हम एक उदाहरण के रूप में पेप्टाइड को लक्षित करते हुए कार्डियक टार्गेटिंग पेप्टाइड का उपयोग करके पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के बाद पूर्व वीवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड द्वारा ट्रांसडक्शन की डिग्री का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में, एक ही जानवर का उपयोग एक ही अंगों के दोनों प्रकार के इमेजिंग मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, जिससे अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या में आधे से कटौती की जा सकती है ।
25 साल पहले प्रोटीन ट्रांसडक्शन डोमेन के प्रारंभिक विवरण के बाद से, जिसे सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के रूप में भी जाना जाता है, नैदानिक और चिकित्सीय सामग्री देने के लिए उपन्यास वैक्टर के रूप में इन पेप्टाइड्स, विशेष रूप से सेल-विशिष्ट लोगों को विकसित करने में गहन रुचि रही है। हमारे पिछले काम फेज प्रदर्शन शामिल एक उपंयास की पहचान की, nonnaturally होने वाली, 12 अमीनो एसिड लंबी पेप्टाइड है कि हम कार्डियक लक्ष्यीकरण पेप्टाइड (सीटीपी) के कारण अपने को पीक तेज के साथ वीवो में सामांय दिल के ऊतकों को स्थानांतरित करने की क्षमता के कारण एक नसों में इंजेक्शन के बाद के रूप में छोटे रूप में 15 मिनट में देखा । हमने फ्लोरोफोर साइनाइन5.5 के साथ लेबल किए गए सीटीपी को इंजेक्ट करके विस्तृत बायोडिलिएब्यूशन अध्ययन शुरू किया है, जिससे यह विभिन्न अवधियों के लिए प्रसारित हो सकता है, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के बाद कई अंगों को इच्छामृत्यु, फिक्सिंग और सेक्शनिंग कर सकता है। इस प्रकाशन में, हम इन प्रक्रियाओं के साथ-साथ काटे गए अंगों के पूर्व वीवो इमेजिंग का विस्तार से वीवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करके वर्णन करते हैं। हम एक उदाहरण के रूप में सीटीपी का उपयोग करके ट्रांसडक्शन के साथ-साथ बायोडिब्यूशन अध्ययन करने के लिए विस्तृत तरीके और प्रथाएं प्रदान करते हैं।
सेल प्लाज्मा झिल्ली एक अर्धपरिष्ठान बाधा है जो कोशिका अखंडता और अस्तित्व के लिए आवश्यक है और कोशिका में पदार्थों के आंदोलन को नियंत्रित करके सेल के इंटीरियर को विनियमित करने का कार्य करती है। हालांकि अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी सेल के लिए कार्गो की डिलीवरी के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है । 1 9 88 में, मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस के ट्रांस-एक्टिवेटर (Tat) प्रोटीन को सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रवेश करने और वायरल जीन अभिव्यक्ति1,2को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गयाथा,इस ट्रांसडक्शन के लिए जिम्मेदार डोमेन के साथ एक आर्जिनिन और लिसाइन समृद्ध 13-अमीनो एसिड क्षेत्र के तीसरे हेलिक्स3 के इन्हें इस प्रकार सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (सीपीपीएस) नाम दिया गया था। इसके बाद शोध किया गया जिसमें टैट पेप्टाइड की क्षमता को कई सेल प्रकार4में कार्यात्मक ले जाने के लिए दिखाया गया था। प्रारंभिक विवरण के बाद से, सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स की संख्या में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है। ये ट्रांसडक्शन डोमेन स्वाभाविक रूप से होने वाले या सिंथेटिक शॉर्ट पेप्टाइड्स होते हैं, आमतौर पर 6−20 अमीनो एसिड लंबे होते हैं, जो कोशिका झिल्ली में कार्यात्मक कार्गो ले जाने में सक्षम होते हैं। ये कार्गो अन्य छोटे पेप्टाइड्स, पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, नैनोकणों, वायरल कणों, फ्लोरोसेंट अणुओं और रेडियोआइसोटोप5से लेकर हो सकते हैं। प्रारंभिक CPPs वर्णित सेल विशिष्ट नहीं थे, Tat के साथ कई सेल प्रकार द्वारा उठाए जा रहे है और यहां तक कि रक्त मस्तिष्क बाधा4पार, इसलिए अपनी चिकित्सीय क्षमता सीमित । सेल-विशिष्ट सीपीपी की पहचान करने के लिए, जांचकर्ताओं ने बड़े, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फाज पुस्तकालयों 6 का उपयोग करतेहुएफेज डिस्प्ले शुरू किया है। हमारे अपने काम में एक संयोजन में विट्रो और वीवो फाज प्रदर्शन पद्धति में एक सीपीपी नाम कार्डियक लक्ष्यीकरण पेप्टाइड (सीटीपी)7,एक 12-अमीनो एसिड, nonnaturally होने वाले पेप्टाइड (एनएच 2-APWHLSSQYSRT-COOH) की पहचान के लिए नेतृत्व किया है कि एक परिधीय इंजेक्शन28 केबाद 15 मिनट पर चोटी के साथ दिल को निशाना बनाता है । एक इंट्रासेलुलर मार्कर, और लेमिनिन, एक सेल झिल्ली मार्कर के बहिष्कार के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट कोलोकैलाइजेशन का उपयोग करके, हमने दिखाया कि सीटीपी को नसों में इंजेक्शन 7 के बाद माउस कार्डियोमायोसाइट्स में आंतरिक रूप दियाजाताहै। इसके अतिरिक्त, हमने मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटिंग कार्डियोमायोसाइट्स को दोहरे लेबल वाले सीटीपी के साथ, अपने सी-टर्मिनस पर 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसीइन के साथ लेबल किया और एक एस्टर लिंकेज के माध्यम से अपने एन-टर्मिनस पर रोडमाइन को केवल इंट्रासेलर एस्टेर द्वारा बंद किया जा सकता है। कार्डियोमायोसाइट्स को पीटने में रोडामाइन का तेजी से संचय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 8 पर 15 मिनट के भीतरदेखागया ।
इस लेख में, हम दो मानार्थ तरीके पेश करते हैं जिनका उपयोग जैव वितरण को ट्रैक करने और एक उदाहरण के रूप में सीटीपी का उपयोग करके सीपीपी के ऊतक-विशिष्ट आंतरिककरण की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। इन पद्धतियों के लिए, सीटीपी को संश्लेषित किया गया था, फ्लोरोसेंट रूप से साइनाइन5.5 (CY5.5) के साथ एन-टर्मिनस पर लेबल किया गया था, और अधिक पेप्टाइड स्थिरता के लिए सी-टर्मिनस पर अमीड-कैप्ड था। उपयोग की जाने वाली दो पद्धतियां वीवो फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम और ऊतक वर्गों की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में हैं। दोनों विधियां बायोडिब्यूशन, तेज और फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सीपीपी के उन्मूलन का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी हैं। दूसरों पर इन तरीकों का उपयोग करके जैव वितरण का आकलन करने का लाभ, जैसे एकल-फोटॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (स्पेक्ट) या पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), यह है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग की तुलना में सीपीपी के समय-गहन रेडियोलाबेलिंग की कोई आवश्यकता नहीं है, जो अपेक्षाकृत आसान है और सभी पेप्टाइड संश्लेषण सुविधाओं पर नियमित उपयोग में है। वीवो इमेजिंग में उपयोग जल्दी से एक जीवित प्रणाली के संदर्भ में बायोडिलिएब्यूशन डेटा पैदा करता है, जबकि सेक्शनिंग रूपात्मक विस्तार के संरक्षण के माध्यम से कोशिकाओं के भीतर पेप्टाइड तेज और स्थानीयकरण के बारे में अधिक गहराई से जानकारी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को हृदय, फेफड़े, यकृत, गुर्दे, मस्तिष्क, तिल्ली, पेट, बड़ी आंत, छोटी आंत, कंकाल की मांसपेशी, हड्डी, वृषण/अंडाशय और आंखों जैसे विभिन्न प्रकार के अंगों और ऊतकों पर लागू किया जा सकता है।
पशु मॉडल उपन्यास CPPs की पहचान से प्रक्रिया के हर चरण में पूर्व नैदानिक दवा विकास के लिए आवश्यक हैं, जैव वितरण अध्ययन, ट्रांसडक्शन के तंत्र, अंततः वैक्टर के रूप में इन उपन्यास CPPs का उपयोग कर दिया कार्गो की प्रभावकारिता के लिए परीक्षण करने के लिए । हिस्टोलॉजी, न्यूक्लियर मेडिसिन इमेजिंग (स्पेक्ट और पीईटी) और वीवो ऑप्टिकल इमेजिंग12जैसे बायोडिब्यूशन का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले कई तरीके उपलब्ध हैं। छोटे पशु SPECT और पीईटी सिस्टम की सीमित उपलब्धता के साथ-साथ रेडियोलेबल-ड्रग कंजूगेट्स का उत्पादन करने की क्षमता के कारण परमाणु इमेजिंग विधियां बोझिल हो सकती हैं, जिसके लिए रेडियोकेमिस्ट की विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट लेबल बहुत सरल हैं और साथ काम करने के लिए लागत प्रभावी हो सकते हैं। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल कई तरीकों का उपयोग करके बायोडिलिएब्यूशन के तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है। पूर्व वीवो पूरे अंग फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग विभिन्न ऊतकों और उपचार समूहों में फ्लोरेसेंस की तत्काल तुलना के लिए अनुमति देता है और एक अर्धकांश तरीके से ब्याज के अंग में चोटी तेज करने के लिए अंग तेज और समय की पहचान कर सकते हैं । मात्रात्मक ऊतक हिसटोलॉजी के इलाज, अनुभाग, छवि, और ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए और अधिक व्यापक प्रसंस्करण की आवश्यकता है, लेकिन यह सूक्ष्म स्तर पर अधिक डेटा प्रदान करता है और एक वर्तमान मानक तकनीक है। यह ध्यान रखना सार्थक है कि दोनों तकनीकों में प्रत्यक्ष, मात्रात्मक तुलना संभव नहीं है, क्योंकि विभिन्न अंगों और उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के लिए प्रत्येक तकनीक के साथ देखा गया ऑटोफ्लोरेसेंस काफी भिन्न होता है।
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रयोगों के लिए उम्मीदवार सीपीपी लेबल करने के लिए सही फ्लोरोफोर का चयन कर रहा है। एक संभावित मुद्दा स्पेक्ट्रा ओवरलैप है, जो कई फ्लोरोफोरस की आवश्यकता होने पर समस्याग्रस्त हो सकता है। दापी फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया और Cy5.5 में ओवरलैपिंग स्पेक्ट्रा नहीं है। हालांकि, कुछ अनुप्रयोगों के लिए जहां कई फ्लोरोफोरस की आवश्यकता होती है, स्पेक्ट्रल ओवरलैप के जोखिम पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है। सिस्टम का उपयोग किए जाने के आधार पर, फ्लोरोफोर चयन सीमित हो सकता है। इसलिए, प्रणाली की क्षमताओं का ज्ञान महत्वपूर्ण है । फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल सिस्टम का सबसे अच्छा उपयोग13छोटे तरंगदैर्ध्य के उच्च ऊतक अवशोषण के कारण दूर-लाल या निकट-अवरक्त फ्लोरोफोरस के साथ किया जाता है। उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सीमा में फ्लोरोफोरस की एक प्रमुख सीमा है, क्योंकि विशेष रूप से मस्तिष्क और यकृत ऊतक में अपनी उत्तेजन तरंगदैर्ध्य में महत्वपूर्ण अंग ऑटोफ्लोरेसेंस देखा जाता है। एक प्रयोग की शर्तों के आधार पर, कुछ फ्लोरोफोरस सबसे अच्छा बचा जाता है। कुछ पानी में घुलनशील कार्बनिक फ्लोरोफोरस लिपिड बिलायर के साथ एक मजबूत बातचीत है, जो झूठी सकारात्मक पैदा कर सकता है । इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए कदम उठाने से कि क्या फ्लोरोफोर में रुचि के ऊतकों के प्रति मजबूत आत्मीयताहै, 14की सलाह दी जाती है । विचार करने के लिए एक और कारक फ्लोरोफोर संवत् की उपयुक्त विधि का चयन कर रहा है, जो परिणामों को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है। सीपीपी को पेप्टाइड के एन-टर्मिनस और डाइन के कार्बोक्सिल समूह जैसे Cy5.5-NHS के बीच एक सहसंयोजक बांड के माध्यम से एन-या सी-टर्मिनस में फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया जा सकता है। देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि अधिकांश सीपीपी के परिवर्तन के तंत्र को विस्तार से नहीं समझा जाता है और एक छोर पर संविलियन दूसरे छोर की तुलना में अधिक तेज तंत्र को प्रभावित कर सकता है । सीपीपी लेबलिंग के लिए एक और संभावना फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए स्ट्रेप्टाविडिन को संयोजित करने के लिए एन-टर्मिनस को बायोटिनाइलेटिंग के माध्यम से है। इस रणनीति का उपयोग करने से विभिन्न फ्लोरोसेंट स्ट्रेप्टाविडिन संजूद्वारा का उपयोग करने की अनुमति देने की सुविधा है। हालांकि, इस रणनीति की एक संभावित सीमा यह है कि एक बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन कॉम्प्लेक्स एक बड़ा निर्माण है, जो संभावित रूप से लेनदेन में हस्तक्षेप कर सकता है।
फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम विभिन्न अंगों और उपचारों में फ्लोरेसेंस की तुलना कुशलता से उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी रणनीति है लेकिन ऊतक में पूर्ण सांद्रता का मात्रात्मक उपाय करने में असमर्थ हैं। यह ऊतक के भीतर प्रकाश बिखरने के प्रभाव के कारण होता है, जो ऊतक आकार और घनत्व में स्वाभाविक रूप से होने वाली विविधता और वैस्कुलरिटी में अंतर, चर फ्लोरेसेंस बिखरने के साथ आगे बढ़ जाता है। ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस एक कारक भी हो सकता है, स्वाभाविक रूप से होने वाले जैव रासायनिक स्रोतों जैसे कोलेजन, या भोजन13में क्लोरोफिल जैसे आहार स्रोतों के कारण।
हिस्टोलॉजी बायोडिब्यूशन को मापने की सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है और संभावित रूप से समय के साथ विभिन्न ऊतकों में तेज को सही तरीके से मापने और तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करने से प्रकाश बिखरने वाले मुद्दों को टाला जाता है क्योंकि सभी ऊतकों को एक ही मोटाई के साथ खंडित किया जाता है15. इस विधि का एक प्रमुख लाभ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल पोस्टेक्शनिंग को शामिल करने की क्षमता है। यद्यपि एक और फ्लोरोफोर के अलावा इमेजिंग को और अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकता है, फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग सीपीपी के स्थानीयकरण के लिए विशेष रूप से इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए उपयोगी हो सकता है, जैसे लाइसोसोम या माइटोकॉन्ड्रिया। एक एंटीबॉडी का उपयोग एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रयोग में किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या कोई ट्रांसड्यूडेड उम्मीदवार सीपीपी ब्याज की संरचना के साथ कोलोकैलिज़ करता है, जो डिलीवरी एजेंट के रूप में सीपीपी की क्षमता दिखा सकता है। इस विधि की एक सीमा यह है कि अंग के नमूनों से स्लाइड तैयार करने में समय लग सकता है, श्रम गहन हो सकता है, और मानव त्रुटि12,,15से ग्रस्त हो सकता है। जब इमेजिंग स्लाइड, देखभाल के लिए बहुत लंबे समय के लिए एक ही स्थान छवि नहीं फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । फ्लोरोफोर की संवेदनशीलता के आधार पर कुछ फोटोब्लैचिंग अपरिहार्य हो जाएगी। नमूनों को परिवेशी प्रकाश से बचाने और उन्हेंठीकसे स्टोर करने के लिए इस प्रोटोकॉल के हर कदम पर सावधानी बरती जानी चाहिए । हम अनुशंसा करते हैं कि स्लाइड को भविष्य में इमेजिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश-संरक्षित पर संग्रहीत किया जाए।
एक उम्मीदवार सीपीपी के बायोवाइड्रीब्यूशन को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके उपलब्ध हैं जिन्हें विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और तुलनीय परिणाम पैदा कर सकते हैं, हालांकि उन्हें अधिक जटिल सीपीपी लेबलिंग की आवश्यकता हो सकती है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल एक जीवित प्रणाली के संदर्भ में बायोडिब्यूशन डेटा का कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए दो संगत तरीकों का उपयोग करता है, जबकि एक ही नमूने से कोशिकाओं के भीतर पेप्टाइड आंतरिककरण के बारे में अधिक गहराई से जानकारी के अधिग्रहण की अनुमति देता है, इस प्रकार आधे से एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या में कटौती । इन तरीकों का उपयोग उपरोक्त डेटा उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जो यह प्रदर्शित करता है कि दोनों विधियों का उपयोग एक ही जानवर में क्रमिक रूप से किया जा सकता है, और प्रत्येक द्वारा उत्पन्न डेटा की गुणवत्ता। हमारे परिणाम भी सीधे एक मात्रात्मक तरीके से दो तकनीकों के बीच परिणाम सहसंबंधित करने में असमर्थता को उजागर करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
M.Z. और K.S.F. अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास पुरस्कार 17SDG33411180 द्वारा समर्थित हैं, और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से पिट इनोवेशन चैलेंज (PInCh®) के तहत सम्मानित अनुदान द्वारा।
10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
Ethanol | |||
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |