Summary
이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.
Abstract
판면 도파민 (DA) 복부 테지멘트 영역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens 보상 처리 및 강화 학습에 중추적 인 역할을한다. VTA 제어 면질 DA 방출에 다양한 뉴런 입력이 보상 처리 및 보강 학습을 제어하는 회로의 더 나은 그림을 제공 할 수있는 방법을 이해. 여기서는 생체내 고속 스캔 순환 볼탐법(FSCV)에서 측정한 약리학 작용제 및 길항제의 인트라-VTA 캐뉼라 주입을 자극-황량한 Phasic DA 방출(결합된 주입 및 자극 또는 CIS)과 결합하는 방법을 설명합니다. 마취된 쥐에서 CIS-FSCV를 사용하여, 핵 accumbens 코어에서 기록하는 동안 캐뉼라가 장착된 양극성 전극으로 VTA를 전기적으로 자극함으로써 면학적 DA 반응을 불러질 수 있다. 약리학 작용제 또는 길항제는 특정 VTA 수용체의 역할을 조사하기 위해 자극 부위에 직접 주입될 수 있다. CIS-FSCV의 주요 장점은 VTA 수용체 기능이 생체 내에서 연구될 수 있다는 것입니다.
Introduction
Phasic 도파민 (DA) 복부 tegmental 지역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens에 (NAc) 보상 관련 행동에 중요 한 역할을 한다. VTA DA 뉴런은 토닉형 발사(3-8Hz)에서 폭발형 발사(>14Hz)1로전환하여 NAc에서 면세 DA 방출을 생성합니다. VTA는 토닉에서 버스트 발사2,3,4,5로의전환을 조절할 수 있는 다양한 소마토덴드리틱수용체를 표현한다. 이러한 수용체중 어느 수용체와 그들의 각각의 입력을 식별, 제어 Phasic DA 릴리스보상 관련 회로가 조직되는 방법에 대한 우리의 이해를 심화합니다. 여기에 설명된 방법론의 목적은, 빠른 스캔 순환 볼탐법(CIS-FSCV)과 결합된 주입 및 자극을 결합하여, Phasic DA 방출을 구동하는 VTA 수용체의 기능을 빠르고 강력하게 평가하는 것이다.
결합된 주입 및 자극(CIS)이라는 용어는 뉴런(여기 VTA) 그룹에 약리적으로 수용체를 조작하고 수용체의 기능을 연구하기 위해 그 뉴런을 자극하는 것을 말합니다. 마취 된 쥐에서, 우리는 빠른 스캔 순환 Voltammetry (FSCV)에 의해 측정된 바와 같이, NAc 코어에서 큰 면세 DA 신호 (1-2 μM)를 연상시키기 위해 VTA를 전기적으로 자극한다. 자극 부위에서 약리학 약물(즉, 수용체 작용제/길항제)의 주입은 해조 된 Phasic DA 방출의 후속 변화를 관찰하여 VTA 수용체의 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다. FSCV는 높은 공간(50-100 μm)과 측두구(10Hz) 해상도를 모두 즐기는 전기화학적 접근법으로 보상 관련, 면책 DA 이벤트6,7을측정하는 데 적합합니다. 이 분해능은 마이크로투아분해와 같은 생체 내 신경화학적 측정보다 더 미세합니다. 따라서, 함께, CIS-FSCV는 Phasic 도파민 방출의 VTA 수용체 조절을 평가하기에 적합합니다.
VTA 수용체 기능을 조사하는 한 가지 일반적인 방법은 이러한 수용체가 뉴런1,8의발사 속도를 변경하는 방법을 해결하는 전기 생리학적 접근법의 조합을 사용하는 것입니다. 이러한 연구는 어떤 수용 체 활성화 시 DA 발사 운전에 관여 이해에 매우 귀중 하다. 그러나, 이러한 연구는 축 하 말기에서 하류 발생할 수 있습니다 제안할 수 있습니다 (즉, 신경 전달 물질의 방출). CIS-FSCV는 VTA 버스트 발사, 면질 DA 방출의 출력이 VTA 점선 및 세포 체에 위치한 수용체에 의해 어떻게 조절되는지에 응답함으로써 이러한 전기 생리학적 연구를 기반으로 합니다. 따라서 CIS-FSCV는 이러한 전기 생리학 연구에 기반을 두는 데 적합합니다. 예를 들어, 니코틴 수용체 활성화는 VTA9에서버스트 발사를 유도할 수 있고, 마취쥐에서 CIS-FSCV는 VTA에서 니코틴아세틸콜린 수용체(nAChR) 활성화가 또한 NAc10,11에서의 phasic DA방출을제어한다는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
또한, Phasic DA 규정의 기계형 검사는 또한 일반적으로 약물의 목욕 응용 프로그램과 함께 슬라이스 준비를 사용하여 공부. 이러한 연구는 종종 세포 체가슬라이스12에서제거되기 때문에 도파민 말기에서 phasic DA 방출의 사전 시냅스 조절에 초점을 맞추고 있다. 이러한 준비는 도파민 터미널에 사전 시 냅 스 수용 체 효과 공부에 대 한 가치, CIS-FSCV 는 도파민 뉴런에 somatodendritic 수용 체 효과 연구에 더 적합 하는 반면, VTA에 사전 신냅스 입력 뿐만 아니라. 이러한 구별은 VTA에서 소마토덴디틱 수용체 활성화가 NAc 사전 시냅틱 수용체 활성화와 다른 효과를 가질 수 있기 때문에 중요합니다. 실제로, NAc에서 도파민제 전시냅틱 nAChRs를 차단하는 것은 버스트발사시 페이시브 도파민 방출을 상승시킬 수 있으며, 그 반대는 VTA 소마토덴드릭 nAChRs10,11에서사실이다.
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출을 조절하는 VTA 수용체의 능력을 연구하기위한 이상적인 방법입니다. 중요한 것은, 이 접근은 마취또는 자유로운 이동중 하나인 그대로 쥐에서 수행될 수 있습니다. 이러한 접근법은 급성 연구에 적합하여, 그기준상태(10,14)에서 수용체 기능을 연구할 뿐만 아니라 약물 노출 또는 행동 조작 후 수용체의 기능적 변화를 평가할 수 있는 장기연구(11,15)에적합하다.
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Protocol
모든 실험은 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 엘리자베스 타운 대학과 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 CIS-FSCV를 활용하는 마취 된 쥐 준비에 특정합니다.
1. 외과 전 준비
- 전극 용액 준비
- 전극 백필 용액을 만들기 위해 염화 16140mM 칼륨으로 아세테이트 4M의 용액을 준비한다.
- 전극 준비
- 진공 흡입을 사용하여 T-650 탄소 섬유 (직경 7 μm)를 borosilicate 유리 모세관 (길이 = 100mm, 직경 = 1.0mm, 내부 직경 = 0.5 mm)에 삽입하십시오.
- 탄소 섬유가 유리 모세관 내부에 놓이면 유리 모세관을 수직 전극 풀러에 넣고 열 원소는 모세관 한가운데에 대략 배치합니다. 자석을 끄고 히터를 55로 설정합니다.
- 모세관을 당긴 후, 전극의 끝이 가열 요소에 의해 포위되지 않도록 조심스럽게 상부 모세관 홀더를 올립니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 여전히 모세관의 두 조각을 연결하는 탄소 섬유를 잘라냅니다. 이로 인해 두 개의 분리된 탄소 섬유 미세 전극이 발생합니다.
- 가벼운 현미경하에서, 탄소 섬유가 유리 끝을 넘어 약 75-100 μm를 확장되도록 날카로운 메스로 노출된 탄소 섬유를 조심스럽게 잘라냅니다.
- 가벼운 현미경을 사용하여 전극이 모세관을 따라 균열이 없는지 확인하십시오. 또한 탄소 섬유가 모세관을 빠져나가는 씰이 눈치채기 어렵고 균열이 없도록 하십시오.
참고: 좋은 씰은 녹음 중 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다. 보다 상세한프로토콜은17,18,19에 게재된 연구를 참조하십시오.
- 기준 전극 제조
- 5cm 실버 와이어에 골드 핀을 납땜.
- 양극을 금속 종이 클립 또는 다른 도체, 음극에 핀에 부착하고, 종이 클립과 실버 와이어가 0.1 M HCl에 침수되는 동안 전압(~2V)을 적용합니다.
- 백색 코팅(AgCl)이 실버 와이어에 나타나면 전압을 중단합니다.
- 이식용 전극 준비
- 얇은 절연 와이어에 금 핀을 납땜 (길이 10cm, <0.50 mm 직경).
- 골드 핀 맞은편 와이어에서 절연 ~5cm를 제거합니다.
- 전극 용액의 중간쯤에 전극을 채웁니다.
- 절연 와이어를 전극에 삽입합니다.
참고: 와이어는 전극 내부의 탄소 섬유와 접촉해야 합니다.
2. 전극 이식
- 성인, 남성, 스프라그 Dawley 쥐 (250-450 g) 멸균 식염수에 용해 된 0.5 g/mL 우레탄의 인트라피오네 주사(1.5 g/kg 또는 1mL/kg 부피)를 준다. 1.0-1.2 g/kg의 초기 우레탄 복용량으로 시작합니다. 동물이 우레탄 투여 후 20분 동안 유해 자극 테스트(tail pinch)에 여전히 반응하는 경우 총 용량 1.5g/kg의 요르탄을 추가로 투여하십시오.
참고: 0.5 g/mL 우레탄 용액을 준비하려면 식염수 10g(~10mL)에 우레탄 10g을 넣습니다. 우레탄은 발암 물질이며 주의해야 합니다. 우레탄은 케타민/자일라진 및 클로랄 수화물20,21과같은 다른 마취제와 마찬가지로 도파민의 수준을 변경하지 않기 때문에 중요한 마취제이다. - 동물이 심하게 마취되고 유해 성 자극 (예 : 발가락 핀치)에 반응하지 않는 경우, 스테레오 탁스 프레임에 놓습니다. 쥐의 각 눈에 안과 윤활유를 바르습니다.
참고 : 이것은 비 생존 수술이지만 좋은 무균 기술이 권장됩니다. - 2단 스크럽(즉, 요오도포비도 스크럽, 70% 에탄올 스크럽, 3주기 반복으로 수행)을 사용하여 쥐의 두피를 청소하십시오.
- 멸균 된 바늘 코 핀셋과 수술 가위를 사용하여 두피 조직을 잘라냅니다. 아래에 설명된 다양한 이식을 위한 공간을 만들기 위해 상당한 양의 조직을 제거하십시오.
- 살균 된 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골 표면을 부드럽게 청소하십시오. 그런 다음 과산화수소 3 %의 2-3 방울을 적용하여 람다와 브레그마를 식별하십시오.
- 스테레오탁스 또는 핸드 드릴(1.0mm, ~20,000rpm)을 사용하여 1.5mm 직경의 구멍을 브레그마에 2.5mm 전방으로 드릴링하고 3.5mm 측면을 브레그마로 드릴링합니다. 이 구멍에 나사(1.59mm O.D., 3.2mm 길이)를 부분적으로 이식합니다( 중간 정도, 제자리에 단단히 고정될 때까지). 열 손상을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 관개멸식 식염수식을 사용하는 것이 좋습니다.
- 기준 전극의 경우, 1.0mm 직경 구멍 1.5mm 전방 및 3.5mm 측면을 왼쪽 반구의 bregma에 드릴링합니다.
- 손으로, 이식 된 나사의 머리 주위에 및 머리 아래에 참조 와이어를 감싸면서,이 구멍에 기준 와이어의 ~ 2mm를 삽입합니다.
- 나사를 완전히 이식하여 기준 전극을 제자리에 고정시합니다.
- 오른쪽 반구에서, 1.5mm 직경 구멍 1.2 mm 전방 및 1.4 mm 측면 bregma에 드릴.
- 핀셋을 사용하여 듀라를 부드럽게 제거합니다.
- 자극전극의 경우 5.2mm 후방을 중심으로 한 사각형 구멍(전방 후방 2mm, 내측 측측)을 드릴링하고 1.0mm 측면으로 브레그마에 배치합니다.
- 스테레오전술 암 바를 사용하여 양극성 자극 전극/가이드 캐뉼라를 듀라 아래 5mm 아래로 낮춥춥시다. 전극이식 시 출혈이 있는 경우 멸균 면봉과 거즈를 사용하여 출혈을 최소화하십시오.
참고: 이 방법에 사용되는 양극성 자극 전극에는 가이드 캐뉼라(재료표)가미리 갖추어져 있습니다. 이 항목과 함께 사용되는 내부 캐뉼라는 가이드 캐뉼라에 완전히 삽입할 때 양극성 자극 전극의 갈래로 플러시되어야 합니다. 이렇게 하면 내부 캐뉼라가 약 1mm 떨어져 있는 자극제의 두 갈래 사이에 직접 앉을 수 있습니다. 유사한 프로토콜은 다른 곳에서설명된다 14. - 스테레오전술 암 바를 사용하여 듀라 아래 탄소 섬유 미세 전극을 4mm 낮춥춥시다. 이 위치는 줄무늬의 가장 등쪽 부분에 있습니다.
- 레퍼런스 와이어와 탄소 섬유를 강력한 iostat에 연결합니다.
- 60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분 동안 삼각형 파 형태(-0.4-1.3V, 400 V/s)를 적용합니다.
참고: 전형적으로, 뇌의 탄소 섬유 미세 전극에 파형을 적용할 때, 산화물 그룹은 탄소 섬유의 표면에 추가됩니다. 이 반응의 평형은 기록하기 전에 도달해야합니다; 그렇지 않으면 상당한 드리프트가발생합니다 19. 더 높은 주파수(60Hz)에서 전극을 사이클링하면 탄소 섬유가 평형을 더 빠르게 달성할 수 있습니다.
3. 탄소 섬유 최적화 및 자극 전극 /가이드 캐뉼라 위치
- 자극기를 설정하여 60Hz, 24펄스, 300 μA 전류 및 2ms/phase의 펄스 폭을 가진 양극성 전기 파형을 생성합니다.
- 자극기를 5mm에서 7.8mm로 0.2mm 단위로 부드럽게 낮춥시다. 각 증분에서 VTA를 자극합니다.
참고: 더 많은 등쪽 깊이 (5-6 mm)에서 뇌의 자극은 일반적으로 (시간의 ~ 80 %)는 쥐의 수염을 트위치로 유발합니다. 더 깊이에서, 수염은 두라 아래 7.5-8.2 mm 사이에서 발생하는 경련을 중단합니다. 수염이 경련을 멈추면 자극하는 전극이 VTA 에 가깝거나 VTA에 있을 것입니다. 이것은 모든 쥐에서 발생하지 않으며, 수염 경련의 부족은 양극성 자극 전극 / 주입 캐뉼라가 잘못 배치되어 있다는 표시로 받아들여서는 안됩니다. 수염 경련은 모든 마취제(예: 이소플루란)에 대해 발생하지 않을 수 있습니다. - 자극이 탄소 섬유 미세 전기 전극 (현재 등쪽 줄무늬)에서 완화 DA 방출을 생성 할 때까지 양극성 자극 전극 / 가이드 캐뉼라를 계속 낮춥니다.
참고: 등쪽 조각의 DA 방출은 양극성 전극이 VTA에 이식되는 경우 항상 발생하는 것은 아니지만 VTA 자극시 등쪽 점막에서 DA 방출을 관찰하는 것은 일반적으로 NAc 코어에서 좋은 신호가 관찰될 것이라는 좋은 신호이다. - 탄소 섬유 미세 전극을 듀라 아래 6.0mm 이상 될 때까지 낮춥다. 이것은 NAc 코어의 가장 등쪽 부분입니다.
- VTA를 자극하고 DA 피크의 피크 진폭을 기록합니다.
- 가장 큰 DA 방출을 생성하는 현장에서 탄소 섬유 마이크로 전극을 낮추거나 올립니다.
- DA 응답의 피크가 0.6V에서 명확한 산화 피크와 -0.2 V의 감소 피크인지 확인합니다. 이 피크는 DA를 나타냅니다.
4. 조합 주입 및 자극 FSCV 기록
참고: 그림 1은 VTA 마이크로인퓨전 전후에 기록할 타임라인을 보여 줍니다.
- 탄소 섬유와 자극 전극/가이드 캐뉼라 위치가 최적화되면 ~ 20-30 분 동안 자극하십시오.
참고: 현재 자극 매개 변수에서 3분마다 한 번 이상 자극하지 말고,22를다시 로드할 수 있도록 합니다. - 안정적인 기준선(<20% 변형)을 달성한 후, 양극성 자극기로 미리 장착된 가이드 캐뉼라에 손으로 내부 캐뉼라를 부드럽게 낮춥니다.
- 캐뉼라 삽입 자체가 호출된 신호의 변화를 일으키지 않도록 추가2-3 기준 기록을 가져 가라. 경우에 따라 내부 캐뉼라를 삽입하고 제거하면 VTA가 손상될 수 있습니다. 이 기준 기간(>20%)에 걸쳐 신호가 크게 변경되면 기준선이 다시 안정될 때까지 추가로 3-4 레코딩을 수행합니다.
- 주사기 펌프와 미세 주사기를 사용하여 0.5 μL의 용액(예: 0.9% 식염수, N-메틸-D-아스파르타트 [NMDA], (2R)-아미노-5-인포노발레산[AP5])을 VTA에 2분 동안 주입한다.
- 사후, 제거하기 전에 적어도 1 분 동안 내부 캐뉼라를 둡니다.
참고: 일부 약물은 약물 역학에 따라 더 긴 시간 동안 내부 캐뉼라를 떠나야 할 수 있으며, 내부 캐뉼라를 제거하면 약물이 내부 캐뉼라를 통해 다시 이동하게 될 수 있습니다. 우려가 있는 경우, 녹음 전체를 안내서 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 남길 수 있습니다. 그렇지 않으면 이 1분 간격 후에 레코딩이 시작될 수 있습니다. - 3분마다 계속 기록하여 사후 효과를 측정합니다.
참고: 제어 솔루션을 주입하고 효과가 관찰되지 않으면 두 번째10을주입할 수 있습니다. 내부 캐뉼라 또는 식염수 주입을 삽입하여 발생하는 변경된 DA 방출이 있는 경우 신호는 일반적으로 30분 이내에 기준선으로 복구됩니다.
5. 전극 배치의 조직학적 검증
- 실험이 끝나면 탄소 섬유 미세 전극을 사용하여 기록 현장에서 작은 병변을 생성합니다.
- 전극을 실험 후 교정을 위해 보존해야하는 경우, 모세관 끝을 넘어 ~ 100 μm 돌출 유리 모세관에 배치 텅스텐 와이어를 사용합니다. 이 경우, 뇌에서 전극을 올리고, 기록 전극을 텅스텐 전극으로 대체하고, 동일한 등소벤트랄 좌표로 낮춥니까.
참고: 탄소 섬유는 뇌를 병변하는 데 사용될 수 있으며 기록 부위의 위치를 보다 정확하게 나타낼 수 있습니다. 그러나, 실험자는 이러한 전극을 보정하는 능력을 잃게됩니다.
- 전극을 실험 후 교정을 위해 보존해야하는 경우, 모세관 끝을 넘어 ~ 100 μm 돌출 유리 모세관에 배치 텅스텐 와이어를 사용합니다. 이 경우, 뇌에서 전극을 올리고, 기록 전극을 텅스텐 전극으로 대체하고, 동일한 등소벤트랄 좌표로 낮춥니까.
- 레코딩 사이트를 병변하려면 전원 공급 장치를 사용하여 전압을 적용합니다. 1 V에서 시작하여 10V에 도달할 때까지 10초마다 1V씩 증가합니다.
- 펜토바르비탈 (150 mg/kg)의 치명적인 복막 주사를 사용하여 동물을 안락사시킵니다.
- 4% 포르말린 용액을 사용하여 쥐를 퍼퓨즈합니다.
- 날카로운 기요틴을 사용하여 쥐에서 머리를 제거합니다.
- rongeurs를 사용 하 여, 뇌를 둘러싼 결합 조직과 두개골을 제거 하 고 부드럽게 나머지 조직에서 뇌를 제거.
- 뇌를 1일 동안 4% 포르말린에 보관한 다음 30%의 자당으로 옮겨나세요.
참고 : 4 %의 포르말린을 가진 관류는 병변 부위를 볼 필요가 없지만 모범 사례로 병변 부위의 재건을 향상시킬 것입니다. - 저온을 사용하여 뇌의 30 μm 조각을 만듭니다.
- 슬라이드에 슬라이스를 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.
- 광 현미경을 사용하여 탄소 섬유 미세 전기 전하 병변 및 양극성 자극기 /주입 캐뉼라 위치의 위치를 나타냅니다.
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Representative Results
CIS-FSCV는 NAc 코어에서 phasic DA 방출을 구동하는 VTA N-메틸-D-아스파르타테 수용체(NMDAR), 니코티닉 아세틸콜린 수용체(nAChRs), 무스카리닉 아세틸콜린 수용체(mAChRs)의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 도 2는 음의 제어, 0.9% 식염수의 주입, 이전(기준선) 및 9분 후유혈(식염수)에 대한 대표적인 데이터를 나타낸다. 도 2는 y축, x축의 시간, z축의 시간 및 전류(거짓 색으로 표현됨)를 나타내는 색상 플롯을 나타내며, 현재 대 시간 추적(IvT)에, 그리고 피크에서 촬영한 순환 형 voltammogram은 DA에 해당한다는 것을 입증한다. 예상대로, 식염수 주입자극된 Phasic DA 방출을 변경하지 않았다.
CIS-FSCV가 작용제와 길항제를 사용할 때 양방향 효과를 생성할 수 있음을 입증하기 위해 NMDAR 작용제, NMDA (500 ng) 주입효과를 비교했습니다. 도 3A)NMDAR 길항제, AP5 (1 μg; 그림 3B). NMDA의 주입은 자극된 면책 DA방출(도 3A,주입 후 9분)의 견고한 증가를 일으켰으며, NMDAR 경쟁적 길항제인 AP5(1 μg)는 강력한 감소(도3B,주입 후 9분)를 생성하였다. CIS-FSCV의 유용성을 입증하기 위해 아세틸콜린 수용체의 상이한 클래스를 표적으로 하는 길항제를 사용하여, 우리는 비선택적, 비경쟁적 nAChR 길항제 메카밀라민의 주입효과를 비교했다(3 μg; 도 4A)및 비선택적, 경쟁mAChR 길항제 스코폴라민 (67 μg; 그림 4B). 두 약물 모두 자극된 Phasic DA 방출에서 강력한 감소를 일으켰습니다(그림4,9분 후주입). 도 2, 도 3및 도 4의 결과에 대한 요약은 5번 자극을 통해 기준기간을 평균하고 약물 기간이 기준평균의 백분율로 표시되는 도 5에서다시 플로팅된다.
그림 1: VTA 미세 주입 전후 녹음 을 위한 타임라인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단일 남성 스프라그 Dawley 쥐에서 NAc 코어에서 자극된 Phasic DA 방출에 대한 기준선(왼쪽)과 식염수(차량) 주입(오른쪽)의 대표적인 색상 및 IvT 플롯. 파란색 막대는 자극을 나타냅니다. 기준선 기록은 양극성 자극기의 가이드 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 배치하기 전에 t = 0에서 발생합니다. 식염수 레코딩은 9분(t = 9) 후주입을 촬영하였다. 순환 볼탐모그램 인셋은 IvT 플롯의 피크에 대응하여 0.6 V에서 피크 산화및 -0.2 V의 피크 감소를 나타내며 DA를 나타냅니다. 식염수 VTA 주입 후에 자극된 방출에 있는 변경은 관찰되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NMDAR 작용제(NMDA) 및 길항제(AP5)의 주입 효과. (A)단일 남성 스프라그 Dawley 쥐에서 NAc 코어에서 자극된 단계적 DA 방출에 대한 NMDAR 작용제 주입(오른쪽)의 대표적인 색상 및 IvT 플롯(왼쪽)과 500 ng. NMDA 주입 증가 자극 Phasic DA 릴리스 (기록 촬영 9 분 후 주입). (B)대표적인 색상과 IvT 플롯의 기준선(왼쪽) 및 NMDAR 길항제(2R)-아미노-5-인포노발레산(AP5)의 주입은(오른쪽) 단일 남성 스프라그 다울리 쥐에서 NAc 코어에서 NAc 코어에서 방출된다. AP5 주입 자극 된 Phasic DA 릴리스 감소 (기록 촬영 9 분 후 주입). 기준선 기록은 양극성 자극기의 가이드 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 배치하기 전에 t = 0에서 발생했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 메카밀라민과 스코폴라민의 주입 효과. (A)단일 남성 스프라그 다울리 쥐에서 NAc 코어에서 자극된 Phasic DA 방출에 비선택적 니코티닉 아세틸콜린 수용체 길항제 메카밀라민(MEC)의 주입은(오른쪽)의 기준선(왼쪽)과 3μg의 대표적인 색상 및 IvT 플롯. (B)단일 남성 스프라그 다울리 쥐에서 NAc 코어에서 자극된 Phasic DA 방출에 비선택적 무스카린 수용체 길항제 스코폴라민(SCOP)의 대표적인 색상 및 IvT 플롯(왼쪽) 및 67 μg. 기준선 레코딩은 양극성 자극기의 가이드 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 배치하기 전에 t = 0에서 발생했습니다. MEC와 SCOP 녹음은 9분 후 포퓨전을 촬영했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 시간이 지남에 따라 약물 효과를 보여주는 데이터 요약. 주입 전 기간(baseline)은 5가지 자극을 통해 평균화되었고, 사후 주입 기간(t =3부터 시작)은 기준선 백분율로 제시된다. 9분 후주입에서, 우리는 퇴신한 DA 신호가 식염수 주입 후 기준선 103%, NMDA 주입 후 196%, AP5 주입 후 18%, MEC 주입 후 49%, SCOP 주입 후 43%가 것으로 나타났습니다. n = 조건당 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출의 기본 VTA 수용체 메커니즘을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 적절한 레코딩을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 호출된 DA 신호에서 약간의 드리프트와 함께 안정적인 기준선 레코딩을 달성해야 합니다. 안정적인 레코딩을 구축할 가능성을 높이는 중요한 방법은 전극이 60Hz와 10Hz 모두에서 사이클링할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하는 것입니다(일반적으로 60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분). 탄소 섬유가 순환됨에 따라 탄소 섬유 자체가 산화되어 에칭되어 표면적을 감소시켰지만 도파민흡착(23)에대한 새로운 표면을 생성한다. 이로 인해 DA에 대한 민감도가 증가할 수 있습니다. 따라서, 하나는 이 증가 에칭으로 인해 실험에 시간이 지남에 자극 도파민 릴리스에 약간의 증가를 볼 수 있습니다. 또한 초기 마취의 90~120분 이내에 녹음을 시작하면 장시간 안정적인 레코딩이 발생할 가능성이 높아집니다. 이와 같이, 쥐가 마취로 인한 죽음에 가까워지기 때문에, e불러온 DA 방출이 천천히 감소하는 것이 일반적이다.
이 절차의 두 번째 중요한 단계는 주입 캐뉼러가 양극 자극 전극에 부드럽게 삽입되도록하는 것입니다. 입체 암바는 내부 캐뉼라를 삽입하는 동안 너무 많은 압력을 가하면 움직일 수 있으며, 그 결과 자극 부위가 다를 수 있기 때문에 도파민 신호가 인위적으로 증가하거나 감소할 수 있습니다. 캐뉼라 삽입 후 호출된 신호에 상당한 변화가 있는 경우 새 기준 기간을 설정해야 합니다. 더욱이, 내부 캐뉼라 또는 차량 주입을 삽입하여 발생하는 DA 방출이 변경되면, 신호는 일반적으로 30분 이내에 기준선으로 회복된다. DA 방출이 차량 주입에 광범위하게 변경되면 주입 속도 또는 부피가 감소될 수 있습니다. 조사관은 또한 캐뉼라 자체의 삽입이 릴리스를 변경할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 주입 전에 내부 캐뉼라를 삽입 한 후 추가 기록을 수행 할 수 있습니다. 이와 관련, 주입이 발생했는지, 내부 캐뉼라의 봉쇄가 없는지 확인하는 것이 중요하다. 이를 수행하는 한 가지 방법은 주입 튜브에 작은 거품을 만들고 펜이나 마커로 표시하는 것입니다. 거품은 주입 후 마커에서 더 멀리 떨어져 있어야합니다. 주입이 제대로 발생했는지 확인하는 또 다른 방법은 내부 캐뉼라가 뇌에서 제거된 후 주입 펌프를 켜고, 끝에 형성되는 해결책이 여전히 있는 경우 성공적인 주입이 발생할 가능성이 있습니다.
CIS-FSCV는 행동적으로 순진하고 훈련된 동물 모두에서 VTA 수용체를 연구하여 시간이 지남에 따라 수용체 기능의 변화를 연구하도록 조정할 수 있다11. CIS-FSCV는 또한 5-HT 및 노르에피네프린(NE)24,25를측정하도록 수정될 수 있다. CIS-FSCV는 또한 깨어 있는, 행동 실험에 매우 적합하며 광유전학적접근법(26,27)과통합될 수 있다. 전기적으로 방출되는 릴리스 이벤트는 자유 이동 연구에서 자주 관찰되는 일시적인 릴리스 이벤트와 구별되며 마취 된 준비에서는 덜 자주 관찰됩니다. 과도 방출 이벤트는, 예를 들어, 전기적으로 불러일으킨 방출이벤트(28)와달리 도파민 뉴런의 직접 탈극화에 의해 반드시 구동되지 않을 수 있다. 이와 같이, 면질 신경 활동은 FSCV를 통해 검출된 도파민 방출 사건에서 해리될 수 있습니다. 더욱이, 광학적으로 연상되는 DA 릴리스는 전기적으로 불러온 DA 릴리스 이벤트와 는 다른 것으로 나타났다. 광학적으로 와 전기적으로 자극을 비교한 결과, 전기적으로 자극을 받는 자극은 단계적 DA 방출의 다중 시냅스 조절을 생성하는 반면, 광학적으로 자극을 유발하면 자극이 보다 구체적인회로(29)로자극을 제한할 수 있음을 알 수 있다.
몇몇 최근 접근은 생체 내 급속한 도파민 역학의 근본적인 회로를 조사하기 위하여 optogenetic 및 형광 방법을 채택했습니다30. 예를 들어, Sun 및 동료에 의한 최근 연구에 의하면, 실질적인 니그라에서 도파민 뉴런의 광유전학적 자극이 G-단백질 결합 수용체 활성화 기반 DA(GRABDA)센서(GRABDA)의 발현을 통해 측정된 바와 같이, 줄무늬에서 DA의 급속한 고도를 생성한다는 것을 보여주었다. 결합된 광유전학 및 형광 접근법은 NAc에서 DA 방출을 측정하는 동안 VTA에 특정 흡개 입력을 자극하거나 억제하는 데 사용될 수 있었습니다. CIS-FSCV는 광유전학 자극으로 구체적으로 흡인을 자극할 수 없지만 VTA 내의 사전 시냅스 및 포스트냅틱 수용체에 대한 질문을 해결할 수 있다는 점에서 장점이 있습니다. 형광 및 FSCV 접근법 은 모두 Phasic DA 릴리스30,31의변화를 비교적 측정하기 위해 충분한 시간적 해상도 (subsecond)와 DA (1-10 nM)에 대한 민감성을 가지고 있지만, FSCV가 생체 내에서 단계적 DA의 형광 모니터링을 통해 가질 수있는 한 가지 장점은 기록에 대한 유전 조작이 필요하지 않다는 것입니다. 실제로 CIS-FSCV 실험은 몇 시간 내에 완료될 수 있지만 결합된 광유전학 및 형광 접근법은 바이러스 구조를 사용하여 충분한 발현을 위한 충분한 시간(주)이 필요합니다.
CIS-FSCV의 주요 이점은 Phasic DA 방출의 특정 VTA 수용체 조절이 그대로 뇌에서 연구될 수 있다는 것입니다, VTA 뉴런의 전기생리학적 특성을 측정하는 생체 내 연구 또는 phasic DA릴리스3,12의사전 시냅스 조절을 평가하는 생체 내 연구를 기반으로 합니다. CIS-FSCV의 한 가지 주의 사항은 이러한 녹음이 상대적으로 DA가 풍부한 지역에서 수행해야 한다는 것입니다. 이것은 두 가지 이유로: 첫째, FSCV 감도에 몇 가지 제한이 있다, 이는 단지 나노 몰러 범위와 이상 에서 DA 농도를 감지 할 수있습니다 6,19. 둘째, FSCV는 그들의 순환 voltammograms가 거의 동일하기 때문에, DA에서 노르를 해리하는 문제가 있습니다. 따라서, 이들 연구는 내측 전두엽 피질, NAc, striatum 및 후각결핵(32)의일부 부분과 같은 높은 DA를 가진 지역을 평가하는 것으로 제한될 수 있다. 미래 연구는 DA와 NE 사이 더 나은 차별을 허용하는 진보 FSCV 접근의 몇몇을 채택할 수 있을 지도 모릅니다, 뿐만 아니라 아데노신 과 같은 그밖 전기활성 신경 전달물질(33 및 세로토닌12).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
작업은 엘리자베스 타운 대학 (R.J.W, M.L., 그리고 L.M.), NSF 대학원 펠로우십 (R.J.W.) 및 예일 의과 대학 (N.A.)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
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