Vi beskriver protokoll för att bedöma graden av transduktion av cell-penetrerande peptid använder ex vivo bildsystem följt av paraffin inbäddning, snittning och confocal fluorescerande mikroskopi med hjärt inriktning peptid som exempel. I vårt protokoll kan ett enda djur användas för att förvärva båda typerna av bildframställning bedömning av samma organ, vilket minskar antalet djur som behövs för studier med hälften.
Sedan den första beskrivningen av proteintransduktionsdomäner, även känd som cellpenetrerande peptider, för över 25 år sedan, har det funnits ett intensivt intresse av att utveckla dessa peptider, särskilt cellspecifika, som nya vektorer för att leverera diagnostiska och terapeutiska material. Vårt tidigare arbete med display identifierat en ny, nonnaturally inträffar, 12 aminosyra-lång peptid som vi heter hjärt inriktning peptid (CTP) på grund av att dess förmåga att transduce normala hjärtvävnad in vivo med topp upptag ses i så lite som 15 min efter en intravenös injektion. Vi har genomfört detaljerade biodistribution studier genom att injicera CTP märkt med fluorofore cyanine5.5, gör det möjligt att cirkulera under olika tidsperioder, och avlivning, fastställande och snittning flera organ följt av fluorescerande mikroskopi imaging. I denna publikation beskriver vi dessa processer samt ex vivo imaging av skördade organ med hjälp av en in vivo bildsystem i detalj. Vi tillhandahåller detaljerade metoder och metoder för att genomföra transduktion samt biodistributionsstudier med CTP som exempel.
Cellplasmamembranet är en semipermeabel barriär som är nödvändig för cellintegritet och överlevnad och tjänar till att reglera cellens inre genom att kontrollera förflyttningen av ämnen in i cellen. Även om det är avgörande för överlevnad, utgör det också ett hinder för leverans av last till cellen. I 1988, trans-aktivator av transkription (Tat) protein av humant immunbristvirus visade sig komma in odlade celler och främja viral gen uttryck1,2, med de domäner som ansvarar för denna transduktion begränsas till en arginin och lysin rika 13-aminosyra regionen i den tredje helix3 Dessa var således namngivna cell penetrerande peptider (CPPs). Detta följdes av forskning som visar tatpeptens förmåga att bära funktionell β-galactosidase till flera celltyper4. Sedan den första beskrivningen har antalet cellpenetrerande peptider ökat dramatiskt. Dessa transduktionsdomäner är naturligt förekommande eller syntetiska korta peptider, vanligtvis 6−20 aminosyror långa, som kan bära funktionella laster över cellmembran. Dessa laster kan variera från andra små peptider, fullängdsproteiner, nukleinsyror, nanopartiklar, viruspartiklar, fluorescerande molekyler och radioisotoler5. De ursprungliga CPPs beskrivs var inte cellspecifika, med Tat tas upp av flera celltyper och även passerar blod – hjärnbarriären4, vilket begränsar dess terapeutiska potential. För att identifiera cellspecifika CPP, utredare har genomfört display utnyttja stora, kommersiellt tillgängliga bibliotek6. Vårt eget arbete med hjälp av en kombinatorisk in vitro och in vivo display metod ledde till identifiering av en CPP som heter hjärt inriktning peptid (CTP)7, en 12-aminosyra, nonnaturally förekommande peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) som riktar hjärtat med topp upptag på 15 min efter aven perifer intraös injektion8. Med hjälp av immunofluorescent colocalization med aktin, en intracellulär markör, och uteslutning av laminin, en cellmembran markör, visade vi att CTP internaliseras till mus kardiomyocyter efter en intravenös injektion7. Dessutom inkuberade vi mänskliga inducerad pluripotenta stamceller-härledda slå kardiomyocyter med dubbla märkta CTP, märkt med 6-carboxyfluorescein vid dess C-ändstation och rhodamin vid dess N-ändstation genom en ester länkage som endast kunde klyvas bort av intracellulära esterases. Snabb ansamling av rhodamin till att slå kardiomyocyter observerades inom 15 min på konfokalmikroskopi8.
I den här artikeln presenterar vi två kostnadsfria metoder som kan användas för att spåra biodistribution och bekräfta vävnadsspecifik internalisering av CPP med HJÄLP AV CTP som exempel. För dessa metoder var CTP syntetiseras, fluorescerande märkt vid N-ändstationen med cyanine5.5 (CY5.5), och amid-capped vid C-ändstationen för större peptid stabilitet. De två metoder som används är in vivo fluorescerande optiska bildsystem och fluorescerande mikroskopi av vävnadssektioner. Båda metoderna är mycket användbara för att studera biodistribution, upptag och eliminering av fluorescerande märkta CPP. Fördelen med att bedöma biodistribution med hjälp av dessa metoder framför andra, såsom single-photon emissions tomography (SPECT) eller positron emissions tomography (PET), är att det inte finns något behov av tidsintensiva radiomärkning av CPP jämfört med fluorescerande märkning, vilket är relativt lätt och i rutinmässig användning vid alla peptidsyntesanläggningar. Användningen av in vivo imaging producerar snabbt biodistribution data i samband med ett levande system, medan snittning ger mer djupgående information om peptid upptag och lokalisering inom celler via bevarandet av morfologiska detaljer. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika organ och vävnader såsom hjärta, lunga, lever, njure, hjärna, mjälte, mage, tjocktarmen, tunntarmen, skelettmuskulaturen, ben, testiklar / äggstockar, och ögon.
Djurmodeller är nödvändiga för preklinisk läkemedelsutveckling i varje skede av processen från identifiering av nya CPP, biodistributionsstudier, mekanism för transduktion, till testning för effekten av den levererade lasten med hjälp av dessa nya CPP som vektorer. Det finns många vanliga metoder för att bedöma biodistribution såsom histologi, nukleärmedicin imaging (SPECT och PET), och in vivo optisk avbildning12. Nukleära avbildningsmetoder kan vara besvärliga på grund av den begränsade tillgången på små djur SPECT och PET-system, liksom förmågan att producera radiolabel-drog konjugat, som kräver expertis av en radiokemist. Däremot är fluorescerande etiketter mycket enklare och kan vara kostnadseffektiva att arbeta med. Det protokoll som beskrivs i detta dokument möjliggör snabb analys av biodistribution med hjälp av flera metoder. Ex vivo hela organ fluorescerande optisk avbildning möjliggör omedelbar jämförelse av fluorescens över olika vävnader och behandlingsgrupper och kan identifiera organupptag och tid till topp upptag i organ av intresse på ett semikvantitativt sätt. Kvantitativ vävnad histologi kräver mer omfattande bearbetning för att behandla, avsnitt, bild, och analysera vävnader, men det ger mer data på mikroskopisk nivå och är en aktuell standardteknik. Det är värt att notera att direkt, kvantitativ jämförelse över de två teknikerna inte är möjligt, eftersom autofluorescensen sett med varje teknik för olika organ och excitation våglängder varierar avsevärt.
En viktig del av detta protokoll är att välja rätt fluorofore för att märka kandidat CPP för experiment. En potentiell fråga är spektra överlappning, vilket kan vara problematiskt när flera fluorofores behövs. DAPI-lysrörsmonteringsmaterialet och Cy5.5 har inte överlappande spektra. För vissa tillämpningar där flera fluoroforeer behövs måste dock risken för spektralöverlappning övervägas noggrant. Beroende på vilket system som används kan valet av fluorofore begränsas. Därför är kunskap om systemets kapacitet nyckeln. Fluorescerande optiska system används bäst med långröda eller nära infraröda fluorofores på grund av den höga vävnadsabsorptionen av kortare våglängder13. Fluorofores i intervallet förbättrade gröna fluorescerande protein har en stor begränsning, eftersom det finns betydande organ autofluorescens sett vid dess excitation våglängd, särskilt i hjärnan och levervävnad. Beroende på villkoren för ett experiment undviks vissa fluorofores bäst. Vissa vattenlösliga organiska fluorofores har en stark interaktion med lipid bilayers, vilket kan orsaka falska positiva. Därför, vidta åtgärder för att avgöra om en fluorofore har stark affinitet till vävnad av intresse är lämpligt14. En annan faktor att tänka på är att välja lämplig metod för fluoroforekonjugering, vilket kan vara en viktig parameter som påverkar resultaten. CpPs kan märkas fluorescerande vid N- eller C-ändstationen genom en kovalent bindning mellan N-ändstationen i peptiden och karboxylgruppen av färgen såsom Cy5.5-NHS. Försiktighet bör iakttas, eftersom mekanismen för transduktion av de flesta CPPs inte förstås i detalj och konjugation i ena änden kan påverka upptag mekanismen mer än i andra änden. En annan möjlighet för märkning av cpps är genom att biotinylera N-ändelsen för konjugering till fluorescerande märkt streptavidin. Med hjälp av denna strategi har bekvämligheten med att tillåta olika fluorescerande streptavidin konjugat som skall utnyttjas. En möjlig begränsning av denna strategi är dock att ett biotin-streptavidin komplex är en stor konstruktion, som potentiellt skulle kunna störa transduktion.
Fluorescerande optiska bildsystem är en effektiv strategi för att generera jämförelse av fluorescens mellan olika organ och behandlingar effektivt men är oförmögna att producera ett kvantitativt mått på absoluta koncentrationer i vävnad. Detta beror på ljusspridning effekter i vävnaden, som ytterligare förvärras av naturligt förekommande sort i vävnad storlekar och tätheter, och skillnader i vaskularitet, med variabel fluorescens spridning. Vävnad autofluorescens kan vara en faktor också, på grund av naturligt förekommande biokemiska källor såsom kollagen, eller kostkällor som klorofyll i livsmedel13.
Histologi är den vanligaste metoden för att mäta biodistribution och kan potentiellt användas för att noggrant mäta och jämföra upptag över olika vävnader över tiden. Ljusspridningsproblem undviks med denna metod eftersom alla vävnader är sektionerade med samma tjocklek15. En stor fördel med denna metod är förmågan att inkludera ytterligare fluorescerande etiketter postsectioning för immunohistochemistry. Även om tillägg av en annan fluorofore kan göra imaging mer utmanande, kan användningen av fluorescerande etiketter vara användbart för lokalisering av en CPP till särskilda intracellulära fack, som lysosomer eller mitokondrierna. En antikropp kan användas i en confocal mikroskopi experiment för att avgöra om en transduced kandidat CPP colocalizes med en struktur av intresse, som kan visa potentialen hos en CPP som en leverans agent. En begränsning av denna metod är att beredning av bilder från organprover kan vara tidskrävande, arbetsintensiva och benägna att mänskliga fel12,15. När bildbilder tas, var försiktig så att du inte avbildar samma plats för länge för att undvika fotoblekning. Vissa fotobleaching kommer att vara oundvikligt, beroende på känsligheten hos fluorofore. Försiktighet bör iakttas vid varje steg i detta protokoll för att skydda proverna från omgivande ljus och förvara dem ordentligt16. Vi rekommenderar att diabilder förvaras vid 4 °C, ljusskyddade, för framtida bildbehandling.
Det finns en mängd olika metoder för att mäta biodistribution av en kandidat CPP som kräver specialiserad utrustning och kan ge jämförbara resultat, även om de kan kräva mer komplexa CPP märkning. Det protokoll som beskrivs i detta dokument använder två kompatibla metoder för att effektivt producera biodistributionsdata inom ramen för ett levande system samtidigt som det möjliggör förvärv av mer djupgående information om peptid internalisering inom celler från samma prov, vilket minskar antalet djur som behövs för en studie med hälften. Dessa metoder användes för att generera ovanstående data, som visar att båda metoderna kan användas sekventiellt i samma djur, och kvaliteten på de data som genereras av varje. Våra resultat belyser också oförmågan att direkt korrelera resultaten mellan de två teknikerna på ett kvantitativt sätt.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. och K.S.F. stöds av American Heart Association Scientist Development Award 17SDG3341180, och av ett bidrag som beviljas under Pitt Innovation Challenge (PInCh®), genom Clinical and Translational Science Institute vid University of Pittsburgh.
10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
Ethanol | |||
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |