하고, 레이저 자극을 제어하는데 사용될 수 있다. 전체 RT-PP 실험은 8세션(도1A)에걸쳐 이루어지며, 이전 경험(일 5 및 8,"CR")에대한 응답으로 직접 자극(일 3, 4, 6 및 7)의 보람 또는 비애적 성질의 평가와 협회의 형성, 양성 또는 부정의 형성을 모두 허용한다.
첫째로, 우리는 도파민성 뉴런을 표적으로 하기 위하여 VTA에 있는 AAV-ChR2-eYFP 바이러스로 주입된 DAT-Cre 마우스를 시험했습니다. 문헌에 따라, 우리는 마우스가 자극과 짝을 이루는 구획에서 시간을 보내는 것을 선호한다는 것을 관찰하였다(그림 1B,단계 1, 3, 일 3, 청색 원, 양방향 반복 측정 [RM] 분산의 분석 [ANOVA], 구획 F의 효과(2,18) = 141, p < 0.001; 세션 x 구획 F의 효과(12,108) = 0.10; 0.10; Tukey의 포스트 혹 테스트 페어링 vs 페어링되지 않은 p & 0.001). 구획과 레이저 자극의 페어링이 전환된 반전 단계는, 이러한 관찰을 확인하였다(도1B,일 6 및 7, 블루 서클, Tukey의 포스트 호크 테스트 페어링 vs 페어링되지 않은 구획 p < 0.001) 따라서 1단계에서 얻어진 결과가 측면 바이어스 또는 무작위 파라미터와 관련이 있었다는 가능성을 배제하였다. RT-PP의 4 일 동안 각 구획에서 보낸 시간을 평균하는 것은 마우스가 짝이 없는 것과 반대로 레이저 페어링 구획에서 평균 약 70 %를 소비한다는 것을 확인했습니다 (~20%) 및 중립(~10%) 구획(그림 1B 바 그래프, 단방향 RM ANOVA, 자극 F의 효과(2,6) = 139, p < 0.001, Tukey의 게시물 어떻게 페어링 대 짝이 없는 및 중립 구획 p < 0.001). 더욱이, 자극의 부재에서, 일 5 과 8에, 마우스는 이전에 레이저 자극과 짝을 이루는 구획에 훨씬 더 많은 시간을 보냈다 (Tukey의 포스트 hoc p < 0.001), 이전 경험은 자극의 "추구"로 반영 연관 학습 행동을 유도하기에 충분했다는 것을 나타내는. 이들 데이터는 문헌에 따라 현재 방법이 VTA에서 특정 뉴런 집단의 광유전학적 자극의 보람있는 효과를 조사하기 위해 안정적으로 사용될 수 있음을 입증한다.
그런 다음 위와 같이 VTA에 AAV-ChR2-eYFP를 주입한 VGLUT2-Cre 마우스를 테스트하여 VTA의 글루타마테르지성 뉴런을 표적으로 했습니다. 본 실험에서, 우리는 DAT-Cre 마우스에 의해 입증된 것과반대행동 표현형을 관찰하였다. 따라서, 마우스는 자극에 짝이 된 구획을 피하고 모든 RT-PP 일 동안 짝이 없는 데 더 많은 시간을보냈다(그림 1C 왼쪽, 양방향 RM ANOVA, 구획 F의 효과(2,12) = 40.9, p< 0.001; 세션 x 구획 F(12,72) = 16.1, p & 0.001; Tukey의 포스트 혹 테스트 페어링 vs 페어링되지 않은 p & 0.001; 그림 1C 오른쪽, 자극 F(2,6) = 162, p < 0.001, Tukey의 포스트 호크 페어링 vs 페어링되지 않은 중립 구획 p < 0.001의 단방향 RM ANOVA 효과. 흥미롭게도,"CR"5 일 및 8 일 동안, 마우스는 이전에 쌍을 이룬 구획의 명확한 회피를 보여주지 않았다 (페어링된 구획과 짝이 없는 구획 의 차이 없음). 그것은 조건부 응답의 부족은 레이저 쌍 구획에 소요 된 부적절한 시간 때문이 될 수 있습니다, 이는 레이저 활성화와 일어난 특정 환경 사이의 협회의 형성을 방지. 이 회피 표현형을 더 탐구하기 위해, 우리는 우리가 "중립 구획 환경 설정", 축약 된 NCP라는 수정 된 프로토콜을 사용했다. 본 실험에서, 두 메인 구획은 자극에 쌍을 이루었고 중성 구획은 자극이 없는 상태로 남아있었다(도 7A). 우리는 자극이 비약적 인 특성을 가지고 있다면, 마우스가 그것을 피하기 위해 더 작고 중립적 인 구획에서 시간을 보내야한다는 것을 가설했습니다. 실제로, 자극의 두 일 (Stim1 및 Stim2) 마우스는 중성 구획에서 시간의 대부분을 보냈다 (약 80%) 페어링된 구획과비교(그림 7B, C;왼쪽: 구획 F의 양방향 RM ANOVA 효과(2,8) = 70.9, p< 0.001; 세션 x 구획 F(4,16) = 6.9, p = 0.002, Tukey의 포스트 혹 "자극 1" 중립 구획 대 구획 1 및 2 P < 0.01, "자극 2" 중립 구획 대 구획 1 및 2 p & 0.001; 오른쪽: 편도 RM ANOVA,2,2 p의 효과 0.018, Tukey의 포스트 혹 테스트는 1과 2 대 중립 p <, 0.05)를 페어링했습니다. RT-PP 시험 동안"CR"일의 경우와 같이, 마우스는 구획과 자극 사이의 부정적인 연관성을 형성하는 것 같지 않았다; 즉, 자극 (CR)의 부재에서, 그들은 동일한 정도로 모든 구획을 탐구(그림 7B,쌍을 이루는 구획과 중립 구획에서 보낸 시간 사이의 차이 없음). 이러한 실험의 결과는 RT-PP 설정 동안 관찰된 행동 표현형을 확인하여 RT-PP 및 NCP 패러다임의 조합 구현을 지원한다.
그림 1: RT-PP 패러다임에서 광유전학을 이용한 행동 테스트. (A)실험의 타임라인을 개략적으로 표현한다. (B, C) 왼쪽 위: AAV-ChR2-eYFP로주입된 DAT-Cre(N=10) 및 VGLUT2-Cre(N=7) 마우스에 대한 RT-PP 실험 전반에 걸쳐 각 구획에서 소요된 시간의 백분율을 나타내는 그래프. 파란색 원: 레이저 페어링 구획; 흰색, 검은 색 원 : 주요 구획; 회색 원: 중립 구획. 오른쪽 위: 3일, 4일, 6일 및 7일 동안 각 구획에서 보낸 평균 시간 비율(RT-PP)입니다. 하단: DAT-Cre 및 VGLUT2-Cre 마우스의 각 구획에서 보낸 시간의 대표적인 히트맵. 모든 데이터는 일반적으로 분포되었다 (샤피로 - 윌크 테스트). 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. ***p < 0.001 페어링 대 페어링되지 않은; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 페어링 vs 중립 구획; §§p < 0.01, §§§p < 0.001 미페어링 vs 중립 구획. 이 수치는 Bimpisidis 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광유전학 적 실험을위한 외과 적 수술. (a)VTA에서 Cre 의존성 바이러스 벡터의 주사. (B)주사 부위 위에 광섬유를 이식한다. 안정화에 사용되는 앵커 나사를 참고하십시오. (C)치과 용 시멘트를 사용하여 두개골에 섬유를 영구적으로 고정시다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광유전학 실험에 사용되는 장비. (A)연구에 사용된 TTL 박스입니다. 추적 소프트웨어에서 입력을 수신하고 TTL 신호를 마이크로 컨트롤러 보드로 보냅니다. (B)실험에 사용되는 레이저 소스의 전면(위쪽) 및 후방 시야(아래)를. (C)레이저 자극을 제어하는 데 사용되는 마이크로 컨트롤러 보드. TTL 상자와 레이저 소스에 대한 연결을 확인합니다. (D)로타리 조인트. (E)실험에 사용되는 광섬유 패치 코드. (F)RT-PP 및 NCP 실험에 사용되는 3구획 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 추적 소프트웨어 내에서 경기장 및 영역 을 디자인합니다. 1 단계 : 설정 의 보정. 2 단계 : 전체 경기장의 그림. 3단계: 경기장 내 의 영역 그리기. 4단계: 설치 유효성 검사. 5 단계 : 시간 및 자극 매개 변수를 설정하기위한 평가판 제어 설정 탭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 추적 소프트웨어 내에서 RT-PP 실험의 시간 및 자극 파라미터를 설정합니다. 지속 시간(1단계)과 광 자극을 위한 조건에 대한 특정 규칙을 추가한다(2단계). 조건은 쉽게 반전 단계에 대한 요구 사항에 맞게 변경할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 추적 소프트웨어 내에서 NCP 실험의 시간 및 자극 파라미터를 설정합니다. 자극 세션(단계 1)의 지속 기간은 RT-PP에 대한 것들과 유사하지만 광 자극 활성화를 위한 조건(단계 2)은 다르다. 메인 구획(여기 영역 A 및 영역 B라고 명명)으로 들어가면 마우스가 중립 구획에 들어갈 때만 종료되는 광유전학 적 자극이 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: NCP 패러다임에서 광유전학을 이용한 행동 테스트. (A)실험 설정의 개략적 표현. (B)왼쪽: VTA에서 AAV-ChR2로 주입된 VGLUT2-Cre 마우스에 대한 자극(Stim1 및 Stim 2) 및 조건부 반응(CR) 세션 동안 각 구획에서 소요된 시간의 백분율을 나타내는 그래프(N=5). 오른쪽: NCP의 자극 의 이틀 동안 각 구획에서 보낸 시간의 평균 비율. (C)자극일 중 하나인 VGLUT2-Cre 마우스에 대해 각 구획에서 보낸 시간의 대표적인 히트맵. 데이터는 일반적으로 분산되었다 (샤피로 - 윌크 테스트). 결과는 평균 ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 쌍 대 페어링 된 1 및 페어링 된 2 구획으로 표시됩니다. 이 수치는 Bimpisidis 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 온도 | 기간 | 사이클 |
| 1. 초기 변성 | 95 °C | 4분 | 1 |
| 2. 변성 | 95 °C | 30s | 30 |
| 3화 어닐링 | 55 °C | 30s | |
| 4. 확장 | 72 °C | 40s | |
| 5. 최종 확장 | 72 °C | 약 6분 | 1 |
| 6. 보류 | 4 °C | 실험자가 멈출 때까지 | 1 |
표 1: PCR 사이클링 프로그램.
Discussion
현재 연구에서는, 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경설정 분석의 다른 모형을 능력을 발휘하는 방법의 2개의 단계별 프로토콜을 제시합니다. 설명된 프로토콜은 VTA 뉴런의 보람또는 비열한 행동 표현형을 평가하는 데 사용되었습니다(그림1 및 도 6)12,그러나 그밖 두뇌 지구에 있는 신경의 행동 역할을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
몇몇 최근 연구는 2 구획23,24 및 3 구획 장치13,14,15,16,17,18에있는 RT-PP 패러다임을 기술했습니다. 현재 프로토콜은 남용 약물의 투여 시 행동 효과를 평가하기 위해 CPP 실험에서 전통적으로 사용되는 것과 유사한 3구획 장치에서 RT-PP 및 NCP 프로토콜에 대한 자세한 설정을 설명합니다. 결과는 마우스가 각 구획에서 소비한 시간의 백분율로만 표시되지만 추적 소프트웨어는 영역으로의 전환, 속도, 움직이지 않는 시간 등과 같은 여러 가지 다른 동작 매개 변수를 분석할 수 있습니다. 다양한 매개 변수의 분석은 데이터 해석에 중요할 수 있습니다.
현재 RT-PP 프로토콜은 유연하며 다양한 유형의 자극 패턴이 보람있는 효과가 있는지 테스트하도록 수정할 수 있습니다. 레이저 제어의 파라미터는 마이크로 컨트롤러 보드의 스크립트 또는 추적 소프트웨어 내에서 쉽게 변경할 수 있으며 설정의 다양성을 입증할 수 있습니다. 우리는 범위 내에 있는 20 Hz 자극 주파수를 제안, 때로는 낮은, 동일한 opsin 변이체를 사용 하 여 이전 연구에 적용 된 주파수의 (ChR2/H134R) 도파민 성 및 글루타마테르지 뉴런과 그들의 터미널을 공부 하기 위해13,14,16,17,18,23, 24,25,27. 최근 연구는 높은 자극 주파수가 낮은 것들보다 행동에 반대의 영향을 미칠 수 있음을 입증하고, 이러한 효과는 높은 주파수에 의해 발생하는 탈분극 블록을 통해 중재되는것을 28. 유사하게, 행동 출력의 차이는 횡구 전두엽 영역에서 글루타마미터및 GABAergic 뉴런을 자극할 때15로나타났다. 이러한 연구는 VTA보다 상이한 영역의 뉴런을 조사하였고 가장 큰 효과는 비글루타마테르지성 뉴런의 고주파에서 관찰되었다15,28. 20 Hz에서 우리의 선택은 글루타마테르기및 도파민성 VTA 뉴런의 이전 연구에 기초하여 다양한 자극 주파수에 의해, 보상 관련 행동 출력이 크게 변경되지 않는다는 것을입증하는 24,26.
조정될 수 있고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 추가 파라미터는 광원의 힘입니다. 레이저 파워가 높을수록 빛 자극 영역의 크기가 증가할 수 있으며, 이는 일부 유형의 실험에서 도움이 될 수 있지만 온도5의증가의 단점이 있을 수 있습니다. 실제로, 최근 연구는 온도에서 레이저 유도 증가 뇌 생리학을 변경 하 고 행동 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 입증했다 29. 이러한 관찰은 실험 설계에 opsin 음성 제어를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다. 현재 프로토콜에서, 우리는 유사하고 이전에 VTA16,24,26에서도파민성 및 글루타마테르지뉴런을 자극하는 데 효과적인 것으로 나타난 10 mW 레이저 파워를 사용했다. 실험을 설정할 때 관심 있는 세포가 있는 영역의 크기와 광섬유 및 패치 코드 특성(숫자 조리개, 코어 직경)에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이러한 파라미터는 레이저 전력과 관련된 계산을 수행할 때 고려해야 합니다. 자세한 내용은 칼 데이세로스의실험실(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)에서개발한 계산기를 사용할 수 있습니다.
Cre-Lox 재결합의 조직학적 검증은 광유전학 실험을 적용할 때 또 다른 중요한 측면입니다. 재결합 효율의 검증은 항상 동물의 큰 그룹에서 임의의 행동 실험의 개시 전에 파일럿 코호트에서 일어났다. 이는 윤리적 이유뿐만 아니라 최적화된 실험 출력에도 중요합니다. 각 바이러스 성 구문은 별개의 뉴런 유형 및 다른 영역5,예측할 수 없고 심지어 오해의 소지가 있는 방식으로 실험에 영향을 줄 수 있는 매개 변수에 대한 가변 적 특이성을 나타낼 수 있습니다. 예를 들면, 우리는 이전에 DAT-Cre 마우스의 VTA에 있는 AAV5 바이러스의 Cre-Lox 재조합 패턴을 유효하게 하고 일방적인 주사가 관심 지역의 대다수를 표적으로 하기에 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다. 그 때 우리는 NeuroD6 발현을 특징으로 하는 것과 같은 VTA 내의 공간적으로 제한된 하위 집단을 연구할 때, 우리는 양측 바이러스성 주사가 광유전학적인 광 자극에 대하여 더 뚜렷한 행동 효력을 주는 뉴런의 더 많은 수를 표적으로 하는 것이 더 효율적이었다는 것을 관찰했습니다12. 또한 수술부터 행동 실험 의 개시까지의 시간은 신중하게 다루어져야합니다. 2주는 우리가 여기에서 보여주는 바와 같이 ChR2 DNA 구조가 세포체에서 표현될 수 있는 충분한 시간이지만, 조사자가 프로젝션 영역에서 자극의 효과를 시험하는 경우 대기 시간(~8주)이 더 필요할 수 있다13,14,15,17.
VTA에서 뉴런을 연구할 때 주입된 바이러스의 부피(300 nL)가 적합할 수 있지만, 형질전환의 효율과 연구된 구조의 크기에 따라 부피와 역가를 조정해야 합니다. 또한, 측교 축에서 거리에 위치한 양측 구조의 경우, 양측 주사를 수행하고, 또한 두 반구모두에서 활성화 / 억제를 보장하기 위해 양자 광섬유를 이식할 필요가있을 수 있습니다.
마지막으로, Cre-Lox 재결합의 효율성을 검증하고 확인하고 의도한 위치에서 광섬유의 정확한 이식 부위를 확인하기 위해 사후 조직학적 분석을 수행해야 합니다. 예기치 않은, 과도 한 제한 또는 과도 한 Cre-Lox 재조합 의도 된 영역의 경계 외부 Cre를 표현 하는 뉴런의 알 수 없는 분포로 인해 발생할 수 있습니다., 또는 바이러스 혈청형의 차이, 바이러스의 가난한 처리, 막힘 바이러스 전달 또는 기타 수술 관련 문제에 대한 주사기. 안전한 결론을 도출하기 위해 행동 평가의 통계적 결과를 확인하기 위해 만족스러운 Cre-Lox 재조합 및 올바른 광섬유 이식의 검증이 수행되어야 합니다.
두 행동 패러다임을 사용할 수 있는 방법의 예로 여기에 제공된 데이터의 관점에서, RT-PP 패러다임에서 DAT-Cre 마우스를 분석하여 VTA에서 도파민성 뉴런의 광유전적 자극에 의해 얻어진 광쌍 측에 대한 유의한 선호도는 VGLUT2-Cre 마우스에 의해 나타난 이러한 측면의 회피가 예상되지 않았지만 이전 의 사실23,24,25,26,27에 기초하여 예상되었다. VTA 및 이들의 프로젝션의 VGLUT2 뉴런은 보상 및 혐오16,17,24,30,31모두에 관여하는 것으로 나타났으며, 따라서 우리는 NCP 분석을 수행하여 현재 RT-PP 설정에서 관찰된 명백한 회피 거동을 보다 자세하게 평가한다. 좁고 투명한 코리더를 VTA 글루타마테르지뉴런의 자극의 비광 특성을 확인하기 위한 유일한 비광 결합 구획으로서, 이러한 3구획 설정에서, 이러한 뉴런의 광유전학적 활성화가 비역적 반응을 일으킨다는 것이 명백하다. RT-PP 및 NCP 프로토콜을 모두 사용하여 혜택을 받을 수 있는 상황을 예시하기 위해 여기에 나타난 이러한 실험은 최근 발표된 연구의 일부였으며, 이러한 결과에 관한 전체 데이터 세트 및 이러한 결과에 관한 논의는 본 간행물12에서확인할 수 있다.
NCP 이외에, 혐오감을 확인하는 대안적인 방법은 경기장의 나머지 부분을 레이저 활성화에 페어링하는 동안 개방필드 영역 내의 영역의 강한 조명을 포함하거나, 또는 마우스가 레이저자극을종료하는 동작의 특정 패턴을 수행하도록 하는 능동적인 회피 태스크를 수행한다(15).
요약하자면, 설명된 프로토콜은 보상 및 혐오에서 신경 활성화의 역할을 해명하기 위해 가장 효율적인 방법으로 RT-PP 및 NCP 분석을 성공적으로 수행하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 과학적 가설에 따라 이러한 프로토콜을 사용하여 다양한 매개 변수를 분석할 수 있으며, 각 프로토콜은 특정 뇌를 해결하기 위해 광유전학을 구현하는 최적화된 행동 분석을 위해 다른 검증된 패러다임과 결합될 수 있습니다. 지역과 관심의 뉴런.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리의 자금 소스는 감사하게 인정된다: 웁살라 대학, Vetenskapsrådet (스웨덴 연구 위원회), Hjärnfonden, 파킨슨 폰덴, 베르틸 홀스텐의 연구 재단, OE & 에들라 요한슨, Zoologisk Forskning 및 Åhlén. 동물은 웁살라 대학에서 보관하고 실험은 웁살라 대학 행동 시설에서 수행되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
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