Målet med detta protokoll är att direkt manipulera ventrala tegmentala områdesreceptorer för att studera deras bidrag till subsekund dopamin frisättning.
Phasic dopamin (DA) frigörare från ventrala tegmental området (VTA) till kärnan accumbens spelar en avgörande roll i belöning bearbetning och förstärkning lärande. Att förstå hur de olika neuronala ingångarna i VTA-kontrollens fasa DA-utgåva kan ge en bättre bild av kretsarna som styr belöningsbehandling och förstärkningsinlärning. Här beskriver vi en metod som kombinerar intra-VTA cannula infusioner av farmakologiska agonister och antagonister med stimulering-framkallad fasa DA release (kombinerad infusion och stimulering, eller CIS) mätt med in vivo snabb-scan cyklisk voltammetry (FSCV). Med hjälp av CIS-FSCV hos sövda råttor kan ett fasiskt DA-svar framkallas genom att elektriskt stimulera VTA med en bipolär elektrod utrustad med en kanyl medan du registrerar i kärnan accumbens kärna. Farmakologiska agonister eller antagonister kan infunderas direkt på stimuleringsstället för att undersöka specifika VTA-receptorers roller för att driva fasisk DA-frisättning. En stor fördel med CIS-FSCV är att VTA-receptorfunktionen kan studeras in vivo, med utgångspunkt i in vitro-studier.
Phasic dopamin (DA) frigörare från ventrala tegmental området (VTA) till kärnan accumbens (NAc) spelar en viktig roll i belöningsrelaterade beteenden. VTA DA-nervceller växlar från en tonic-liknande avfyrning (3-8 Hz) till en burst-liknande bränning (>14 Hz)1, som producerar fasisk DA-utgåva i NAc. VTA uttrycker en mängd somatodendritiska receptorer som är väl positionerade för att kontrollera övergången från tonic till burst-firing2,3,4,5. Att identifiera vilka av dessa receptorer, och deras respektive ingångar, kontrollfasisk DA-frisättning kommer att fördjupa vår förståelse för hur de belöningsrelaterade kretsarna är organiserade. Syftet med den metod som beskrivs här, kombinerad infusion och stimulering med snabbskanning cyklisk voltammetri (CIS-FSCV), är att snabbt och robust bedöma funktionaliteten hos VTA-receptorer vid körning av fasisk DA-frisättning.
Termen kombinerad infusion och stimulering (CIS) avser farmakologiskt manipulerande receptorer på en grupp neuroner (här VTA) och stimulera dessa nervceller att studera receptorns funktion. I den sövda råttan stimulerar vi elektriskt VTA att framkalla en stor fasisk DA-signal (1-2 μM) i NAc-kärnan, mätt med snabbskanning cyklisk voltammetri (FSCV). Infusioner av farmakologiska läkemedel (dvs. receptoragonister/antagonister) vid stimuleringsstället kan användas för att mäta funktionen hos VTA-receptorer genom att observera den efterföljande förändringen i framkallad fasisk DA-frisättning. FSCV är ett elektrokemiskt tillvägagångssätt som har både hög rumslig (50-100 μm) och temporal (10 Hz) upplösning, och är väl lämpad för att mäta belöningsrelaterade, fasa DA-händelser6,7. Denna upplösning är finare än andra in vivo neurokemiska mätningar, såsom mikrodialys. Således, tillsammans, CIS-FSCV är väl lämpad att bedöma VTA receptor reglering av fasa dopamin release.
Ett vanligt sätt att undersöka VTA-receptorfunktionen är genom att använda en kombination av elektrofysiologiska metoder som adresserar hur dessa receptorer ändrar avfyrningshastigheten för nervceller1,8. Dessa studier är mycket värdefulla för att förstå vilka receptorer som är involverade i att driva DA-avfyrning vid aktivering. Dessa studier kan dock bara föreslå vad som kan hända nedströms vid axonterminalen (dvs. frisättning av en neurotransmittor). CIS-FSCV bygger på dessa elektrofysiologiska studier genom att svara på hur effekten av VTA burst-firing, fasisk DA-frisättning, regleras av receptorer som finns på VTA-dendriter och cellkroppar. Cis-FSCV är således väl lämpad att bygga vidare på dessa elektrofysiologiska studier. Som ett exempel kan nikotinisk receptoraktivering inducera burst-firing i VTA9, och CIS-FSCV i den sövda råttan användes för att visa att nikotin acetylkolinreceptor (nAChR) aktivering i VTA också kontrollerar fasisk DA-frisättning i NAc10,11.
Mekanistisk undersökning av phasic DA reglering studeras också ofta med hjälp av skiva preparat tillsammans med bad tillämpning av droger. Dessa studier fokuserar ofta på den presynaptiska regleringen av phasic DA-frisättning från dopaminterminaler, eftersom cellkropparna ofta avlägsnas från skiva12. Dessa preparat är värdefulla för att studera presynaptiska receptoreffekter på dopaminterminaler, medan CIS-FSCV är bättre lämpad att studera somatodendritiska receptoreffekter på dopaminneuroner, liksom presynaptiska ingångar till VTA. Denna skillnad är viktig, eftersom somatodendritisk receptor aktivering i VTA kan ha en annan effekt än NAc presynaptisk receptor aktivering. Faktum är att blockering av dopaminerg presynaptiska nAChRs i NAc kan höja fasasisk dopaminfrisättning under burst-firing13, medan motsatsen gäller vid VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV är ett idealiskt tillvägagångssätt för att studera VTA-receptorernas förmåga att reglera fasisk DA-frisättning. Viktigt är att detta tillvägagångssätt kan utföras i en intakt råtta, antingen sövd eller fri rörelse. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för akuta studier, för att studera receptorfunktionen i dess utgångstillstånd10,14 samt långsiktiga studier som kan bedöma funktionella förändringar i en receptor efter läkemedelsexponering eller beteendemanipulation11,15.
CIS-FSCV ger en unik möjlighet att undersöka VTA-receptormekanismer som ligger till grund för fasisk DA-frisättning. Det finns två kritiska steg för att säkerställa en korrekt inspelning. För det första måste en stabil baslinjeinspelning uppnås, med liten drift i den framkallade DA-signalen. Ett viktigt sätt att öka sannolikheten för att etablera en stabil inspelning är att se till att elektroden har haft gott om tid att cykla vid både 60 Hz och 10 Hz (vanligtvis 15 min vid 60 Hz och 10 min vid 10 Hz). N…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av Elizabethtown College (R.J.W, M.L., och L.M.), av en NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) och av Yale School of Medicine (N.A.).
Electrode Filling Solution/Supplies | |||
Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
Electrode Supplies | |||
Carbon fiber | Thornel | T650 | |
Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
FSCV Hardware/Software | |||
Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
Stimulator Hardware | |||
Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
Infusion/Stimulation Supplies | |||
Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
Surgical Supplies | |||
Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
Histological Supplies | |||
Formulin | Sigma | 1004960700 | |
Power supply | BK Precision | 9110 | |
Sucrose | Sigma | 80497 | |
Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
Drugs for infusions | |||
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |