빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.
Summary
이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.
Abstract
판면 도파민 (DA) 복부 테지멘트 영역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens 보상 처리 및 강화 학습에 중추적 인 역할을한다. VTA 제어 면질 DA 방출에 다양한 뉴런 입력이 보상 처리 및 보강 학습을 제어하는 회로의 더 나은 그림을 제공 할 수있는 방법을 이해. 여기서는 생체내 고속 스캔 순환 볼탐법(FSCV)에서 측정한 약리학 작용제 및 길항제의 인트라-VTA 캐뉼라 주입을 자극-황량한 Phasic DA 방출(결합된 주입 및 자극 또는 CIS)과 결합하는 방법을 설명합니다. 마취된 쥐에서 CIS-FSCV를 사용하여, 핵 accumbens 코어에서 기록하는 동안 캐뉼라가 장착된 양극성 전극으로 VTA를 전기적으로 자극함으로써 면학적 DA 반응을 불러질 수 있다. 약리학 작용제 또는 길항제는 특정 VTA 수용체의 역할을 조사하기 위해 자극 부위에 직접 주입될 수 있다. CIS-FSCV의 주요 장점은 VTA 수용체 기능이 생체 내에서 연구될 수 있다는 것입니다.
Introduction
Phasic 도파민 (DA) 복부 tegmental 지역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens에 (NAc) 보상 관련 행동에 중요 한 역할을 한다. VTA DA 뉴런은 토닉형 발사(3-8Hz)에서 폭발형 발사(>14Hz)1로전환하여 NAc에서 면세 DA 방출을 생성합니다. VTA는 토닉에서 버스트 발사2,3,4,5로의전환을 조절할 수 있는 다양한 소마토덴드리틱수용체를 표현한다. 이러한 수용체중 어느 수용체와 그들의 각각의 입력을 식별, 제어 Phasic DA 릴리스보상 관련 회로가 조직되는 방법에 대한 우리의 이해를 심화합니다. 여기에 설명된 방법론의 목적은, 빠른 스캔 순환 볼탐법(CIS-FSCV)과 결합된 주입 및 자극을 결합하여, Phasic DA 방출을 구동하는 VTA 수용체의 기능을 빠르고 강력하게 평가하는 것이다.
결합된 주입 및 자극(CIS)이라는 용어는 뉴런(여기 VTA) 그룹에 약리적으로 수용체를 조작하고 수용체의 기능을 연구하기 위해 그 뉴런을 자극하는 것을 말합니다. 마취 된 쥐에서, 우리는 빠른 스캔 순환 Voltammetry (FSCV)에 의해 측정된 바와 같이, NAc 코어에서 큰 면세 DA 신호 (1-2 μM)를 연상시키기 위해 VTA를 전기적으로 자극한다. 자극 부위에서 약리학 약물(즉, 수용체 작용제/길항제)의 주입은 해조 된 Phasic DA 방출의 후속 변화를 관찰하여 VTA 수용체의 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다. FSCV는 높은 공간(50-100 μm)과 측두구(10Hz) 해상도를 모두 즐기는 전기화학적 접근법으로 보상 관련, 면책 DA 이벤트6,7을측정하는 데 적합합니다. 이 분해능은 마이크로투아분해와 같은 생체 내 신경화학적 측정보다 더 미세합니다. 따라서, 함께, CIS-FSCV는 Phasic 도파민 방출의 VTA 수용체 조절을 평가하기에 적합합니다.
VTA 수용체 기능을 조사하는 한 가지 일반적인 방법은 이러한 수용체가 뉴런1,8의발사 속도를 변경하는 방법을 해결하는 전기 생리학적 접근법의 조합을 사용하는 것입니다. 이러한 연구는 어떤 수용 체 활성화 시 DA 발사 운전에 관여 이해에 매우 귀중 하다. 그러나, 이러한 연구는 축 하 말기에서 하류 발생할 수 있습니다 제안할 수 있습니다 (즉, 신경 전달 물질의 방출). CIS-FSCV는 VTA 버스트 발사, 면질 DA 방출의 출력이 VTA 점선 및 세포 체에 위치한 수용체에 의해 어떻게 조절되는지에 응답함으로써 이러한 전기 생리학적 연구를 기반으로 합니다. 따라서 CIS-FSCV는 이러한 전기 생리학 연구에 기반을 두는 데 적합합니다. 예를 들어, 니코틴 수용체 활성화는 VTA9에서버스트 발사를 유도할 수 있고, 마취쥐에서 CIS-FSCV는 VTA에서 니코틴아세틸콜린 수용체(nAChR) 활성화가 또한 NAc10,11에서의 phasic DA방출을제어한다는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
또한, Phasic DA 규정의 기계형 검사는 또한 일반적으로 약물의 목욕 응용 프로그램과 함께 슬라이스 준비를 사용하여 공부. 이러한 연구는 종종 세포 체가슬라이스12에서제거되기 때문에 도파민 말기에서 phasic DA 방출의 사전 시냅스 조절에 초점을 맞추고 있다. 이러한 준비는 도파민 터미널에 사전 시 냅 스 수용 체 효과 공부에 대 한 가치, CIS-FSCV 는 도파민 뉴런에 somatodendritic 수용 체 효과 연구에 더 적합 하는 반면, VTA에 사전 신냅스 입력 뿐만 아니라. 이러한 구별은 VTA에서 소마토덴디틱 수용체 활성화가 NAc 사전 시냅틱 수용체 활성화와 다른 효과를 가질 수 있기 때문에 중요합니다. 실제로, NAc에서 도파민제 전시냅틱 nAChRs를 차단하는 것은 버스트발사시 페이시브 도파민 방출을 상승시킬 수 있으며, 그 반대는 VTA 소마토덴드릭 nAChRs10,11에서사실이다.
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출을 조절하는 VTA 수용체의 능력을 연구하기위한 이상적인 방법입니다. 중요한 것은, 이 접근은 마취또는 자유로운 이동중 하나인 그대로 쥐에서 수행될 수 있습니다. 이러한 접근법은 급성 연구에 적합하여, 그기준상태(10,14)에서 수용체 기능을 연구할 뿐만 아니라 약물 노출 또는 행동 조작 후 수용체의 기능적 변화를 평가할 수 있는 장기연구(11,15)에적합하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출의 기본 VTA 수용체 메커니즘을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 적절한 레코딩을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 호출된 DA 신호에서 약간의 드리프트와 함께 안정적인 기준선 레코딩을 달성해야 합니다. 안정적인 레코딩을 구축할 가능성을 높이는 중요한 방법은 전극이 60Hz와 10Hz 모두에서 사이클링할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하는 것?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작업은 엘리자베스 타운 대학 (R.J.W, M.L., 그리고 L.M.), NSF 대학원 펠로우십 (R.J.W.) 및 예일 의과 대학 (N.A.)에 의해 지원되었다.
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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