Summary
Het doel van dit protocol is om ventrale tegmentale gebiedsreceptoren direct te manipuleren om hun bijdrage aan subseconde dopamine-afgifte te bestuderen.
Abstract
Fasische dopamine (DA) afgifte van het ventrale tegmentale gebied (VTA) naar de nucleus accumbens speelt een cruciale rol bij beloningsverwerking en reinforcement learning. Begrijpen hoe de diverse neuronale inputs in de VTA-controlefasische DA-release een beter beeld kunnen geven van de circuits die beloningsverwerking en reinforcement learning regelen. Hier beschrijven we een methode die intra-VTA canule-infusies van farmacologische agonisten en antagonisten combineert met stimulatie-opgeroepen fasische DA-afgifte (gecombineerde infusie en stimulatie, of CIS) zoals gemeten door in vivo fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV). Met behulp van CIS-FSCV bij verdoofde ratten kan een fasische DA-respons worden opgeroepen door de VTA elektrisch te stimuleren met een bipolaire elektrode uitgerust met een canule tijdens het opnemen in de nucleus accumbens-kern. Farmacologische agonisten of antagonisten kunnen direct op de stimulatieplaats worden toegediend om de rol van specifieke VTA-receptoren bij het stimuleren van fasische DA-afgifte te onderzoeken. Een groot voordeel van CIS-FSCV is dat de VTA-receptorfunctie in vivo kan worden bestudeerd, voortbouwend op in vitro studies.
Introduction
Fasische dopamine (DA) afgifte van het ventrale tegmentale gebied (VTA) naar de nucleus accumbens (NAc) speelt een vitale rol in beloningsgerelateerd gedrag. VTA DA-neuronen schakelen over van een tonisch-achtige vuren (3-8 Hz) naar een burst-achtige vuren (>14 Hz)1, die fasische DA-afgifte in de NAc produceert. De VTA drukt een verscheidenheid aan somatodendritische receptoren uit die goed gepositioneerd zijn om de omschakeling van tonisch naar burst-firing2,3,4,5te regelen. Het identificeren van welke van deze receptoren, en hun respectieve ingangen, de fasische DA-afgifte regelen, zal ons begrip van hoe de beloningsgerelateerde circuits zijn georganiseerd, verdiepen. Het doel van de hier beschreven methodologie, gecombineerd met infusie en stimulatie met fast-scan cyclische voltammetrie (CIS-FSCV), is om snel en robuust de functionaliteit van VTA-receptoren bij het aansturen van fasische DA-afgifte te beoordelen.
De term gecombineerde infusie en stimulatie (CIS) verwijst naar het farmacologisch manipuleren van receptoren op een groep neuronen (hier de VTA) en het stimuleren van die neuronen om de functie van de receptor te bestuderen. Bij de verdoofde rat stimuleren we elektrisch de VTA om een groot fasisch DA-signaal (1-2 μM) in de NAc-kern op te roepen, zoals gemeten door fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV). Infusies van farmacologische geneesmiddelen (d.w.z. receptoragonisten / antagonisten) op de stimulatieplaats kunnen worden gebruikt om de functie van VTA-receptoren te meten door de daaropvolgende verandering in de opgeroepen fasische DA-afgifte te observeren. FSCV is een elektrochemische benadering die zowel een hoge ruimtelijke (50-100 μm) als temporele (10 Hz) resolutie heeft, en is zeer geschikt om beloningsgerelateerde, faseuze DA-gebeurtenissen6,7te meten. Deze resolutie is fijner dan andere in vivo neurochemische metingen, zoals microdialyse. Dus, samen, CIS-FSCV is zeer geschikt om VTA receptor regulatie van fasische dopamine afgifte te beoordelen.
Een veel voorkomende manier om de VTA-receptorfunctie te onderzoeken, is door een combinatie van elektrofysiologische benaderingen te gebruiken die aanpakken hoe die receptoren de vuursnelheid van neuronenveranderen 1,8. Deze studies zijn zeer waardevol om te begrijpen welke receptoren betrokken zijn bij het aansturen van DA-vuur bij activering. Deze studies kunnen echter alleen suggereren wat er stroomafwaarts zou kunnen gebeuren bij de axonterminal (d.w.z. afgifte van een neurotransmitter). CIS-FSCV bouwt voort op deze elektrofysiologische studies door te antwoorden hoe de output van VTA burst-firing, fasische DA-afgifte, wordt gereguleerd door receptoren op VTA-dendrieten en cellichamen. CIS-FSCV is dus zeer geschikt om voort te bouwen op deze elektrofysiologische studies. Als voorbeeld, nicotinereceptoractivatie kan burst-firing induceren in de VTA9,en CIS-FSCV in de verdoofde rat werd gebruikt om aan te tonen dat nicotine-acetylcholinereceptor (nAChR) activering in de VTA ook fasische DA-afgifte in de NAc10,11regelt.
Mechanistisch onderzoek van fasische DA-regulatie wordt ook vaak bestudeerd met behulp van plakpreparaten naast het in bad brengen van geneesmiddelen. Deze studies richten zich vaak op de presynaptische regulatie van fasische DA-afgifte uit dopamineterminals, omdat de cellichamen vaak uit de plak12worden verwijderd . Deze preparaten zijn waardevol voor het bestuderen van presynaptische receptoreffecten op dopamineterminals, terwijl CIS-FSCV beter geschikt is om somatodendritische receptoreffecten op dopamineneuronen te bestuderen, evenals presynaptische inputs voor de VTA. Dit onderscheid is belangrijk, omdat somatodendritische receptoractivering in de VTA een ander effect kan hebben dan NAc presynaptische receptoractivering. Inderdaad, het blokkeren van dopaminerge presynaptische nAChRs in de NAc kan de fasische dopamineafgifte tijdens burst-firing13verhogen, terwijl het tegenovergestelde waar is bij VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV is een ideale aanpak voor het bestuderen van het vermogen van VTA-receptoren om de fasische DA-afgifte te reguleren. Belangrijk is dat deze aanpak kan worden uitgevoerd bij een intacte rat, verdoofd of vrij bewegend. Deze aanpak is geschikt voor acute studies, om de receptorfunctie in de uitgangstoestand10,14 tebestuderen,evenals langetermijnstudies die functionele veranderingen in een receptor kunnen beoordelen na blootstelling aan geneesmiddelen of gedragsmanipulatie11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door zowel Elizabethtown College als Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dit protocol is specifiek voor de verdoofde rattenpreparaat van het gebruik van CIS-FSCV.
1. Prechirurgische preparaten
- Bereiding van elektrode-oplossing
- Om de elektrode-opvuloplossing te maken, bereidt u een oplossing van 4 M kaliumacetaat met 140 mM kaliumchloride16.
- Elektrode voorbereiding
- Plaats met behulp van vacuümafzuiging een T-650 koolstofvezel (7 μm in diameter) in een borosilicaatglascapillair (lengte = 100 mm, diameter = 1,0 mm, binnendiameter = 0,5 mm).
- Zodra de koolstofvezel in het glazen capillair is geplaatst, plaatst u het glazen capillair in een verticale elektrodetrekker, met het warmte-element ongeveer in het midden van het capillair. Zet de kachel op 55 met de magneet uitgeschakeld.
- Nadat het capillair is getrokken, tilt u de bovenste capillaire houder voorzichtig op zodat de punt van de elektrode niet wordt omgeven door het verwarmingselement.
- Knip met een scherpe schaar de koolstofvezel die nog steeds de twee stukken van het capillair verbindt. Dit zal resulteren in twee afzonderlijke koolstofvezel micro-elektroden.
- Snijd onder een lichtmicroscoop voorzichtig de blootgestelde koolstofvezel met een scherp scalpel, zodat de koolstofvezel ongeveer 75-100 μm voorbij het uiteinde van het glas reikt.
- Zorg er met een lichtmicroscoop voor dat de elektrode vrij is van scheuren langs het capillair. Zorg er ook voor dat de afdichting, waar de koolstofvezel het capillair verlaat, moeilijk op te merken is en vrij van scheuren.
OPMERKING: Een goede afdichting helpt ruis tijdens opnames te verminderen. Zie gepubliceerde studies17,18,19 voor een meer gedetailleerd protocol.
- Referentie elektrode fabricage
- Soldeer een gouden speld aan een zilverdraad van 5 cm.
- Bevestig de anode aan een metalen paperclip of andere geleider, de kathode aan een pin en breng een spanning (~ 2 V) aan terwijl de paperclip en zilverdraad worden ondergedompeld in 0,1 M HCl.
- Stop de spanning zodra een witte coating (AgCl) op de zilverdraad verschijnt.
- Elektrode voorbereiden voor implantatie
- Soldeer een gouden pin aan een dunne geïsoleerde draad (~ 10 cm lang, <0,50 mm diameter).
- Verwijder ~5 cm isolatie van de draad tegenover de gouden pin.
- Vul de elektrode ongeveer halverwege met elektrodeoplossing.
- Steek geïsoleerde draad in de elektrode.
OPMERKING: De draad moet contact maken met de koolstofvezel in de elektrode.
2. Elektrode-implantaties
- Geef volwassen, mannelijke, Sprague Dawley-ratten (250−450 g) een intraperitoneale injectie (1,5 g/kg of 1 ml/kg volume) van 0,5 g/ml urethaan opgelost in steriele zoutoplossing. Begin met een initiële dosis urethaan van 1,0−1,2 g/kg. Als het dier 20 minuten na toediening van urethaan nog steeds reageert op de schadelijke stimulustest (staartknijpen), dien dan nog eens 0,3−0,5 g/kg urethaan toe voor een totale dosis van 1,5 g/kg.
OPMERKING: Voeg voor de bereiding van de 0,5 g / ml urethaanoplossing 10 g urethaan toe aan 10 g (~ 10 ml) zoutoplossing. Urethaan is kankerverwekkend en moet met zorg worden behandeld. Urethaan is een belangrijk verdovingsmiddel, omdat het de niveaus van dopamine niet verandert, net als andere anesthetica zoals ketamine / xylazine en chloraalhydraat20,21. - Zodra het dier diep verdoofd is en niet reageert op schadelijke stimuli (bijv. Teen knijpen), plaatst u het in het stereotaxische frame. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op elk oog van de rat.
OPMERKING: Dit is een niet-overlevingsoperatie, maar een goede aseptische techniek wordt aangemoedigd. - Reinig de hoofdhuid van de rat met een tweetraps scrub (d.w.z. een iodopovidone scrub gevolgd door een 70% ethanol scrub; voer uit met een 3 cyclus herhaling).
- Knip het hoofdhuidweefsel weg met behulp van een gesteriliseerd naaldneuspincet en een chirurgische schaar. Verwijder een aanzienlijke hoeveelheid weefsel om ruimte te maken voor de verschillende implantaties die hieronder worden beschreven.
- Reinig het schedeloppervlak voorzichtig met gesteriliseerde wattenstaafjes. Breng vervolgens 2−3 druppels 3% waterstofperoxide aan om de lambda en bregma te helpen identificeren.
- Boor met behulp van een stereotaxische of handboor (1,0 mm, ~ 20.000 tpm) een gat met een diameter van 1,5 mm 2,5 mm voor de bregma en 3,5 mm lateraal voor de bregma. Implanteer gedeeltelijk (ongeveer halverwege, totdat deze stevig op zijn plaats zit) een schroef (1,59 mm O.D., 3,2 mm lang) in dit gat. Het wordt aanbevolen om steriele zoutoplossing te gebruiken om te irrigeren tijdens het boren om thermisch letsel te voorkomen.
- Boor voor de referentie-elektrode een gat met een diameter van 1,0 mm 1,5 mm vooraan en 3,5 mm lateraal naar de bregma, in de linkerhersenhelft.
- Steek met de hand ~ 2 mm referentiedraad in dit gat, terwijl u de referentiedraad rond en onder de kop van de geïmplanteerde schroef wikkelt.
- Implanteer de schroef volledig en pin de referentie-elektrode op zijn plaats.
- Boor in de rechterhersenhelft een gat met een diameter van 1,5 mm 1,2 mm vooraan en 1,4 mm lateraal naar de bregma.
- Verwijder de dura voorzichtig met een pincet.
- Boor voor de stimulerende elektrode een vierkant gat (2 mm voor-achter, 5 mm mediaal-lateraal) gecentreerd op 5,2 mm achter en 1,0 mm lateraal naar de bregma.
- Gebruik de stereotactische armstaven om de bipolaire stimulerende elektrode/geleidingscanule 5 mm onder de dura te laten zakken. In geval van bloedingen tijdens de implantatie van de elektrode, gebruik steriele wattenstaafjes en gaas om bloedingen te minimaliseren.
OPMERKING: De bipolaire stimulerende elektrode die bij deze methode wordt gebruikt, is vooraf uitgerust met een geleidingscanule(Table of Materials). De interne canule die bij dit item wordt gebruikt, moet worden gespoeld met de pinnen op de bipolaire stimulerende elektrode wanneer deze volledig in de geleidingscanule wordt ingebracht. Hierdoor kan de interne canule direct tussen de twee tanden van de stimulator zitten, die ongeveer 1 mm uit elkaar zitten. Een soortgelijk protocol wordt elders beschreven14. - Gebruik de stereotactische armstaven om de koolstofvezel micro-elektrode 4 mm onder de dura te laten zakken. Deze locatie is op het meest dorsale deel van het striatum.
- Sluit de referentiedraad en koolstofvezel aan op een potentiostaat.
- Breng een driehoekige golfvorm (-0,4−1,3 V, 400 V/s) aan gedurende 15 minuten bij 60 Hz en opnieuw gedurende 10 minuten bij 10 Hz.
OPMERKING: Typisch, bij het toepassen van golfvormen op koolstofvezel micro-elektroden in de hersenen, worden oxidegroepen toegevoegd aan het oppervlak van de koolstofvezel. Het evenwicht van deze reactie moet worden bereikt voordat deze wordt geregistreerd; anders zal er een significante drift optreden19. Door de elektrode op hogere frequenties (60 Hz) te laten draaien, kan de koolstofvezel sneller een evenwicht bereiken.
3. Het optimaliseren van koolstofvezel en het stimuleren van elektrode / gids canule locaties
- Stel de stimulator in om een bipolaire elektrische golfvorm te produceren, met een frequentie van 60 Hz, 24 pulsen, 300 μA stroom en pulsbreedte van 2 ms / fase.
- Laat de stimulator voorzichtig zakken in stappen van 0,2 mm van 5 mm tot 7,8 mm onder de dura. Stimuleer bij elke stap de VTA.
OPMERKING: Op meer dorsale diepten (5−6 mm) zal stimulatie van de hersenen meestal (~ 80% van de tijd) ervoor zorgen dat de snorharen van de rat trillen. Op verdere diepten zullen de snorharen stoppen met trillen, wat gebeurt tussen 7,5−8,2 mm onder de dura. Wanneer de snorharen stoppen met trillen, zal de stimulerende elektrode in de buurt van of bij de VTA zijn. Dit zal niet bij elke rat voorkomen en het ontbreken van snorharen mag niet worden opgevat als een teken dat de bipolaire stimulerende elektrode / infusiecanule misplaatst is. Whisker twitching kan niet optreden voor alle anesthetica (bijv. Isofluraan). - Blijf de bipolaire stimulerende elektrode / geleidingscanule verlagen totdat een stimulatie fasische DA-afgifte produceert bij de koolstofvezelmicro-elektrode (momenteel in het dorsale striatum).
OPMERKING: DA-afgifte in het dorsale striatum zal niet altijd optreden als de bipolaire elektrode in de VTA wordt geïmplanteerd, maar observatie van DA-afgifte in het dorsale striatum bij VTA-stimulatie is meestal een goed teken dat een goed signaal zal worden waargenomen in de NAc-kern. - Laat de koolstofvezel micro-elektrode zakken totdat deze ten minste 6,0 mm onder de dura ligt. Dit is het meest dorsale deel van de NAc-kern.
- Stimuleer de VTA en noteer de piekamplitude van de DA-piek.
- Verlaag of verhoog de koolstofvezelmicro-elektrode op de plaats die de grootste DA-afgifte produceert.
- Zorg ervoor dat de piek van de DA-respons een duidelijke oxidatiepiek is bij 0,6 V en een reductiepiek bij -0,2 V. Deze pieken zijn indicatief voor DA.
4. Combinatie infusie en stimulatie FSCV opname
OPMERKING: Figuur 1 toont de tijdlijn voor opname voor en na VTA-micro-infusie.
- Zodra de koolstofvezel en stimulerende elektrode / geleide canule locatie is geoptimaliseerd, stimuleer gedurende ~ 20−30 min.
OPMERKING: Onder de huidige stimulatieparameters, stimuleer niet meer dan eens per 3 minuten, om vesiculaire herlading mogelijk te maken22. - Na het bereiken van een stabiele uitgangswaarde (
- Neem een extra 2−3 basislijnopnamen om ervoor te zorgen dat het inbrengen van de canule zelf geen verandering in het opgeroepen signaal veroorzaakte. In sommige gevallen kan het inbrengen en verwijderen van de interne canule schade aan de VTA veroorzaken. Als het signaal drastisch verandert gedurende deze basislijnperiode (>20%), neem dan nog eens 3−4 opnames totdat de basislijn zich stabiliseert.
- Injecteer met behulp van een spuitpomp en microsyringe 0,5 μL oplossing (bijv. 0,9% zoutoplossing, N-methyl-D-aspartaat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovalerzuur [AP5]) in de VTA gedurende een periode van 2 minuten.
- Laat na de infusie de inwendige canule minstens 1 minuut staan voordat u deze verwijdert.
OPMERKING: Sommige geneesmiddelen kunnen vereisen dat de interne canule voor een langere tijd wordt verlaten op basis van de kinetiek van het geneesmiddel, en verwijdering van de interne canule kan ertoe leiden dat het medicijn terug naar boven reist via de interne canule. Als er bezorgdheid is, kan men de interne canule gedurende de hele opname in de gidscanule laten. Anders kan de opname beginnen na dit interval van 1 minuut.- Blijf elke 3 minuten opnemen om postinfusie-effecten te meten.
OPMERKING: Als een controleoplossing wordt toegediend en er geen effect wordt waargenomen, is het mogelijk om een tweede keer te infunderen10. Als er een veranderde DA-afgifte is veroorzaakt door het inbrengen van de interne canule of zoutoplossinginfusie, herstelt het signaal zich meestal binnen 30 minuten tot baseline.
5. Histologische verificatie van de plaatsing van de elektrode
- Maak aan het einde van het experiment een kleine laesie op de opnameplaats met behulp van de koolstofvezelmicro-elektrode.
- Als de elektrode moet worden bewaard voor kalibratie na de ervaring, gebruik dan een wolfraamdraad die in een glazen capillair is geplaatst en ~ 100 μm voorbij de capillaire punt uitsteekt. Til in dit geval de elektrode uit de hersenen op, vervang de opname-elektrode door de wolfraamelektrode en verlaag deze naar dezelfde dorsoventrale coördinaat.
OPMERKING: De koolstofvezel kan ook worden gebruikt om de hersenen te laesie en zal een nauwkeurigere weergave geven van de locatie van de opnameplaats; de experimentator verliest echter het vermogen om deze elektroden te kalibreren.
- Als de elektrode moet worden bewaard voor kalibratie na de ervaring, gebruik dan een wolfraamdraad die in een glazen capillair is geplaatst en ~ 100 μm voorbij de capillaire punt uitsteekt. Til in dit geval de elektrode uit de hersenen op, vervang de opname-elektrode door de wolfraamelektrode en verlaag deze naar dezelfde dorsoventrale coördinaat.
- Om de opnameplaats te laeseren, past u spanning toe met behulp van een voeding. Begin bij 1 V en verhoog elke 10 s met 1 V totdat 10 V is bereikt.
- Euthanaseer het dier met behulp van een letale intraperitoneale injectie van pentobarbital (150 mg / kg).
- Perfuseer de rat met behulp van een 4% formaline-oplossing.
- Verwijder de kop van de rat met behulp van een geslepen guillotine.
- Verwijder met behulp van rongeurs het bindweefsel en de schedel rond de hersenen en maak de hersenen voorzichtig los van het resterende weefsel.
- Bewaar de hersenen gedurende 1 dag in 4% formaline en breng het vervolgens over naar 30% sucrose.
OPMERKING: Perfusie met 4% formaline is niet nodig om de laesieplaats te zien, hoewel het als een best practice de reconstructie van de laesieplaats zal verbeteren. - Maak 30 μm plakjes van de hersenen met behulp van een cryostaat.
- Monteer de plakjes op dia's en dek af met een afdekslip.
- Geef de locatie van de koolstofvezel micro-elektrode laesie en bipolaire stimulator / infusie canule locatie met behulp van een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV werd gebruikt om de functie van VTA N-methyl-D-aspartaatreceptoren (NMDAR), nicotine-acetylcholinereceptoren (nAChRs) en muscarine-acetylcholinereceptoren (mAChRs) te bestuderen bij het aansturen van fasische DA-afgifte in de NAc-kern. Figuur 2 toont representatieve gegevens voor een negatieve controle, infusie van 0,9% zoutoplossing, vóór (baseline) en 9 min postinfusie (zoutoplossing). Figuur 2 toont een kleurplot met potentiaal op de y-as, tijd op de x-as en stroom (weergegeven als valse kleur) op de z-as, stroom versus tijdsporen (IvT), evenals een cyclisch voltammogram genomen op de piek opgeroepen respons om aan te tonen dat de gemeten analyt overeenkomt met DA. Zoals verwacht veranderde zoutoplossinginfusie de gestimuleerde fasische DA-afgifte niet.
Om aan te tonen dat CIS-FSCV bidirectionele effecten kan produceren bij het gebruik van agonisten en antagonisten, vergeleken we de effecten van infusie van de NMDAR-agonist, NMDA (500 ng; Figuur 3A) naar de NMDAR-antagonist, AP5 (1 μg; Figuur 3B). Infusie van NMDA veroorzaakte een robuuste toename van de gestimuleerde fasische DA-afgifte(figuur 3A,9 min na infusie), terwijl de NMDAR-competitieve antagonist, AP5 (1 μg), een robuuste afname produceerde(figuur 3B,9 min na infusie). Om het nut van CIS-FSCV aan te tonen met behulp van antagonisten die zich richten op verschillende klassen van acetylcholinereceptoren, vergeleken we de effecten van infusie van de niet-selectieve, niet-competitieve nAChR-antagonist mecamylamine (3 μg; Figuur 4A) en de niet-selectieve, concurrerende mAChR-antagonist scopolamine (67 μg; Figuur 4B). Beide geneesmiddelen produceerden robuuste dalingen in gestimuleerde fasische DA-afgifte(figuur 4,9 min postinfusie). Een samenvatting van de resultaten uit figuur 2, figuur 3en figuur 4 is weergegeven in figuur 5,waar de basislijnperiode wordt gemiddeld over vijf stimulaties en de drugsperiode wordt weergegeven als een percentage van het basisgemiddelde.
Figuur 1: Tijdlijn voor opname voor en na VTA-micro-infusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve kleur- en IvT-plots van baseline (links) en zoutoplossing (medium) infusie (rechts) bij gestimuleerde fasische DA-afgifte in de NAc-kern bij een enkele mannelijke Sprague Dawley-rat. Blauwe balk staat voor stimulatie. De baseline-registratie vindt plaats bij t = 0, voordat de interne canule in de geleidecanule in de bipolaire stimulator werd geplaatst. De zoutoplossing werd 9 minuten (t = 9) na de injectie genomen. Cyclische voltammograminzetstukken komen overeen met de piek van de IvT-plots en tonen een piekoxidatie bij 0,6 V en piekreductie bij -0,2 V, indicatief voor DA. Er mag geen verandering in gestimuleerde opgeroepen afgifte worden waargenomen na infusie met VTA met zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effecten van infusie van de NMDAR-agonist (NMDA) en antagonist (AP5). ARepresentatieve kleur- en IvT-plots van baseline (links) en 500 ng van de NMDAR-agonistinfusie (rechts) bij gestimuleerde fasische DA-afgifte in de NAc-kern bij een enkele mannelijke Sprague Dawley-rat. NMDA-infusie verhoogde gestimuleerde fasische DA-afgifte (opname 9 min postinfusie). (B)Representatieve kleur- en IvT-plots van baseline (links) en 1 μg van de NMDAR-antagonist (2R)-amino-5-fosfonovaleric acid (AP5) infusie (rechts) bij gestimuleerde fasische DA-afgifte in de NAc-kern bij een enkele mannelijke Sprague Dawley-rat. AP5-infusie verminderde gestimuleerde fasische DA-afgifte (opname 9 min postinfusie). De baseline-opnames vonden plaats bij t = 0, voordat de inwendige canule in de geleidecanule in de bipolaire stimulator werd geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van infusie van mecamylamine en scopolamine. (A)Representatieve kleur- en IvT-plots van baseline (links) en 3 μg van de niet-selectieve nicotine-acetylcholinereceptorantagonist mecamylamine (MEC) infusie (rechts) bij gestimuleerde fasische DA-afgifte in de NAc-kern bij een enkele mannelijke Sprague Dawley-rat. (B)Representatieve kleur- en IvT-plots van baseline (links) en 67 μg van de niet-selectieve muscarine-acetylcholinereceptorantagonist scopolamine (SCOP) infusie (rechts) bij gestimuleerde fasische DA-afgifte in de NAc-kern bij een enkele mannelijke Sprague Dawley-rat. De baseline-registratie vond plaats bij t = 0, voordat de interne canule in de geleidecanule in de bipolaire stimulator werd geplaatst. MEC- en SCOP-opnamen werden 9 minuten na de infusie gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gegevenssamenvatting die de effecten van geneesmiddelen in de loop van de tijd laat zien. De pre-infusieperiode (baseline) werd gemiddeld over vijf stimulaties en de postinfusieperiode (beginnend bij t = 3) wordt gepresenteerd als een percentage van de baseline. Na 9 minuten postinfusie zagen we dat het opgeroepen DA-signaal 103% van de uitgangswaarde was na zoutinfusie, 196% na NMDA-infusie, 18% na AP5-infusie, 49% na MEC-infusie en 43% na SCOP-infusie. n = 1 per voorwaarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV biedt een unieke kans om VTA-receptormechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan fasische DA-afgifte. Er zijn twee cruciale stappen om een goede registratie te garanderen. Eerst moet een stabiele basislijnregistratie worden bereikt, met weinig afwijking in het opgeroepen DA-signaal. Een belangrijke manier om de kans op een stabiele opname te vergroten, is ervoor te zorgen dat de elektrode voldoende tijd heeft gehad om te fietsen op zowel 60 Hz als 10 Hz (meestal 15 minuten bij 60 Hz en 10 minuten bij 10 Hz). Terwijl de koolstofvezel wordt gefietst, oxideert de koolstofvezel zelf en wordt geëtst, waardoor het oppervlak afneemt, maar een nieuw oppervlak voor dopamine-adsorptiewordt geproduceerd 23. Dit kan leiden tot een toename van de gevoeligheid voor DA. Men zou dus een lichte toename van gestimuleerde dopamine-afgifte in de loop van de tijd in het experiment kunnen zien als gevolg van deze verhoogde ets, in plaats van enige farmacologische manipulatie. Bovendien zal het starten van een opname binnen 90 tot 120 minuten na de eerste anesthesie de kans op een stabiele opname gedurende lange perioden vergroten. Als zodanig, als de rat de dood nadert door anesthesie, is het typisch voor de opgeroepen DA-afgifte om langzaam af te nemen.
De tweede cruciale stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de infusiecanule voorzichtig in de bipolaire stimulerende elektrode wordt ingebracht. De stereotaxische armbars kunnen bewegen als er te veel druk wordt uitgeoefend tijdens het inbrengen van de interne canule, en als gevolg daarvan kan het dopaminesignaal kunstmatig toenemen of afnemen, omdat de stimulatieplaats anders kan zijn. Als er een significante verandering is in het opgeroepen signaal na het inbrengen van de canule, moet een nieuwe basislijnperiode worden vastgesteld. Bovendien, als er een veranderde DA-afgifte is veroorzaakt door het inbrengen van de interne canule of voertuiginfusie, herstelt het signaal zich meestal binnen 30 minuten tot baseline. Mochten er uitgebreide veranderingen optreden in de afgifte van DA aan de infusie in het medium, dan kan de infusiesnelheid of het volume worden verlaagd. Onderzoekers kunnen ook een extra opname uitvoeren na het inbrengen van de interne canule vóór de infusie om te beoordelen of het inbrengen van de canule zelf de afgifte kan veranderen. In verband hiermee is het belangrijk om te controleren of de infusie is opgetreden en dat er geen blokkade van de interne canule is. Een manier om dit te doen is om een kleine bubbel in de infusiebuis te maken en dit te markeren met een pen of stift. De bel moet na infusie verder van de marker verwijderd zijn. Een andere manier om ervoor te zorgen dat de infusie goed is opgetreden, is door de infusiepomp in te schakelen nadat de interne canule uit de hersenen is verwijderd en als er zich nog steeds een oplossing vormt aan de punt, is er waarschijnlijk een succesvolle infusie opgetreden.
CIS-FSCV kan worden aangepast om VTA-receptoren te bestuderen bij zowel gedragsmatig naïeve als getrainde dieren om veranderingen in de receptorfunctie in de loop van de tijd tebestuderen 11. CIS-FSCV kan ook worden aangepast om 5-HT en noradrenaline (NE)24,25te meten. CIS-FSCV is ook zeer geschikt voor wakkere, gedragsexperimenten en kan worden geïntegreerd met optogenetische benaderingen26,27. Het is belangrijk op te merken dat elektrisch opgewekte afgiftegebeurtenissen verschillen van voorbijgaande afgiftegebeurtenissen die vaak worden waargenomen in vrij bewegende studies en minder vaak in het verdoofde preparaat. Voorbijgaande releasegebeurtenissen, bijvoorbeeld, hoeven niet noodzakelijkerwijs te worden aangedreven door directe depolarisatie van dopamineneuronen in tegenstelling tot elektrisch opgeroepen release-gebeurtenissen28. Als zodanig kan fasische neurale activiteit losstaan van de dopamine-afgiftegebeurtenissen die via FSCV worden gedetecteerd. Bovendien is aangetoond dat optisch opgewekte DA-release verschilt van elektrisch opgewekte DA-releasegebeurtenissen. Een recente vergelijking tussen optisch en elektrisch opgewekte stimulatie heeft aangetoond dat elektrisch opgewekte stimulatie multisynaptische regulatie van fasische DA-afgifte produceert, terwijl optisch opgeroepen stimulatie de stimulatie kan beperken tot meer specifieke circuits29.
Sommige recente benaderingen hebben optogenetische en fluorescerende methoden gebruikt om de circuits te onderzoeken die ten grondslag liggen aan snelle dopaminedynamiek in vivo30. Recent werk van Sun en collega's toonde bijvoorbeeld aan dat optogenetische stimulatie van dopamineneuronen in de substantia nigra snelle verhogingen van DA in het striatum produceert, zoals gemeten via expressie van G-eiwit gekoppelde receptor-activering gebaseerde DA (GRABDA)sensoren30. Gecombineerde optogenetische en fluorescentiebenaderingen kunnen worden gebruikt om specifieke afferente inputs voor de VTA te stimuleren of te remmen tijdens het meten van DA-afgifte in de NAc. CIS-FSCV kan de afferente stoffen niet zo specifiek stimuleren als optogenetische stimulatie, maar het heeft als voordeel dat het vragen over presynaptische en postsynaptische receptoren binnen de VTA kan beantwoorden. Hoewel zowel fluorescerende als FSCV-benaderingen voldoende temporele resolutie (subseconde) en gevoeligheid voor DA (1-10 nM) hebben om veranderingen in fasische DA-afgifte30, 31vergelijkbaar te meten, is een voordeel dat FSCV kan hebben ten opzichte van fluorescerende monitoring van phasic DA in vivo dat er geen genetische manipulaties nodig zijn voor registratie. Inderdaad, een CIS-FSCV-experiment kan binnen enkele uren worden voltooid, terwijl gecombineerde optogenetische en fluorescentiebenaderingen voldoende tijd (weken) nodig hebben voor voldoende expressie met behulp van virale constructies.
Een belangrijk voordeel van CIS-FSCV is dat specifieke VTA-receptorregulatie van fasische DA-afgifte kan worden bestudeerd in de intacte hersenen, voortbouwend op andere in vivo studies die ofwel de elektrofysiologische eigenschappen van VTA-neuronen meten of in vitro studies die de presynaptische regulatie van fasische DA-afgifte evalueren3,12. Een kanttekening bij CIS-FSCV is dat deze opnames moeten gebeuren in een relatief DA-rijk gebied. Dit is om twee redenen: ten eerste zijn er enkele limieten aan FSCV-gevoeligheid, die alleen DA-concentraties in het nanomolaire bereik en boven6,19kan detecteren. Ten tweede heeft FSCV moeite met het loskoppelen van noradrenaline van DA, omdat hun cyclische voltammogrammen bijna identiek zijn. Deze studies kunnen dus beperkt zijn tot het beoordelen van gebieden met een hoge DA, zoals sommige delen van de mediale prefrontale cortex, NAc, striatum en de olfactorische tuberkel32. Toekomstige studies kunnen mogelijk enkele van de geavanceerde FSCV-benaderingen gebruiken die een betere discriminatie tussen DA en NE mogelijk maken, evenals andere elektroactieve neurotransmitters zoals adenosine33 en serotonine12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door Elizabethtown College (R.J.W, M.L., en L.M.), door een NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) en door de Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
