Målet med denne protokollen er å direkte manipulere ventrale tegmentale områdereseptorer for å studere deres bidrag til subsecond dopaminfrigjøring.
Phasic dopamin (DA) frigjøring fra ventral tegmental området (VTA) til kjernen accumbens spiller en sentral rolle i belønning behandling og forsterkning læring. Å forstå hvordan de forskjellige nevroninngangene i VTA-kontrollens fasiske DA-utgivelse kan gi et bedre bilde av kretsene som styrer belønningsbehandling og forsterkningslæring. Her beskriver vi en metode som kombinerer intra-VTA cannula infusjoner av farmakologiske agonister og antagonister med stimulering-fremkalt fasisk DA-frigjøring (kombinert infusjon og stimulering, eller CIS) målt ved in vivo hurtigskanning syklisk voltammetri (FSCV). Ved hjelp av CIS-FSCV hos bedøvede rotter kan en fasisk DA-respons fremkalles ved å stimulere VTA elektrisk med en bipolar elektrode utstyrt med en kanyle mens du registrerer i kjernen av kjernen. Farmakologiske agonister eller antagonister kan infunderes direkte på stimuleringsstedet for å undersøke spesifikke VTA-reseptorers roller i å drive fasisk DA-frigjøring. En stor fordel med CIS-FSCV er at VTA-reseptorfunksjonen kan studeres in vivo, basert på in vitro-studier.
Phasic dopamin (DA) frigjøring fra ventral tegmental området (VTA) til kjernen accumbens (NAc) spiller en viktig rolle i belønningsrelatert atferd. VTA DA nevroner bytter fra en tonic-lignende avfyring (3-8 Hz) til en burst-lignende avfyring (>14 Hz)1, som produserer fasisk DA-utgivelse i NAc. VTA uttrykker en rekke somatodendritiske reseptorer som er godt posisjonert for å kontrollere bryteren fra tonic til burst-firing2,3,4,5. Å identifisere hvilke av disse reseptorene, og deres respektive innganger, kontrollere fasisk DA-utgivelse, vil utdype vår forståelse av hvordan belønningsrelaterte kretser er organisert. Formålet med metodikken som er beskrevet her, kombinert infusjon og stimulering med hurtigskanning av syklisk voltammetri (CIS-FSCV), er å raskt og robust vurdere funksjonaliteten til VTA-reseptorer i å drive fasisk DA-frigjøring.
Begrepet kombinert infusjon og stimulering (CIS) refererer til farmakologisk manipulerende reseptorer på en gruppe nevroner (her VTA) og stimulerer disse nevronene til å studere reseptorens funksjon. I den bedøvede rotten stimulerer vi VTA elektrisk for å fremkalle et stort fasisk DA-signal (1-2 μM) i NAc-kjernen, målt ved hurtigskanning av syklisk voltammetri (FSCV). Infusjoner av farmakologiske legemidler (dvs. reseptoragonister/antagonister) på stimuleringsstedet kan brukes til å måle funksjonen til VTA-reseptorer ved å observere den påfølgende endringen i fremkalt fasisk DA-frigjøring. FSCV er en elektrokjemisk tilnærming som har både høy romlig (50-100 μm) og temporal (10 Hz) oppløsning, og er godt egnet til å måle belønningsrelaterte, fasiske DA-hendelser6,7. Denne oppløsningen er finere enn andre in vivo nevrokjemiske målinger, for eksempel mikrodialyse. Sammen er CIS-FSCV derfor velegnet til å vurdere VTA-reseptorregulering av fasisk dopaminfrigjøring.
En vanlig måte å undersøke VTA-reseptorfunksjonen på er ved å bruke en kombinasjon av elektrofysiologiske tilnærminger som adresserer hvordan disse reseptorene endrer avfyringshastigheten til nevroner1,8. Disse studiene er svært verdifulle for å forstå hvilke reseptorer som er involvert i å drive DA-avfyring ved aktivering. Imidlertid kan disse studiene bare foreslå hva som kan skje nedstrøms ved axonterminalen (dvs. frigjøring av en nevrotransmitter). CIS-FSCV bygger på disse elektrofysiologiske studiene ved å svare på hvordan utgangen av VTA burst-firing, phasic DA release, reguleres av reseptorer som ligger på VTA dendritter og cellelegemer. Dermed er CIS-FSCV godt egnet til å bygge på disse elektrofysiologistudiene. Som et eksempel kan nikotinreseptoraktivering indusere burst-firing i VTA9, og CIS-FSCV i bedøvelsesrotten ble brukt til å vise at nikotinisk acetylkolinreseptor (nAChR) aktivering i VTA også kontrollerer fasisk DA-utgivelse i NAc10,11.
Mekanistisk undersøkelse av fasisk DA-regulering studeres også ofte ved hjelp av skiver preparater sammen med bad påføring av legemidler. Disse studiene fokuserer ofte på presynaptisk regulering av phasic DA-frigjøring fra dopaminterminaler, da cellelegemene ofte fjernes fra skive12. Disse preparatene er verdifulle for å studere presynaptiske reseptoreffekter på dopaminterminaler, mens CIS-FSCV er bedre egnet til å studere somatodendritiske reseptoreffekter på dopaminnevroner, samt presynaptiske innganger til VTA. Dette skillet er viktig, fordi somatodendritisk reseptoraktivering i VTA kan ha en annen effekt enn NAc presynaptisk reseptoraktivering. Faktisk kan blokkering av dopaminerge presynaptiske nAChRs i NAc heve fasic dopamin frigjøring under burst-firing13, mens det motsatte er sant på VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV er en ideell tilnærming for å studere VTA-reseptorers evne til å regulere fasisk DA-frigjøring. Det er viktig at denne tilnærmingen utføres i en intakt rotte, enten bedøvet eller fri bevegelig. Denne tilnærmingen er egnet for akutte studier, for å studere reseptorfunksjon i baseline tilstand10,14 samt langsiktige studier som kan vurdere funksjonelle endringer i en reseptor etter legemiddeleksponering eller atferdsmanipulering11,15.
CIS-FSCV gir en unik mulighet til å undersøke VTA-reseptormekanismer som ligger til grunn for fasisk DA-utgivelse. Det er to kritiske trinn for å sikre riktig opptak. For det første må en stabil basislinjeopptak oppnås, med liten drift i det fremkalte DA-signalet. En viktig måte å øke sannsynligheten for å etablere et stabilt opptak er å sikre at elektroden har hatt god tid til å sykle på både 60 Hz og 10 Hz (vanligvis 15 min ved 60 Hz og 10 min ved 10 Hz). Etter hvert som karbonfiberen blir syklet, oksider…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av Elizabethtown College (R.J.W, M.L., og L.M.), av et NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) og av Yale School of Medicine (N.A.).
Electrode Filling Solution/Supplies | |||
Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
Electrode Supplies | |||
Carbon fiber | Thornel | T650 | |
Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
FSCV Hardware/Software | |||
Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
Stimulator Hardware | |||
Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
Infusion/Stimulation Supplies | |||
Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
Surgical Supplies | |||
Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
Histological Supplies | |||
Formulin | Sigma | 1004960700 | |
Power supply | BK Precision | 9110 | |
Sucrose | Sigma | 80497 | |
Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
Drugs for infusions | |||
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |