Summary
כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.
Abstract
כימות ההבדלים mRNA שפע היא גישה קלאסית להבין את ההשפעה של מוטציה גן נתון על פיזיולוגיה התא. עם זאת, אפיון ההבדלים ב translatome (כל התרגום mRNAs) מספק שכבה נוספת של מידע שימושי במיוחד כאשר מנסים להבין את הפונקציה של RNA ויסות או מחייב חלבונים. מספר שיטות לביצוע זה פותחו, כולל הריבוכמה פרופיל וניתוח polysome. עם זאת, שתי השיטות נושאות אתגרים טכניים משמעותיים ואין אפשרות להחילם על אוכלוסיות תאים ספציפיות בתוך רקמה, אלא בשילוב עם שיטות מיון נוספות. לעומת זאת, השיטה של ריבוtag היא חלופה מבוססת גנטית, יעילה ומבחינה טכנית, המאפשרת זיהוי של מספר הריבוסים המשויכים של RNAs מאוכלוסיות תאים מסוימות מבלי להוסיף שלבי מיון שנוספו, בתנאי שמנהל התקן של יצור ספציפי לתא זמין. שיטה זו מורכבת הרבייה כדי ליצור את המודלים הגנטיים, אוסף לדוגמה, immunoprecipitation, ו-RNA ניתוח במורד הזרם. כאן, אנו מתווה את התהליך הזה בוגרים הזכר העכבר הנבט תאים המוטציה עבור חלבון איגוד RNA הנדרש פוריות הזכר. תשומת לב מיוחדת משולמת לשיקולים להתרבות עם דגש על ניהול מושבה יעיל והדור של רקע גנטי נכון וimmunoprecipitation על מנת להפחית את הרקע ולמטב את התפוקה. דיון על אפשרויות פתרון בעיות, ניסויים confirmatory נוספים, ויישומים פוטנציאליים במורד הזרם כלולים גם. הכלים הגנטיים המוצגים הפרוטוקולים המולקולריים מייצגים דרך רבת עוצמה כדי לתאר את הריבוכמה הקשורים RNAs של אוכלוסיות תאים ספציפיות ברקמות מורכבות או במערכות עם אחסון mRNA ותרגום עם המטרה של הסברה על נהגים מולקולריים של פנוטיפים מוטנטים.
Introduction
ניתוח של שגשוג של תא או של רקמה, כפי שנבדק על ידי microarray או RNA-רצפי, הוכיחה כלי רב עוצמה כדי להבין את הנהגים המולקולריים של פנוטיפים מוטנטים. עם זאת, כלי ניתוח לא שלם יחסית לא יכול להודיע על הפיזיולוגיה או הפרוטאום של התא, במיוחד במערכות בהן mRNAs רבים מאוחסנים לפני התרגום כגון תאים עצביים ונבט. במערכות אלה, הגדרת האוכלוסייה של mrnas להיות מתורגם באופן פעיל לחלבונים, או הטרנסלציה של התא, יכול להיות אינדיקטור טוב יותר של המצב הפיזיולוגי הממשי של התא1,2. לדוגמה, תאי הנבט בשלבים שונים של התפתחות מתעתור RNAs כי הם מאוחסנים לתרגום מאוחר יותר, מונע על ידי התפתחות3 או איתות רמזים4. תהליך זה הוא לידי ביטוי על ידי mrnas קידוד protamines, שבו התמליל mrnas הוא לגילוי ימים לפני החלבון הוא עשה1,2,5,6. כמו כן, תאים עצביים מתעתיק RNA בגרעין ולהעביר אותו למטה axon, כמו במקרה עם β-actin7. בנוסף מערכות אלה תאים מיוחדים, מדינה יציבה הטרנססקריפט הם לא סביר להיות אינפורמטיבי במודלים שבו אחסון RNA, הריבוספר biogenesis, או תרגום mRNA מושפעים. גורמים אחרים מרובים עשויים גם להשפיע על המצב היציב של התא בריכת RNA כוללים את הריקבון mRNA ואת הפעילות של החלבונים איגוד RNA. במקרים אלה, כלים חזקים לניתוח RNAs או mRNAs המשויכים לחומרים תחת תרגום פעיל נוטים יותר להניב תוצאות רלוונטיות ביולוגית.
לשם כך, פותחו מספר שיטות לזיהוי הודעות הריבוחלק או הקשורות לתרגום פעיל. Polysome פרופיל, אשר מספק תמונה של הריבוכמה התעתיקים המשויכים, נעשה שימוש במשך עשורים רבים כדי לבודד RNAs שלמים הקשורים עם או הריבוזומלית או מונו-, di-, ו פולי-ריבוכמה מתחמי3. בקצרה, שנאספו lysates התא מוחלים על מעבר הדרגתי ומcentrifuged כמו מהירות גבוהה, וכתוצאה מכך הפרדת הריבוכמה יחידות המשנה, ריבוזומים שלמים, ו פוליזומים לפי גודל. באופן מסורתי, טכניקה זו הוחלה על מנת ללמוד מספר רב של mrnas, אבל לאחרונה שיטה זו שולבו עם המחקרים RNA-seq כדי להבהיר את הפונקציה של הרגולטורים הפוטנציאל translational8,9 בעוד דרך רבת עוצמה כדי להבדיל בין התרגום הפעיל לתרגם מרחוק mrnas10, polysome פרופילים דורש שיטות גוזלת זמן (שבירה הדרגתי ו ultracentrifuge) והוא יכול לדרוש הרבה מדגם ביצוע אוכלוסיות מאתגרות.
גישה חלופית כדי לבחון את הטרנסלטורה היא יצירת פרופיל ריבוזום, אשר מזהה את החלקים של התעתיקים הקשורים ישירות הריבוזום. בקצרה, ריבוכמה שברי הקשורים RNA מופקים באמצעות הגנה RNase, הריבוכמה מתחמי מופרדים באמצעות מעבר סוכות, ושברי הקשורים RNA מבודדים ומומרים לתגי RNA-seq מוכן לרצף עמוק11. אחד היתרונות המרכזיים ביצירת פרופיל ריבוכמה הוא היכולת לקבוע את המיקומים הספציפיים של הריבוזומים בזמן הבידוד המאפשר זיהוי של אתרי התחלה של תרגום, חישוב של תפוסת הריבוזומתית והפצה, וזיהוי של הריבוכמה דוכנים12. עם זאת, שיטה זו כוללת מספר חסרונות הטבועים ביניהם, כולל צרכי ציוד (שבירה וultracentrifuge), פרוטוקול מורכב יחסית הדורש פתרון בעיות נרחב, וסוגיות חישוביות שאינן מטופלות בקלות על ידי משתמש לא מנוסה11. חשוב לעשות זאת, באמצעות פרופיל ריבוחלק מוחל בעיקר על תאים מבודדים בתרבות ודורש חומר משמעותי, מה שהופך את היישום שלה לרקמות מעורבות מסוג תא או תאים ממוינים מתוך vivo מוגבל.
שיטת הריבוטג של היונקים, שפותחה על ידי צאנז ואח ' ב-200913, מבטלת מספר בעיות הטמונות הן polysome והן הריבוכמה פרופילים. בשיטה זו, rnas הקשורים בריבוחלק יכול להיות מבודד מתוך סוגי תאים ספציפיים המאפשרים חקירה של מסוג תאים מסוימים translatomes ברקמות מורכבות ללא טכניקות בידוד נוסף ציוד מיוחדות, כפי שנדרש בשיטות אחרות13,14. הבסיס של שיטת ריבותג הוא מודל העכבר הטרנסגניים (ריבותג) נושא מקום שונה עבור הגן החלבון הריבוRpl22של שנות ה-60. מקום זה (Rpl22-HA) כולל מסוף מוסף אקסון ואחריו עותק נוסף של אקסון מסוף שתוקן כדי לכלול C-terminal hemagגלוטין (HA) תג בתוך אזור הקידוד. כאשר חצה את העכבר המבטא Recombinase הספציפיים התא, אקסון מסומן מוסר המאפשר את הביטוי של HA-tagged RPL22 באופן ספציפי לתא (איור 1). לאחר מכן ניתן להשתמש בתג HA לimmunoprecipitate (IP) ולסוגי RNAs המשויכים להם מסוג התא שנבחר.
בנוסף לפרסום הראשוני שפיתח את הטכניקה, מספר מעבדות אחרות השתמשו במודל הריבוטג. רקמות מגוונות כגון עכבר sertoli ו ליידיג תאים15, מיקרוגלייה16, נוירונים בגיל17,18, oocytes19, ותאים מתורבת20 כבר פרופיל ולמד. למרות שפרוטוקול זה מסוגל באופן ברור לבודד את הריבוזומים ואת ה-RNAs המשויכים לאורך סוגי רקמות מגוונים, יש עדיין אזורים הזקוקים לשיפור, במיוחד כאשר הם מוחלים על מערכות מוטאנטים. בפרט, הסתמכות משותפת על תוצאות הרקמה הטרייה וריאציה טכנית מוגברת, אשר יכולה להפחית במידה ניכרת את כוחה של הניתוח. שנית, זיהוי בטוח של מטרות מתורגמות מבחינה דיפרנציאלי מאתגרת יותר כאשר הרקע הimmunoprecipitation גבוה מתרחש מסוגים שונים של תאים משולביםמחדש כפי שדווח בעבר13. בעוד שצאנז ואח ' מהונדסים את ההנחה הבסיסית של הטכניקה, בכתב יד זה המעבדה סניידר מציג אופטימיזציה של הפרוטוקול כדי להפחית את החששות הללו, עיבוד השיטה מעשית יותר ויעיל.
הכוונה של מאמר זה היא להסביר את השלבים עבור עכברים רבייה המבטא הריבוזומים הספציפיים לתא, immunoprecipitating הריבוזומים אלה מדגימות פלאש קפוא, וטיהור RNAs המשויכים שלהם עבור ניתוחי במורד הזרם. כמו תא הנבט זכר היונקים ומוטציה פוריות לחקור לספק אתגרים ייחודיים, נעשו מאמצים להאיר דרכים טכניקה זו ניתן להתאים למערכות תאים אחרים.
Protocol
כל השימוש בעלי חיים וטיפול שיטות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים פנימיים של אוניברסיטת רטגרס והשימוש הוועדה (IACUC).
1. רבייה של העכבר
- גזע עכברים נקבה homozygous עבור מוטציה חלבון מחייב RNA המוביל לפוריות זכר (כתב יד בהכנה, המכונה להלן גן העניין) ב טריו הוויות לזכרים hemizygous עבור Stra8-icre אלל (B6. FVB-Tg (Stra8-Icre) 1 ר'/LguJ), כזיווג שתי נקבות לכל גבר מגביר את יעילות הרבייה.
הערה: גן מוטציה של עניין (ז) עבר maternally, כמו נקבות homozygous עבור M יש פוריות נורמלית. זה יש יתרון נוסף של מתן העברה אבהית של תאים הנבט של הזכר (hemizygous), כמומלץ21 ואופטימיזציה את אחוז הצאצאים עם השילוב הרצוי allelic. בגלל homozygous cres התערוכה הרעלים תא הנבט22, מומלץ אלל להישמר ועבר במצב heterozygous או hemizygous. חשוב מכך , ביטוי היצור אינו חייב להופיע עם Rpl22-HA אלל עד האוכלוסיה הניסיונית. כישלון לבודד את Rpl22-HA אלל מן היצורים בעלי חיים להתרבות יגרום לצאצאים כי באופן גלובלי express Rpl22-HA עקב פעילות הנבט היצור של התא. בעיה זו ספציפית לתא הנבט. בנוסף, Stra8-i היצור הוא ספציפי לאוכלוסיית המחברים של העניין22, מיקודהתאים המעבר לתוך מוקדם מאוד בשנת, כולל preleptotenes ו leptotenes. במקום זאת ניתן להשתמש בהתקן מנהל התקן שונה הספציפי לסוג תא אחר של עניין. המנהג המקובל מכתיב שהתא הנבט הגברי הביע את Cres להיות משודר בצד האבהי. עם זאת, זה אפשרי שידור אימהי של Stra8-i היצור יגרום ביטוי דומה transgene בצאצא זכר. ללא קשר למזימת הרבייה, על מנת ליצור צאצאים עם ביטוי שווה ערך, כל הדגימות הנסיוניות צריך להיווצר באמצעות שידור הקשר מאותו צד הורי (או תמיד אימהית או תמיד אבהי). - הגורים הזכרים כתוצאה ממנו כמתואר בסעיף 2.4. בחר את הנושאים שנשאו את ה-אלל וחיובי עבור היצור (+/M: היצורים +) עבור הרבייה במורד הזרם .
- מתרבים עכברים נקבה homozygous עבור האני הטוב ביותר בשלישייה לזכרים Homozygous עבור Rpl22-HA (B6J. 129 (Cg)-Rpl22tm 1.1 psam/sjj).
הערה: Rpl22-HA הרקע הוא מעורב מאוד, אז הטיפול צריך להיות מתרגל בעת הערכת פנוטיפים ספציפיים למתח. - הגנוטיפ כתוצאה מגורי הנשים כדי לזהות אותם הנושאים את ה -אלל וחיובי עבור Rpl22-ha (+/m: Rpl22-ha +) (ראה סעיף 2.3). בחר את הנקבות האלה. לגידול במורד הזרם
- Cross +/M: היצור + זכרים עם +/m: Rpl22 + נקבות בשלישייה מתגים. גנוטיפ את הגורים כתוצאה (ראה סעיפים 2.3 ו-2.4) כדי לזהות זכרים שהם שני היצורים Rpl22 + ו או מסוג wildtype m/m.
הערה: מאחר שעבודה זו מתמקדת במוטציה וכתוצאה מהפוריות הגברית השלמה, שיקולים מיוחדים ננקטו במסגרת הרבייה כדי להשיג בצורה היעילה ביותר את הגנוטיפים הניסיוניים המבוקשים. שיקולים כאלה עשויים להיות לא נחוצים במודלים ניסיוניים אחרים. ראה איור 2 עבור שרטוט מלאה של הרבייה והמקרא הנלווה לדיון נוסף על שיקולי רבייה.
2. אוסף דוגמאות
- איסוף האשכים מעכברים זכר ב 21 ימים post-לידתי (dpp).
- להקריב עכברים על ידי CO2 שאיפת ואחריו פריקה צוואר הרחם. לעשות חתך הגחוני (3 ס מ) על כל חיה מוקף 2 קצר (2 ס מ כל אחד), מחובר חתכים לרוחב. משוך את העור וצפק בחזרה כדי לחשוף את האשכים.
- באמצעות מלקחיים, משוך את משטח השומן epidymal מצדו האחד של חלל הגוף כדי לחשוף את האפידיאמיס ואת הבערות. עם המספריים לחיתוך, כבלו את האלות, דואגים לקצץ באפידיסטיות, בשומן שמסביב, ובכל ואצלב חיצוני. הניחו את האשכים ללא שינוי בצינור 1.7 mL נקי.
- חזור עם הצד השני, הוספת האשכים השני לצינור הראשון. פקק צינור זה ומיד להטביע אותו בחנקן נוזלי כדי הבזק-להקפיא.
הערה: ניתן לשמור דגימות ב-80 ° צ' עד השימוש.
- לאסוף דגימות נוספות הזנב עבור כל חיה (2 מ"מ) עבור אישור גנוטיפ.
- כדי לחלץ את ה-DNA, להוסיף 100 μL של 50 mM NaOH לקצה 2 מ"מ הזנב ב שפופרת 1.7 mL ו מרתיחים ב 95 ° c עבור 30 דקות. הוסף 100 μL של 50 mM HCl ו 20 μL של 1 M טריס-HCl ב8.0 ודגימות צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 10,000 x g. שמור על supernatant (המכיל DNA גנומית) ולאחסן ה-DNA שחולצו ב 4 ° צ' עד להשתמש כתבנית עבור תגובות ה-גנוהקלדה הבאים.
- לבצע Rpl22-HA הקלדה בעקבות שיטה המותאמת מצאנז ואח '13 באמצעות התחל הבאים: קדימה: 5 ' השקפה 3 '; הפוך: 5 ' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3 '.
- להכין תערובת התגובה המורכבת 2 μL של ה-DNA כפי שחולץ בשלב 2.2.1, 0.08 μL של 25 מ"מ dNTPs, 0.1 μL של 10 מ"מ לפני התחל, 0.1 μL של 10 מ"מ פריימר הפוכה, 2 μL של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מאגר (650 mM Tris pH = 8.8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 מ"מ mgcl2, ו 0.1% 14), 0.2 μl של taq פולימראז, ו nuclease-H חינם2O לנפח כולל של 20 μl.
- השתמש בתנאים התרמותרמיים הבאים: שלושים וחמש מעלות התכה ב-95 ° c, 30 ס מ בשעה 64 ° c והתארכות 30 ב-72 ° c, חוזרות ו37 נשנות עם התארכות האחרונות של 5 דקות ב-72 ° c.
הערה: זה הניב גודל מוצר של 260 bp עבור דגימות wildtype ו 292 bp עבור דגימות שהיו Rpl22-HA +
- ביצוע הגנוטיפים באמצעות התחל הבא: קדימה: 5 ' GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3 '; הפוך: 5 ' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3 '. הכינו את תגובת ה-PCR כמתואר בשלב 2.3.2 ניצול התחל במקום . השתמש בתנאים התרמותרמיים הבאים: צעד ההיתוך של 30 ס מ ב-95 ° c, 30 ס מ בשעה 60 ° c והתארכות של 15 מעלות ב-72 ° c, חוזרות ו35 נשנות עם התארכות האחרונות של 5 דקות ב-72 ° c.
- לבצע גנים של מתעניין הריבית כפי שהוא סטנדרטי עבור הגן הנדון.
הערה: פרוטוקול ההקלדה של המחבר מנצל Taqמותאם אישית מרוכז, וככזה, ייתכן שמשתמשים אחרים יוכלו לשנות את התנאים כדי להתאים לדרישות האנזימטיות שלהם. כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של הגן הזה של הפסד של עניין על התרגום, זכרים שהיו או wildtype או homozygous עבור אלל מוטציה של עניין, כי היו גם היצורים + ו Rpl22 + נבחרו להיות דגימות ניסיוני. בחירת הגנוטיפ נוספת נדונה לעיל בסעיף 1.
3. הכנת פתרונות
הערה: הכנת הפתרונות וכל הצעדים הבאים חייבים להתבצע בתנאים מוקדמים.
- כדי להכין את מאגר המגון (HB), להוסיף 2.5 mL של 1 M Tris pH 7.4, 5 מ ל 1 M KCl, 600 μL של 1 M MgCl2, ו 500 ΜL של NP-40 כדי שפופרת של 50 mL. להביא נפח (50 mL) ב דיאתיל פירוקרבונט (depc) H2O ו mix עד כל הרכיבים משולבים.
הערה: הריכוזים הסופיים יהיו כדלקמן: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 מ"מ MgCl2, ו 1% NP-40. - כדי להכין מאגר שטיפת מלח גבוה (HSWB), להוסיף 2.5 mL של 1 M Tris pH 7.4, 15 מ ל של 1 M KCl, 600 μL של 1 M MgCl2, ו 500 ΜL של NP-40 כדי שפופרת של 50 mL. להביא נפח (50 mL) ב DEPC H2O ו mix עד כל הרכיבים משולבים.
הערה: הריכוזים הסופיים יהיו כדלקמן: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, ו 1% NP-40the פרוטוקול ניתן להשהות כאן, ופתרונות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד השימוש.
4. הכנת רקמה
- שוקלים מראש את כל הצינורות לדוגמה, הקלטה משקל, ו להתקרר בחנקן נוזלי.
- , חומר מליטה סטרילי, פטל. ושקילה על קרח יבש
- טוחנים את דגימות הרקמה הקפואות לאבקה משובחת באמצעות מרגמה מקוררת ומכתש סטרילי על קרח יבש.
- מניחים את הרקמה הקפואה. לחומר מליטה על קרח יבש בעדינות לשבור רקמות לתוך חתיכות גדולות באמצעות כתש וטוחנים לאט עד הרקמה היא אבקה טובה.
הערה: למרות רקמה טרייה יכול לשמש גם, לפי הפרוטוקול המקורי13, אין הבדל משמעותי בתוצאה היא נצפתה עם שימוש של ממחטות פלאש-קפוא. לפרטים, ראה תוצאות מייצגות ודיון. - בזהירות להעביר מדגם הקרקע כדי לקרר את הקולקציה באמצעות אבקת גירוד מחומר מליטה באמצעות מרית מקורר. להבטיח רק רקמות נאסף ולא כל לחות שהופקדו על המרגמה הקרה.
- שוקלים את השפופרת עם רקמה, מטפלת לשמור על קרח יבש מתי שאפשר. חישוב מסה של הרקמה על ידי הפחתת המשקל הראשוני של הצינורית מן המשקל של הצינור עם המדגם בו. הקלט ערך זה לחישוב מאוחר יותר של אמצעי אחסון של מאגר הליזה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן דגימות ב-80 ° צ' עד לשימוש.
- מניחים את הרקמה הקפואה. לחומר מליטה על קרח יבש בעדינות לשבור רקמות לתוך חתיכות גדולות באמצעות כתש וטוחנים לאט עד הרקמה היא אבקה טובה.
5. הומוגון לדוגמה
- הכנת מאגר לפירוק (10 מ ל HB + תוספי מזון) על ידי הוספת 10 μL של 1 M dithiothreitol (DTT), 1 הלוח מעכב פרוטאז, 50 μL של RNase מעכב (40,000 יחידות/mL), 200 μL של 5 מ"ג/100 100 mL הפרין ל 10 מ ל של HB. מערבבים עד שכל הרכיבים משולבים ושומרים על קרח עד השימוש.
הערה: הריכוזים הסופיים של תוספי התזונה ב-10 מ ג HB יהיו כדלקמן: 1 מ"מ DTT, 200 U/mL RNase מעכבי, 100 μg/mL, ו 1 מ"ג/mL הפארין. פתרון זה חייב להיות בשימוש 24 שעות של תוספת של תוספי התזונה ניתן לשמור ב 4 ° צ' או על הקרח עד השימוש. - עבור כל 100 מ"ג של מדגם, להוסיף 1 mL של מאגר הליזה. עם הצינורות אותו השתמשו כדי להוסיף את מאגר הליזה, פיפטה בזהירות את התוצאה המתקבלת למעלה ולמטה לתאים רסיס ולערבב. המשך ללטף עד שהדגימה לא תהיה צמיגה עוד, בדרך כלל 25-30 שבצים.
הערה: מכיוון שהפתרון מאוד צמיגי בהתחלה, יש להשתמש בפיפטה בקוטר גדול כדי לערבב את הפתרון. תקן 1000 μL בדרך כלל מספיק עבור 100 מ"ג של רקמות. - הגדר דגימות על קרח 10 דקות עד lyse. ואז, דגימות ספין בצנטריפוגה מקורר (4 ° c) עבור 10 דקות ב 10,000 x g. גדול, משוחרר, גלולה מעונן צריך להיווצר בתחתית הצינור.
- להיזהר לא להפריע את הגלולה, לאסוף את הליפוסט לתוך צינור חדש ולהקליט נפח עבור כל מדגם. כדי למנוע הפחתת דגימה לדוגמה, ודא שהדגימות נשארות קרירות במהלך הפרוטוקול הנותר, אחסון בקרח או ב-4 ° c במידת האפשר.
6. השפה האקליציה של חרוזים
- באמצעות נפח של ליפוסט משלב 5.2, לחשב את הנפח הנדרש של חרוזים מגנטיים מצמידים את החלבון מחייב הנוגדן המתאים (במקרה זה, חלבון G). עבור 1 מ ל של ליפוסט, השימוש 375 μL של מחרוזות חלבון G (30 מ"ג/mL).
הערה: בחירת חרוזים מצוערות ישתנה עם נוגדן אנטי HA בשימוש; לדוגמה, אם הנוגדן שנוצר על-ידי הארנב מסומן, חלבון החרוזים יהיה עדיף. - באמצעות מתלה צינור מגנטי, להסיר הממס חרוז ולהוסיף נפח שווה של מאגר פירוק טרי לחרוזים. סובב 5 דקות ב -4 ° c כדי לשטוף. בצע את כל שלבי הסיבוב באמצעות שפופרת שחקן העליון מוגדר 20 סל ד.
- הנח את השפופרת על מתלה הצינור המגנטי והסר את מאגר הכביסה.
- חזור על שלבים 6.1-6.3 עוד פעמיים.
- הוסף מאגר הליזה באמצעי האחסון המקורי לחרוזי משקל. החנות ב 4 ° צ' או על הקרח עד השימוש.
7. מדגם לניקוי מקדים
- הוסף 50 μL של חרוזים בעלי שיווי משקל עבור כל 1 מ ל של ליפוסט לדוגמא של מדגם lysate (ליפוסט) ולסובב ב 4 ° צ' עבור 1 h.
- הניחו את הצינור על מתלה המגנט ואספו את הצינורית לתוך צינורית טרייה. להשליך חרוזים משומשים.
- לליפוסט להוסיף 25 μL של חרוזים בעלי משקל עבור כל 1 מ ל ולסובב ב 4 ° c עבור 1 h. לאחסן את מחרוזות החלבון המובחנות הנותרות ב-4 ° c בלילה.
- מניחים צינור על מתלה מגנט ולאסוף ליפוסט לתוך צינור חדש. להשליך חרוזים משומשים. מתוך ליפוסט נקי, לשמור 50 μL כדי לפעול כבקרת קלט לדוגמה. חנות ב-80 ° c.
הערה: מדגם הקלט פועל כפקד המייצג את סך כל אוכלוסיית ה-RNA של המדגם, כולל RNAs המשויכים לסוגי תאים אחרים ברקמה, כדי לשמש במהלך ניתוח במורד הזרם כדי לתקן שינויים ביטוי גנים כפונקציה של מוטציה.
8. דגירה של נוגדן
- עבור כל 1 mL של ליפוסט נקי, להוסיף 5 μg של נוגדן אנטי HA. כדי למנוע אובדן דגימה, יש לחתום את פקק הצינור בסרט מעבדה. לסובב דגימות 16 עד 18 h ב -4 ° c.
הערה: הדגירה של נוגדן זמן וריכוז לא היה אופטימיזציה. המחברים מצאו דגירה לילה עם 5 μg להיות מספיק; עם זאת, ייתכן כי דגירה קצר יותר או פחות נוגדן יהיה הולם, או כי דגירה ארוכה יותר או נוגדן יותר ישפר את הכריכה.
9. דגירה של חרוזים
- עבור כל 1 מ ל של ניקוי ליפוסט, להוסיף 300 μL של חרוזי חלבון G. לאטום את פקק הצינור עם סרט מעבדה ולסובב ב-4 מעלות צלזיוס.
10. נטילת חרוזים
- מניחים את הצינור לדוגמה על מתלה מגנט כדי לאפשר חרוזים כדי להפריד מ-IPed ליפוסט. , מוריד את הצינורות. ומתעלם, ושומרים על החרוזים
- החל 800 μL של HSWB לחרוזים ואפשר לסובב למשך 10 דקות ב -4 ° c. מניחים את הצינור לדוגמה על המדף מגנט ולאפשר חרוזים להפריד משטיפה. הסר והתעלם מכביסה.
- החל עוד 800 μL של HSWB לחרוזים. סגור דגימה ואפשר לסובב למשך 5 דקות ב-4 ° c. מניחים את הצינור לדוגמה על המדף מגנט ולאפשר חרוזים להפריד משטיפה. הסר והתעלם מכביסה.
- חזור על שלב 10.3 פעם נוספת.
11. הוצאת רנ א
- מניחים את הצינור לדוגמה על המדף מגנט ולאפשר חרוזים להפריד משטיפה. מנקה את הצנרת ומתעלם משטיפה, מחרוזת שמירה להפקת RNA. להוסיף 3.5 μL של 14.2 M ביתא-mercaptoethanol (bME) כדי חרוזים ולערבב על ידי vortexing עבור 15 s.
- לחלץ RNA באמצעות ערכת טיהור מסחרית RNA, לפי הוראות היצרן. מדגם אליוט בשנת 30 μL של RNase H חינם2O.
הערה: למרות הטיפול DNase 10 μL/לדוגמה הוא אופציונלי עבור רוב ערכות, זה מומלץ מאוד. שלב זה של ניקוי אופציונלי מפחית באופן משמעותי את הרקע, ומאפשר ריכוז סופי מדויק יותר. היא ממליצה בחום להשתמש בערכה המכילה ביתא-mercaptoethanol (bME) במאגר הליזה. bME משמש כמעכב RNase נוסף כדי למנוע השפלה לדוגמה במהלך בידוד RNA. - החנות לדוגמה ב-80 ° c או לנתח מיידית.
12. כימות וניתוח לדוגמה
- באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis, לכמת ריכוז RNA ואיכות מוקדמת.
- לנתח איכות של RNA שחולצו מדגימות באמצעות bioanalyzer.
הערה: RNA שהתקבל יכול לשמש לאחר מכן ברצף RNA או ניתוח אחר במורד הזרם כגון היפוך כמותי או תמלול הפוכה (רביעיית PCR).
Representative Results
הדיווחים הקודמים הציעו immunoprecipitation לא ספציפיים מתאים החסרים בתאי14. על מנת לקבוע אם זה היה במקרה בפרוטוקול שונה שלנו, יעילות IP נקבע בדגימות נגזר בעלי חיים שנשאו שני היצורים וגם Rpl22-HA ובעלי חיים שנשאו רק אחד, אבל לא השני עם הציפייה כי ללא שני הנהג, Rpl22-HA, immunoprecipitated RNA צריך להיות מינימלי. כפי שמוצג באיור 3, מעט מאוד RNA הוא מבודד מדגימות חסר או יצורים או Rpl22-HA להפגין את האפקטיביות של פרוטוקול זה כדי להפחית את רקע ה-IP בידוד הריבומקורית של מתויג HA-rnas. יתר על כן, הן רק הדגימות שלהיצור בלבד והן של Rpl22-HA-בלבד מייצגות פקדים שליליים מתאימים.
לאור הפוטנציאל למקור מגיב כדי להשפיע באופן משמעותי את היעילות של ה-IP, סדרה של נוגדנים ופרוטוקולים בידוד RNA נבדקו (איור 4) ביצור Rpl22-HA דגימות חיוביות. תוצאות אלה להפגין בחירה מגיב יכול להיות השפעה משמעותית על יעילות IP ולכן כל שינוי הבחירה מגיב צריך להיעשות כל כך בזהירות.
כדי לבדוק את הפרוטוקול הזה בהקשר של מוטציה של חלבון ה-RNA, מסוג wildtype+ Rpl22-ha + (ווילטיפ) ו- גן של עניין-/--היצור + Rpl22-ha + (גן העניין-/-) בדיקות נבדקו לאפקטיביות של מערכת ריבוtag לבודד הריבוכמה RNA הקשורים (איור 5). כאשר הריכוז RNA של קלט wildtype ו-ip הושווה גנים של עניין-/- קלט ו-ip, אין הבדל משמעותי נראה בין גנוסוגים. עם זאת, עבור הגנוטיפים, ריכוז הקלט היה גבוה באופן משמעותי מריכוז ה-IP, והצביע על כך שהיה יותר רנ א במדגם הקלט (איור 5ב). תוצאה זו צפויה, כמו לא כל הנוכחים mRNAs בתא משויכים הריבוכמה בכל זמן נתון, במיוחד במקרה של תאי הנבט שבו RNAs יכול להיות משועתק הרבה לפני שהם מתורגמים.
כדי לאשר את האיכות של דגימות ה-RNA שנשלחו לרצף, הדגימות הופעל על ביומנתח. מספרי שלמות RNA (RINs), מחושבים בדרך כלל כיחס של 28S ו-18S פסגות rRNA, השוו בין דגימות. בבריכות RNA בסך הכל, ערכי RIN צפויים להיות בקרבת 10 עם מתאם RIN גבוה יותר לשלמות דגימה גבוהה יותר ואיכות. בעוד דגימות ה-IP היה התחתון רין מאשר התשומות, RINs היו עדיין בתוך טווח מקובל ולא היו תלויים גנוטיפ לדוגמה (איור 5ג). ערכי RIN מופחתת עבור דגימות IPed סביר להניח תוצאה של השפלה RNA למרות מאוד קטין בהינתן ירידה קטנה יחסית באורך נוקלאוטיד הממוצע של RNAs מנותח. בהינתן אורך הפרוטוקול והטמפרטורות הנדרשות עבור הimmunoprecipitation חלק מההשפלה צפויה. ייתכן גם שהאורך הקטן של RIN ו-RNA הוא פונקציה של העשרה עבור מינים שאינם rRNA, כגון mRNAs.
איור 1: פעולת השירות ריבוtag. ההנחה של השיטה היא פשוטה ביולוגית. Exon חדש 4 מוכנס לתוך הרצף של Rpl22 לוקוס במורד במורד exon המקורי 4. בנוכחות של מנהל התקן של היצור , אתרים loxp משני צדי האקסון המקורי 4 הם חותכים, מקצץ את האקסון מופד. הHA-מתויג Exon 4 משולבים כעת Rpl22 mrna, יצירת HA מתויג Rpl22 בתאים המבטא את היצור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכימת הרבייה לדוגמה עבור עכברים ריבוtag. מערכת הרבייה המשמשת להפקת. חיות נסיוניות מוצגת . שימוש בשני ראשים היה מנוצל בדור 1 הוקמו שתי סדרות מקבילות של שלישיות מגדלת. צד אחד בשילוב את אלל של עניין (נשא maternally כמו זה מוטציה התוצאות הספציפיות פוריות הזכר) עם הhemizygous ונים ועל השני שילוב אלל של עניין, שוב נשא maternally, עם Rpl22-HA. ואז, בדור 2, זכרים מן הזיווג הראשון שנושאים את אלל של העניין ואת היצור הם חצה צאצאים נקבה של הזיווג השני הנושא את אלל של עניין Rpl22-HA. ה-גנואים של הצאצאים המתקבלים נקבעים, ובעלי חיים רלוונטיים שנבחרו (במקרה זה או מhomozygous או מוטציה הנושאת הן את היצור ואת Rpl22-HA אלס). חשוב לציין כי תא נבט מביעמנהלי התקנים, היצורים Rpl22-HA אללים לא צריך להתרבות יחד עד הדור ניסיוני. חשיפת Rpl22-HA אלל כדי הנבט התא הביע היצורים בדורות הרבייה יהיה לנהוג בתאי הנבט Rpl22-HA כריתה. כל הצאצאים כתוצאה מכך יהיה כללי לבטא Rpl22-HA ובכך למנוע הריבומין ספציפי בידוד. במערכת שתוארה לעיל, n = 4 לכל סוג גנוטיפ סיפק כוח סטטיסטי מספיק עבור ניתוח במורד הזרם. יש לקבוע מספר שכפול ביולוגי עבור כל מערכת ניסויית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אישור של פקדים שליליים. דגימות כי הם היצורים והRpl22-HA + להראות RNA גבוה יותר מאשר דגימות כי הם היצור + או Rpl22-HA + לבד. אין הבדל משמעותי בין היצור + ו -Rpl22-HA + מדגם RNA הנפתח יעילות, המציין כי דגימות חסר או את היצור או Rpl22-HA הם שולט שלילי מתאים. "+" מעיד על כך שהאלייל או הטרנסגנים המקבילים קיימים בדוגמאות אלה ו-"-" מציין את היעדרותו. IP/קלט מייצג את היחס של RNA immunoprecipitated (IP) על סך (קלט) RNA. הערך שחושב מריכוז בננו-גרם. * * מציין p < 0025. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ריאגנטים להשפיע על הפרוטוקול הצלחה. (A) הבזקמוקפארקמות תוצאות יעילות immunoprecipitation דומה לזה של רקמה טרייה. (ב) יעילות IP עבור שני נוגדנים מסחריים נקבעו, המיועד נוגדן 1 ו נוגדן 2 (טבלת חומרים). כאשר נבדק, הנוגדן 1 היה יעיל יותר במשיכת RNA מאשר הנוגדן 2 אשר הופיע להיות מסוגל להבדיל בין שלילי (לא לבטא את היצורים או Rpl22-ha +) ופקדים חיוביים (ביטוי הן היצורים וגם Rpl22-ha +). נקודות מעידה על היחס של הזנה לעומת RNA הקלט עבור משכפל ביולוגי בודד. (ג) כש-RNA מיצוי ערכות (טבלה של חומרים) הושוו, kit 2 משמעותית ביצעה קיט 1. למרות ששני הקיטים הללו כמות דומה של RNA מפקדים שליליים, ערכה 2 הביאה לתשואה של RNA גבוה באופן משמעותי מדגימות חיוביות. * מציין p < 0.05, * * p < 0.025, * * * p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יישום השיטה למודל מוטציה. (א) לדוגמה גן של גנוטיפ הריבית באמצעות הכתמים המערביים באמצעות נוגדן בבית מותאם אישית נגד הגן של חלבון הריבית מדגים גנים של עניין-/- (m/m) זכרים לא מצליחים לייצר את החלבון המשויך. המוצגת כבקרת טעינה. (ב) הפלט הביומנתח הגרפי מדגימות קלט ו-iped מדגמים משויכים לדוגמאות מסוג ומוטציות. (ג) השוואת מספרי שלמות RNA (RIN) לפי סוג דגימה וגנוטיפ. (ד) ממוצע הנוקלאוטיד באורך של מינים RNA שנותחו על ידי סוג מדגם ו-גנוטיפ. * מציין p < 0.05, * * p < 0.025, * * * p < 0.01, נ לא משמעותי. N = 4 לכל סוג של גנוטיפ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמה לאישור מנהל התקן של יצור. קוונפיקציה של גן מתורגם מוקדם בפיתוח תא הנבט (Stra8) ושני גנים שתורגמו מאוחר בפיתוח תא הנבט (Tnp1 ו Prm1) שנותחו על ידי רביעיית-PCR של הIMMUNOPRECIPITATED RNA מ RPL22-HA מונע על ידי שני תאי נבטשונים של החיידק, Stra8-icre (ביטא מוקדם בפיתוח תא הנבט) ו Hspa2-היצורים (הביע בהמשך פיתוח תא הנבט, במיוחד לאחר Stra8 תרגום). כאן, HA-IP של Stra8 מושגת עם מוקדם תא נבט הנהג מנהל התקן אבל לא עם מאוחר יותר תא הנבט מנהל ההתקן להפגין תאים ספציפיות של immunoprecipitation. לעומת זאת, HA-IP של התעתיקים המתורגם בתאי הנבט מאוחר מושגת על ידי שניהם Stra8-iCre ו Hspa2-היצורים. זה צפוי כמו תאים המבטאים Stra8-iCre יפיק הRPL22 המתויג לאורך כל כולו של התפתחותם בעוד אלה המבטא Hspa2-היצורים יעשה זאת במהלך החלקים המאוחרים של התפתחותם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הבנת התרגום של סוג תא מסוים היא לא יסולא בפז להבנת הפיזיולוגיה של התא במצב רגיל או מוטציה. יתרון מיוחד ניתן לראות במערכות שבהן התרגום אינו משולב מתמלול, כגון רקמה עצבית שבה התרגום מתרחש רחוק מאוד מתמלול, או בתאי נבט שבהם התמלול מתרחשת זמן רב לפני התרגום. ביחס לשיטות אחרות של ניתוח translatome, היתרון הגדול ביותר של מערכת ריבותג נובע מהשימוש במערכת recombinase של היצורים . זה מאפשר את החופש למקד כל האוכלוסייה תאים שיש לו מנהל התקן של היצור. שנית, ה-ריבותג IP כפי שמתואר בזאת הוא יעיל והרבה פחות מאתגרת טכנית וגוזלת זמן מאשר או polysome או הריבוכמה פרופילים. לבסוף, הריבותג IP ניתן לבצע בקלות על שחקן הספסל.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הצ ביניהם הוא הקמת קו העכבר הריבותג ויצירת בעלי חיים ניסיוניים ללמידה. באשר לכל הדגמים הגנטיים, מעקב קפדני של אנשים בתוך מושבת העכבר, כמו גם פרוטוקולים מזהירים הקלדה צריך להיות מיושם. ה-PCR הקלדה בהתאם לצאנז ואח ' צריך לכלול מיקוד התחל באתר loxp 5 ' של מסוג wildtype 4 כדי להבחין בין אללים מסוג wildtype (260 bp) ו המוטציות (290 bp)13. עבור המקרה של ניתוח ריבוטג במודלים תא הנבט, דרישות רבייה ספציפיים מאוד צריך להיות דבקה. ראשית, במקרה של מוטציות שגורמות פוריות, אסטרטגיות הרבייה מתחשב צריך לכלול שיטות כדי לייעל את מספר הצאצאים עם גנוטיפ הרצוי בדורות ביניים וניסיוני. שנית, במקרה של תא נבט מסוים Cres, הטיפול צריך להילקח על היצור -הזיבטיות בהתחשב רגישות של תאי הנבט כדי רעילות . בתא הנבט, רמות גבוהות של היצור חלבון יכול להיות השפעות מזיקות22, האוסר על שימוש בבעלי חיים של היצור /היצורים במזימת הרבייה. לבסוף, כאשר משתמשים בתאי הנבט שלהחיידק, חשוב לבודד את אלל הריבותג מן היצור עד הדור הסופי כמו ביטוי היצור בתא הנבט של דור ביניים יגרום צאצאים המבטא Rpl22-HA ברחבי העולם.
ללא קשר למערכת התאים, מספר פקדים מומלצים יכולים לאמת את החוסן של הביטוי והספציפיות של שני הצדדים. ביטוי נאות ליצור שלך וכריתה צפויה של Rpl22-HA ניתן לקבוע באמצעות שיטות מרובות. בתחילה, רקמות מבודדות מבעלי חיים ניסיוניים יכול להיות מוכתם עבור HA באמצעות אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence סנס15. שיטה זו היא אופטימלית בכך שהוא אינו דורש ידע מראש של mrnas מתורגם בסוגי תאי היעד. השיטה השניה, דוגמה המווכחת באיור 6, דורשת מידע מסוים אודות הודעות מווסתות באופן משני בסוגי תאי היעד. בשיטה זו, העשרה עבור mRNA מוסדר מבחינה מבצעית ניתן לאישור מן הנבחרמנהל התקן באמצעות PCR כמותי של iped לעומת RNA קלט. כמו כן, חזקה Rpl22-HA ביטוי יכול להיות מאושר על ידי השוואה של היצור +/rpl22 + דגימות (בקרות חיוביות) עם שני היצורים-/rpl22 + או היצור +/rpl22- דגימות הפועלות כפקדים יעילים שליליים (ראה איור 3). השוואות אלה ניתן על ידי בוצע על סך כולל RNA או העשרה עבור mRNA מוסדר מבחינה מבצעית המוערך על ידי רביעיית ה-PCR או כמה שיטה כמותית אחרת.
בעיות נפוצות בביצוע הפרוטוקול נוטות רק להיות ברור כאשר התשואה RNA הוא נמוך באופן בלתי צפוי או גבוה. הסיבה השכיחה ביותר לכשלים אלה נובעת מהקלדה שגויה של אנשים. אנו ממליצים על שמירה על רקמות נוספות ממדגם שנאסף כדי לאשר גנוטיפים של כל הדגימות במקרה של תשואות בלתי צפויות RNA. פעם אישר, אפשרויות אחרות צריך להיחשב כולל האפשרות של זיהום RNase או השפלה לדוגמה. אחסון זהיר לדוגמה וטיפול ותחזוקה של אזורים חינם RNase בתוך המעבדה יכול להפחית במידה ניכרת או לחסל בעיות אלה. למרות בעיות בידוד RNA הם עוד בעיה פוטנציאלית בפרוטוקול זה, השימוש ערכות מסחריות מפחיתה מאוד את הבעיה הזאת, למרות שצריך לנקוט כדי להבטיח שהם מתוחזקים כמו RNase חינם ולא מכילים פתרונות שפג תוקפם. לבסוף, כמו עם כל הליכים מבוססי נוגדן, וריאציות הרבה, תנאי אחסון, ריכוז, או אפילו משלוח יש את הפוטנציאל להשפיע לרעה את האיכות של הנוגדן ואת ההצלחה הבאה של הנפתח. כתוצאה מכך, בעקבות בדיקות זהירות וחוזרות, בחרנו את הנוגדן העקבי והיעיל ביותר הזמין.
פרוטוקול זה מכיל שני שינויים עיקריים ביחס לפרוטוקולי ריבותג אחרים שפורסמו, המשפרים באופן משמעותי את הסבירות להצלחה. אחד הוא היכולת להשתמש ברקמה הקפואה פלאש, ובכך לממש את כל הנושאים הכרוכים הרבה, טכנאי, או וריאציות הפעלה טכנית. דגימות ניתן לאסוף ולאחסן לאפשר בידוד של הריבוזומים מכל הדגימות בבת אחת, הפחתת מה יכול להיות מקורות עיקריים של וריאציה. שנית, תוספת של צעד מראש מפחית באופן משמעותי את סוג הרקע שדווחו על ידי משתמשים אחרים של מערכת ריבוtag. לאחרונה, דו ח פרוטוקול מאת צאנז ואח ' מציין את הנוכחות של רקע גבוה עקב שפע של התעתיקים הקשורים הריבוחלק מתאים מונעיםמיצורים שאינם מבוססי-יצור14. הפרוטוקול שלנו התרופות בעיה זו על ידי כלילת צעד מראש, ביעילות לחסל את הנוכחות של RNA ביצור דגימות IP שליליות.
כמו כל המערכות, יש לזכור את המגבלות הטמונות במערכת ה-ריבותג. בעת שימוש במנהלי התקנים שאינם מאופיינים, יש לבצע ניתוח של ביטוי לפני הפקת דגימה ניסיונית. מנקודת המבט של התרגום, יש לציין כמה ניואנסים של שיטה זו. ראשית, ריבוtag אינו מאפשר הבדלה בין mRNAs הצפוי לתרגם את אלה באופן פעיל תרגום. ככאלה, שיטות נוכחיות המבוססות על ריבוtag אינן מאפשרות לכמת את יעילות התרגום כפונקציה של mRNAs בודדים. אם יעילות התרגום היא עניין, ניתן למדוד אותה על בסיס ספציפי לתאים אם שיטת הריבותג משולבת עם כלי ניתוח אחרים, כגון יצירת פרופיל פוליזום. שנית, זה בסיסי לקחת בחשבון סה כ שינויים בשפע RNA הנובעים משונות תלויה בודדים או גנוטיפ. מסיבה זו, כי בידוד זהיר של הקלט RNA ללוות immunoprecipitation ודגימות נגזר כל להישאר מזווג בכל ניתוח במורד הזרם. לבסוף, ולגבי ניתוח מבוסס ריבוטג, יש לזכור כי הקשר עם ריבוכמה לא בהכרח להוכיח תרגום מתרחשת. יש לבצע שיטות ניתוח משניות כדי לאשר את הרגולציה הטרנסלבותית ביעדי העניין.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של RNAs המשויכים ל-ריבוחלק מתאי הנבט של עכברים זכרים באמצעות המודל ריבוtag. לא ראיית חשבון לגידול בעכבר ואוסף דגימות, הפרוטוקול לוקח יומיים, עם שלוש שעות ביום הראשון, הטוב ביותר בשעות אחר הצהריים, הדגירה לילה, ואחריו חמש שעות עבודה בשעות הבוקר שלאחר מכן. מומלץ מאוד כי הכנת פתרונות מניות (HB ו HSWB) כמו גם רקמות הגריסה להתבצע מראש. ההצלחה הכוללת של הפרוטוקול תלויה בתנאים הנכונים של ה-גנוטיפים ומסך RNase-free. היכולת לבחון את התרגום של סוגי תאים ספציפיים תאפשר למחקרים עתידיים להבין טוב יותר את הקשר בין שעתוק, תרגום, והפרוטדום בסוגי תאים רבים ורקע מוטציה.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
העבודה הזאת ממומנת על ידי NIH המענק R00HD083521 ל-EMS ותמיכה פנימית מאוניברסיטת רטגרס ל-EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
