Descriviamo protocolli per valutare il grado di trasduzione mediante peptidi che penetrano nelle cellule utilizzando sistemi di imaging ex vivo seguiti dall’incorporamento della paraffina, dalla sezionamento e dalla microscopia fluorescente confocale utilizzando come esempio il peptide di puntamento cardiaco. Nel nostro protocollo, un singolo animale può essere utilizzato per acquisire entrambi i tipi di valutazione dell’imaging degli stessi organi, dimezzando così il numero di animali necessari per gli studi.
Dalla descrizione iniziale dei domini di trasduzione delle proteine, noti anche come peptidi penetranti delle cellule, oltre 25 anni fa, c’è stato un forte interesse nello sviluppo di questi peptidi, in particolare quelli specifici delle cellule, come nuovi vettori per la fornitura di materiali diagnostici e terapeutici. Il nostro lavoro passato che ha coinvolto il fago ha identificato un nuovo peptide, non naturale, lungo 12 aminoacidi che abbiamo chiamato peptide bersaglio cardiaco (CTP) a causa della sua capacità di trasdurre il tessuto cardiaco normale in vivo con picco di assorbimento visto in appena 15 min dopo un’iniezione endovenosa. Abbiamo intrapreso studi dettagliati sulla biodistribuzione iniettando CTP etichettato con cianina fluoroforo5.5, permettendogli di circolare per vari periodi di tempo, e di eutanasia, fissaggio e sezionamento di più organi seguiti dall’imaging microscopio fluorescente. In questa pubblicazione, descriviamo questi processi e l’imaging ex vivo degli organi raccolti utilizzando un sistema di imaging in vivo in dettaglio. Forniamo metodologie e pratiche dettagliate per intraprendere la trasduzione e studi di biodistribuzione utilizzando la CTP come esempio.
La membrana plasmatica cellulare è una barriera semipermeabile che è essenziale per l’integrità e la sopravvivenza delle cellule e serve a regolare l’interno della cellula controllando il movimento delle sostanze nella cellula. Anche se vitale per la sopravvivenza, presenta anche una barriera alla consegna del carico alla cellula. Nel 1988, il trans-attivatore della proteina di trascrizione (Tat) del virus dell’immunodeficienza umana è stato indicato per entrare nelle cellule coltivate e promuovere l’espressione genica virale1,2, con i domini responsabili di questa trasduzione limitata ad una regione di arginina e lisina ricca 13-aminoacido della terza elica3 Questi sono stati quindi chiamati colture di peptingtide (PPC). Questo è stato seguito da una ricerca che ha dimostrato la capacità del peptide Tat di trasportare la parola funzionale -galactosidase in più tipi cellulari4. Dalla descrizione iniziale, il numero di peptidi penetranti nelle cellule è aumentato drasticamente. Questi domini di trasduzione sono peptidi corti naturali o sintetici, in genere lunghi 6-20 aminoacidi, che sono in grado di trasportare carichi funzionali attraverso le membrane cellulari. Questi carichi possono variare da altri piccoli peptidi, proteine a lunghezza intera, acidi nucleici, nanoparticelle, particelle virali, molecole fluorescenti e radioisotopi5. I CpP iniziali descritti non erano specifici per le cellule, con Tat assunto da più tipi di cellule e persino attraversando la barriera emato-encefalica4, limitando così il suo potenziale terapeutico. Al fine di identificare i CPC specifici delle cellule, gli investigatori hanno intrapreso il display dei faghi utilizzando grandi librerie di fagè disponibili in commercio6. Il nostro lavoro utilizzando una metodologia combinatoria in vitro e in vivo di visualizzazione dei fagi ha portato all’identificazione di un CPP denominato peptide di targeting cardiaco (CTP)7, un peptide 12-aminoacido, non naturale (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) che si rivolge al cuore con picco di aumento a 15 min dopo un’iniezione peripal intravace8. Utilizzando la co-localizzazione immunofluorescente con actina, un marcatore intracellulare, ed esclusione della laminina, un marcatore di membrana cellulare, abbiamo mostrato che ctP viene interiorizzato in cardiomiociti del topo dopo un’iniezione per via endovenosa7. Inoltre, abbiamo incubato cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo che picchiano cardiomiociti con CTP a doppio marchio, etichettati con 6 carboxyfluorescein a c-terminus e rododerina al suo N-terminus attraverso un collegamento di ester che poteva essere tagliato solo da intracellulari. Il rapido accumulo di rhodamina nel battere cardiomiociti è stato osservato entro 15 min sulla microscopia confocale8.
In questo articolo, presentiamo due metodologie gratuite che possono essere utilizzate per monitorare la biodistribuzione e confermare l’internalizzazione specifica dei CPP utilizzando CTP come esempio. Per queste metodologie, ctP è stato sintetizzato, fluorescente etichettato al N-terminus con cianine5.5 (CY5.5), e amide-capped al capolinea C per una maggiore stabilità peptide. Le due metodologie utilizzate sono i sistemi di imaging ottico fluorescente in vivo e la microscopia fluorescente delle sezioni tissutali. Entrambi i metodi sono molto utili nello studio della biodistribuzione, dell’assorbimento e dell’eliminazione di CPC etichettati fluorescentmente. Il vantaggio di valutare la biodistribuzione utilizzando questi metodi rispetto ad altri, come la tomografia a emissione di singoli fotoni (SPECT) o la tomografia a emissione di positroni (PET), è che non è necessario un’intensa radioetichettatura dei PCC rispetto all’etichettatura fluorescente, che è relativamente facile e in uso di routine in tutti gli impianti di sintesi peptide. L’uso dell’imaging in vivo produce rapidamente dati di biodistribuzione nel contesto di un sistema vivente, mentre la sezionamento fornisce maggiori informazioni approfondite sull’assorbimento e la localizzazione dei peptidi all’interno delle cellule attraverso la conservazione dei dettagli morfologici. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organi e tessuti come il cuore, polmone, fegato, rene, cervello, milza, stomaco, intestino crasso, intestino tenue, muscolo scheletrico, osso, testicoli / ovaie, e gli occhi.
I modelli animali sono essenziali per lo sviluppo preclinico di farmaci in ogni fase del processo, dall’identificazione di nuovi CPC, studi di biodistribuzione, meccanismo di trasduzione, alla verifica in ultima analisi dell’efficacia del carico consegnato utilizzando questi nuovi CPC come vettori. Ci sono molti metodi comunemente utilizzati disponibili per valutare la biodistribuzione come l’istologia, l’imaging della medicina nucleare (SPECT e PET) e l’imaging ottico in vivo12. I metodi di imaging nucleare possono essere ingombranti a causa della limitata disponibilità di piccoli sistemi animali SPECT e PET, nonché della capacità di produrre coniugati radioetichetta-farmaco, che richiedono l’esperienza di un radiochimico. Al contrario, le etichette fluorescenti sono molto più semplici e possono essere convenienti con cui lavorare. Il protocollo descritto in questo documento consente un’analisi rapida della biodistribuzione utilizzando più metodi. L’imaging ottico fluorescente dell’intero organo in vivo consente l’immediato confronto della fluorescenza tra diversi tessuti e gruppi di trattamento e può identificare l’assorbimento degli organi e il tempo necessario per raggiungere il picco di assorbimento degli organi di interesse in modo semiquantitativo. L’istologia quantitativa dei tessuti richiede un’elaborazione più estesa per trattare, sezione, immagine e analizzare i tessuti, ma fornisce più dati a livello microscopico ed è una tecnica standard corrente. Vale la pena notare che il confronto diretto e quantitativo tra le due tecniche non è possibile, perché l’autofluorescenza osservata con ogni tecnica per organi diversi e lunghezze d’onda di eccitazione varia in modo significativo.
Una parte importante di questo protocollo è la scelta del fluoroforo giusto per etichettare i CCP candidati per gli esperimenti. Un problema potenziale è la sovrapposizione degli spettri, che può essere problematica quando sono necessari più fluorofori. Il supporto di montaggio fluorescente DAPI e Cy5.5 non hanno spettri sovrapposti. Tuttavia, per alcune applicazioni in cui sono necessari più fluorofori, il rischio di sovrapposizione spettrale deve essere attentamente considerato. A seconda del sistema utilizzato, la selezione del fluoroforo può essere limitata. Pertanto, la conoscenza delle capacità del sistema è fondamentale. I sistemi ottici fluorescenti sono meglio utilizzati con fluorofori di gran lunga rosso o vicino infrarosso a causa dell’elevato assorbimento dei tessuti di lunghezze d’onda più corte13. I fluorofori nella gamma di proteine fluorescenti verdi potenziate hanno una grande limitazione, perché c’è una significativa autofluorescenza dell’organo osservata alla sua lunghezza d’onda di eccitazione, in particolare nel tessuto cerebrale e epatico. A seconda delle condizioni di un esperimento, alcuni fluorofori sono meglio evitare. Alcuni fluorofori organici solubili in acqua hanno una forte interazione con i bistrati lipidici, che possono causare falsi positivi. Quindi, prendere misure per determinare se un fluoroforo ha una forte affinità con il tessuto di interesse è consigliabile14. Un altro fattore da considerare è la selezione del metodo appropriato di coniugazione fluoroforo, che può essere un parametro importante che influenzano i risultati. I PPP possono essere etichettati fluorescente al capoN o C attraverso un legame covalente tra il N-terminus del peptide e il gruppo carboxyl del colorante come Cy5.5-NHS. Occorre prestare attenzione, perché il meccanismo di trasduzione della maggior parte dei CPC non è compreso nei dettagli e la coniugazione a un’estremità può influenzare il meccanismo di assorbimento più che all’altra estremità. Un’altra possibilità per etichettare i CPC è attraverso la biotinyillazione dell’N-terminus per la coniugazione alla streptavidina etichettata a fluorescenza. L’utilizzo di questa strategia ha la comodità di consentire l’utilizzo di diversi coniugati fluorescenti streptavidin. Tuttavia, una possibile limitazione di questa strategia è che un complesso di biotina-streptavidin è un grande costrutto, che potrebbe potenzialmente interferire con la trasduzione.
I sistemi di imaging ottico fluorescente sono una strategia efficace per generare un confronto della fluorescenza tra diversi organi e trattamenti in modo efficiente, ma non sono in grado di produrre una misura quantitativa delle concentrazioni assolute nel tessuto. Ciò è dovuto agli effetti di dispersione della luce all’interno del tessuto, che è ulteriormente aggravato dalla varietà naturale nelle dimensioni e densità dei tessuti, e dalle differenze nella vascolarizzazione, con dispersione variabile di fluorescenza. L’autofluorescenza dei tessuti può essere anche un fattore, a causa di fonti biochimiche naturali come il collagene, o fonti dietetiche come la clorofilla negli alimenti13.
L’istologia è il metodo più comunemente usato per misurare la biodistribuzione e può essere potenzialmente utilizzato per misurare e confrontare con precisione l’assorbimento tra diversi tessuti nel tempo. I problemi di dispersione della luce sono evitati con questo metodo perché tutti i tessuti sono sezionato allo stesso spessore15. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di includere etichette fluorescenti aggiuntive post-sezione per l’immunohistochimica. Anche se l’aggiunta di un altro fluoroforo potrebbe rendere l’imaging più impegnativo, l’uso di etichette fluorescenti può essere utile per la localizzazione di un CPP in particolari compartimenti intracellulari, come lisosomi o mitocondri. Un anticorpo potrebbe essere utilizzato in un esperimento di microscopia confocale per determinare se un CPP candidato transdotto colocalizza con una struttura di interesse, che può mostrare il potenziale di un CPP come agente di consegna. Una limitazione di questo metodo è che la preparazione di diapositive da campioni di organo può richiedere molto tempo, laboriosa e soggettaall’erroreumano 12,15. Quando si immaginano i vetrini, è necessario prestare attenzione a non visualizzare la stessa posizione per troppo tempo per evitare il fotosbleaching. Alcuni fotosbiancamento saranno inevitabili, a seconda della sensibilità del fluoroforo. Prestare attenzione ad ogni passo di questo protocollo per proteggere i campioni dalla luce ambiente e memorizzarli correttamente16. Per le immagini future, si consiglia di conservare le diapositive a 4 gradi centigradi, protette dalla luce.
Esistono diversi metodi disponibili per misurare la biodistribuzione di un CPP candidato che richiedono attrezzature specializzate e possono produrre risultati comparabili, anche se possono richiedere un’etichettatura CPP più complessa. Il protocollo descritto in questo documento utilizza due metodi compatibili per produrre in modo efficiente i dati di biodistribuzione nel contesto di un sistema vivente, consentendo al contempo l’acquisizione di maggiori informazioni approfondite sull’internalizzazione dei peptidi all’interno delle cellule dello stesso campione, dimezzando così il numero di animali necessari per uno studio. Questi metodi sono stati utilizzati per generare i dati di cui sopra, che dimostrano che entrambi i metodi possono essere utilizzati in sequenza nello stesso animale, e la qualità dei dati generati da ciascuno. I nostri risultati evidenziano anche l’incapacità di correlare direttamente i risultati tra le due tecniche in modo quantitativo.
The authors have nothing to disclose.
Le m.e K.S.F. sono sostenute dall’American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180 e da una sovvenzione assegnata nell’ambito del Pitt Innovation Challenge (PInCh®), attraverso l’Istituto di Scienze Cliniche e Traslazionali dell’Università di Pittsburgh.
10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
Ethanol | |||
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |