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Developmental Biology

पुरुष माउस की रोगाणु कोशिकाओं में रिबोटैग इम्यूनोप्रिसिप्रिमिटेशन

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60927
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Animal Science, Rutgers University

Summary

यहां, हम रिबोटैग सिस्टम का उपयोग करके वयस्क पुरुष माउस रोगाणु कोशिकाओं की चुनिंदा आबादी से राइबोसोम और संबद्ध आरएनए के इम्यूनोप्रिसिप्रिटेशन का वर्णन करते हैं। रणनीतिक प्रजनन और सावधानीपूर्वक इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के परिणामस्वरूप साफ, प्रजनन योग्य परिणाम होते हैं जो रोगाणु कोशिका अनुवाद पर सूचित करते हैं और उत्परिवर्ती फेनोटाइप के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Abstract

एमआरएनए बहुतायत में अंतर का परिमाणकरण सेल फिजियोलॉजी पर दिए गए जीन उत्परिवर्तन के प्रभाव को समझने के लिए एक क्लासिक दृष्टिकोण है। हालांकि, अनुवादमें अंतर की विशेषता (अनुवादित mRNAs के पूरे) विशेष रूप से उपयोगी जानकारी की एक अतिरिक्त परत प्रदान करता है जब आरएनए विनियमन या बाध्यकारी प्रोटीन के कार्य को समझने की कोशिश कर रहा । इसे पूरा करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें राइबोसोम प्रोफाइलिंग और पॉलीसम विश्लेषण शामिल हैं। हालांकि, दोनों विधियों महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों ले और एक ऊतक के भीतर विशिष्ट सेल आबादी के लिए लागू नहीं किया जा सकता है जब तक अतिरिक्त छंटाई तरीकों के साथ संयुक्त । इसके विपरीत, रिबोटैग विधि एक आनुवंशिक आधारित, कुशल और तकनीकी रूप से सीधा विकल्प है जो अतिरिक्त छंटाई चरणों के बिना विशिष्ट सेल आबादी से राइबोसोम संबद्ध आरएनए की पहचान की अनुमति देता है, बशर्ते एक लागू सेल-विशिष्ट क्रे ड्राइवर उपलब्ध हो। इस विधि में आनुवंशिक मॉडल, नमूना संग्रह, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए प्रजनन शामिल है। यहां, हम वयस्क पुरुष माउस रोगाणु कोशिकाओं में इस प्रक्रिया को पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए उत्परिवर्ती की रूपरेखा तैयार करते हैं। पृष्ठभूमि को कम करने और आउटपुट को अनुकूलित करने के लिए कुशल कॉलोनी प्रबंधन और सही आनुवंशिक पृष्ठभूमि और इम्यूनोप्रिसिप्रिशन की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करने के साथ प्रजनन के लिए विचारों पर विशेष ध्यान दिया जाता है। समस्या निवारण विकल्पों की चर्चा, अतिरिक्त पुष्टित्मक प्रयोग, और संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगभी शामिल हैं। प्रस्तुत आनुवंशिक उपकरण और आणविक प्रोटोकॉल जटिल ऊतकों में विशिष्ट सेल आबादी के राइबोसोम-संबद्ध आरएनए का वर्णन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका का प्रतिनिधित्व करते हैं या सिस्टम में उत्परिवर्ती फेनोटाइप के आणविक ड्राइवरों को सूचित करने के लक्ष्य के साथ अदुमराह mRNA भंडारण और अनुवाद के साथ।

Introduction

एक कोशिका या ऊतक की आरएनए बहुतायत का विश्लेषण, जैसा कि माइक्रोरे या आरएनए-अनुक्रमण द्वारा जांच की गई है, ने उत्परिवर्ती फेनोटाइप के आणविक ड्राइवरों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित किया है। हालांकि, ये अपेक्षाकृत अधूरे विश्लेषण उपकरण कोशिका के शरीर विज्ञान या प्रोटेम पर सूचित नहीं कर सकते हैं, विशेष रूप से उन प्रणालियों में जहां तंत्रिका और रोगाणु कोशिकाओं जैसे अनुवाद से पहले कई mRNAs संग्रहीत किए जाते हैं। इन प्रणालियों में, mRNAs की आबादी को परिभाषित करने के सक्रिय रूप से प्रोटीन, या सेल के अनुवाद में अनुवाद किया जा रहा है, सेल के वास्तविक शारीरिक राज्य1,2का एक बेहतर संकेतक हो सकता है । उदाहरण के लिए, विकास के विभिन्न चरणों में रोगाणु कोशिकाएं आरएनए को टाइप करती हैं जो बाद में अनुवाद के लिए संग्रहीत होती हैं, या तो विकासात्मक3 या सिग्नलिंग संकेतों से प्रेरित होतीहैं। इस प्रक्रिया का उदाहरण एमआरएनसीए एनकोडिंग प्रोटामाइंस द्वारा किया जाता है, जिसमें प्रोटीन 1,2,5,6बनाए जाने से पहले एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाने योग्य दिन होता है। इसी तरह, तंत्रिका कोशिकाएं नाभिक में आरएनए को टाइप करती हैं और इसे एक्सॉन के नीचे ले जाती हैं, जैसा कि 7 के साथ मामलाहै। इन विशेष सेल सिस्टम के अलावा, स्थिर-राज्य प्रतिलेखन मॉडलों में जानकारीपूर्ण होने की संभावना नहीं है जहां आरएनए भंडारण, राइबोसोम बायोजेनेसिस, या एमआरएनए अनुवाद प्रभावित होते हैं। कई अन्य कारक भी एक सेल के स्थिर राज्य आरएनए पूल को प्रभावित कर सकते हैं जिसमें एमआरएनए क्षय और आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि शामिल है। इन मामलों में, सक्रिय अनुवाद के तहत राइबोसोम-संबद्ध आरएनए या आरएमनए का विश्लेषण करने के लिए मजबूत उपकरण जैविक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने की अधिक संभावना रखते हैं।

इस उद्देश्य के लिए, राइबोसोम से जुड़े या सक्रिय रूप से अनुवादित संदेशों की पहचान करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। पॉलीसम प्रोफाइलिंग, जो राइबोसोम संबद्ध प्रतिलिपियों का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, कई दशकों से राइबोसोमल उपइकाइयों या मोनो-, डी-और पॉली-राइबोसोम परिसरों3से जुड़े बरकरार आरएनए को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है। संक्षेप में, एकत्र किए गए सेल लिसेट्स को एक रैखिक सुक्रोज ग्रेडिएंट पर लागू किया जाता है और उच्च गति के रूप में केंद्रित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप राइबोसोम उपइकाइयों, बरकरार राइबोसोम और पॉलीसोम ्स को आकार से अलग किया जाता है। परंपरागत रूप से, इस तकनीक को एक या कुछ mRNAs का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, लेकिन हाल ही में इस विधि को आरएनए-सीक्यू अध्ययनों के साथ जोड़ा गया है ताकि संभावित अनुवादात्मक नियामकों8,9 के कार्य को स्पष्ट किया जा सके जबकि सक्रिय रूप से अनुवाद और गैर-अनुवाद करने वाले mRNAs10के बीच अंतर करने का एक शक्तिशाली तरीका, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के लिए समय लेने वाले तरीकों (ढाल अंश और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज) की आवश्यकता होती है आबादी चुनौतीपूर्ण।

अनुवाद की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण राइबोसोम प्रोफाइलिंग है, जो सीधे राइबोसोम से जुड़े टेप के कुछ हिस्सों की पहचान करता है। संक्षेप में, राइबोसोम संबद्ध आरएनए टुकड़े RNase सुरक्षा परख के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, सुक्रोज ढाल के माध्यम से अलग व्यक्तिगत राइबोसोम परिसर, और संबद्ध आरएनए टुकड़े अलग और आरएनए-सीक्यू टैग में परिवर्तित गहरे अनुक्रमण11के लिए उत्तरदायी हैं। राइबोसोम प्रोफाइलिंग के प्रमुख लाभों में से एक अलगाव के समय राइबोसोम्स के विशिष्ट स्थानों को निर्धारित करने की क्षमता है जो अनुवाद शुरू साइटों की पहचान, राइबोसोमल अधिभोग और वितरण की गणना और राइबोसोम स्टालों की पहचान12की अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि में उपकरणों की जरूरत (ढाल आंशिक और अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज) सहित कई अंतर्निहित कमियां हैं, एक अपेक्षाकृत जटिल प्रोटोकॉल जिसके लिए व्यापक समस्या निवारण की आवश्यकता होती है, और कम्प्यूटेशनल मुद्दों को अनुभवहीन उपयोगकर्ता11द्वारा आसानी से नहीं संभाला जाता है। महत्वपूर्ण बात, राइबोसोम प्रोफाइलिंग मुख्य रूप से संस्कृति में अलग कोशिकाओं पर लागू होती है और पर्याप्त सामग्री की आवश्यकता होती है, जिससे वीवो लिमिटेड में से मिश्रित सेल-प्रकार के ऊतकों या क्रमबद्ध कोशिकाओं के लिए इसका आवेदन होता है।

200913में सैंज एट अल द्वारा विकसित स्तनधारी रिबोटैग विधि, बहुरूप और राइबोसोम प्रोफाइलिंग दोनों के लिए निहित कई मुद्दों को समाप्त करती है। इस विधि में, राइबोसोम से जुड़े आरएनए को विशिष्ट सेल प्रकारों से अलग किया जा सकता है जो अतिरिक्त अलगाव तकनीकों और विशेष उपकरणों के बिना जटिल ऊतकों में सेल-प्रकार विशिष्ट अनुवादों की जांच की अनुमति देते हैं, जैसा कि अन्य तरीकों13,14में आवश्यक है। रिबोटैग विधि का आधार एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (रिबोटैग) है जो 60 S राइबोसोमल सबयूनिट प्रोटीन जीन Rpl22के लिए एक संशोधित लोकस ले जाता है। इस लोकस(Rpl22-HA)में एक floxed टर्मिनल एक्सॉन शामिल है जिसके बाद टर्मिनल एक्सोन की एक अतिरिक्त प्रति संशोधित की गई है जिसमें कोडिंग क्षेत्र के भीतर सी-टर्मिनल हेमग्ग्ग्लूटिनिन (एचए) टैग शामिल है। जब एक सेल-विशिष्ट क्रे Recombinase व्यक्त माउस को पार कर, floxed एक्सोन एक सेल विशिष्ट तरीके से हा टैग RPL22 की अभिव्यक्ति की अनुमति हटा दिया जाता है(चित्रा 1)। एचए टैग का उपयोग चयनित सेल प्रकार से इम्यूनोप्रीसिपिट (आईपी) राइबोसोम और उनके संबद्ध आरएनए के लिए किया जा सकता है।

तकनीक विकसित करने वाले प्रारंभिक प्रकाशन के अलावा, कई अन्य प्रयोगशालाओं ने रिबोटैग मॉडल का उपयोग किया है। माउस सर्टली और लेडिग कोशिकाओं15,माइक्रोग्लिया16,न्यूरॉन्स17,18,ओसाइट्स19और सुसंस्कृत कोशिकाओं20 जैसे विविध ऊतकों को प्रोफाइल और अध्ययन किया गया है। हालांकि यह प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से राइबोसोम ्स को सफलतापूर्वक अलग करने में सक्षम है और एक विविध ऊतक प्रकारों में संबद्ध आरएनए अभी भी सुधार की आवश्यकता वाले क्षेत्र हैं, खासकर जब उत्परिवर्ती प्रणालियों पर लागू किया जाता है। विशेष रूप से, ताजा ऊतक पर आम निर्भरता तकनीकी भिन्नता में वृद्धि होती है जो विश्लेषण की शक्ति को बहुत कम कर सकती है। दूसरे, विभेदित अनुवादित लक्ष्यों की आत्मविश्वासी पहचान को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाया जाता है जब उच्च इम्यूनोप्रिप्रिसिप्रिफिकेशन पृष्ठभूमिगैर-क्रे पुनर्संयोजन सेल प्रकारों से होती है जैसा कि पहले13की रिपोर्ट की गई थी। जबकि Sanz एट अल तकनीक के मूल आधार इंजीनियर, इस पांडुलिपि में Snyder प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुकूलन प्रस्तुत करने के लिए इन चिंताओं को कम, विधि और अधिक व्यावहारिक और कुशल प्रतिपादन ।

इस लेख का उद्देश्य कोशिका-विशिष्ट एचए-टैग किए गए राइबोसोम ्स व्यक्त करने वाले चूहों के प्रजनन के लिए कदमों की व्याख्या करना, फ्लैश-फ्रोजन नमूनों से इन राइबोसोम्स को इम्यूनोप्रिसिबिट करने और आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उनके संबद्ध आरएनए को शुद्ध करना है। स्तनधारी पुरुष रोगाणु कोशिका और प्रजनन उत्परिवर्तन का अध्ययन अद्वितीय चुनौतियां प्रदान करते हैं, इस तकनीक को अन्य सेल प्रणालियों के अनुकूल बनाने के तरीकों को रोशन करने के प्रयास किए गए हैं।

Protocol

सभी पशु उपयोग और हैंडलिंग प्रथाओं रटगर्स विश्वविद्यालय की आंतरिक पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. माउस प्रजनन

  1. नस्ल मादा चूहों एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन उत्परिवर्तन के लिए होमोज़िगौस जो पुरुष प्रजनन क्षमता (तैयारी में पांडुलिपि, इसे ब्याज के जीन के रूप में संदर्भित करता है) की ओर जाता है, जो स्ट्रै8-iCre एलील (B6) के लिए पुरुषों हेमिज़िगौस के लिए तीनों संभोग में होता है। एफवीबी-टीजी (Stra8-iCre) 1Reb/LguJ)(Cre+),के रूप में हर पुरुष के लिए दो महिलाओं बांधना प्रजनन दक्षता बढ़ जाती है।
    नोट: उत्परिवर्ती जीन ऑफ इंटरेस्ट (एम) को मातृरूप से पारित किया गया था, क्योंकि एम के लिए महिलाओं को होमोज़िगौस में सामान्य प्रजनन क्षमता होती है। इसमें पुरुष रोगाणु कोशिका सीआर (हेमिज़िगौस) के पैतृक संचरण की अनुमति देने का अतिरिक्त लाभ है, जैसा किअनुशंसित 21 और वांछित एलीलिक संयोजन के साथ संतानों के प्रतिशत को अनुकूलित करता है। क्योंकि होमोज़िगौस क्रेस रोगाणु कोशिका विषाक्तता22प्रदर्शित करते हैं, यह अनुशंसित है कि एलील को बनाए रखा जाए और हेटेरोज़िगौस या हेमिज़िगौस राज्य में पारित किया जाए। महत्वपूर्ण बात, सीआरई अभिव्यक्ति को प्रायोगिक आबादी तक Rpl22-HA एलील के साथ सह-घटित नहीं होना चाहिए। प्रजनन जानवरों में सीआरई से Rpl22-HA एलील को अलग करने में विफलता के परिणामस्वरूप वंश होगा जो विश्व स्तर पर रोगाणु कोशिका सीआरई गतिविधि के कारण Rpl22-HA को व्यक्त करता है। यह समस्या रोगाणु कोशिका के लिए विशिष्ट है। इसके अतिरिक्त, Stra8-iCre 22ब्याज के लेखकों की सेल आबादी के लिए विशिष्ट है, में संक्रमण कोशिकाओं को लक्षित करने और बहुत जल्दी meiosis में, preleptotenes और लेप्टोटेन्स सहित । एक अलग क्रे ड्राइवर ब्याज के एक और सेल प्रकार के लिए विशिष्ट बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । आम अभ्यास तय पुरुष रोगाणु कोशिका व्यक्त Cres पैतृक पक्ष पर प्रेषित किया जाएगा । हालांकि, यह संभव है Stra8के मातृ संचरण-मैंCre पुरुष संतानों में इसी तरह ट्रांसजीन अभिव्यक्ति में परिणाम होगा । चयनित प्रजनन योजना के बावजूद, समकक्ष क्रे अभिव्यक्ति के साथ संतान उत्पन्न करने के लिए, सभी प्रयोगात्मक नमूनों को एक ही माता-पिता की ओर से क्रे ट्रांसमिशन के माध्यम से उत्पन्न किया जाना चाहिए (या तो हमेशा मातृ या हमेशा पैतृक)।
  2. जीनोटाइप जिसके परिणामस्वरूप पुरुष पिल्ले धारा 2.4 में वर्णित हैं। डाउनस्ट्रीम प्रजनन के लिए एम एलील और पॉजिटिव फॉर क्रे (+/एम:क्रे+)ले जाने वालों का चयन करें ।
  3. नस्ल मादा चूहों Rpl22-HA (B6J.129 (cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ)के लिए पुरुषों के लिए तीनों संभोग में एम एलील के लिए होमोज़िगौस नस्ल ।
    नोट: Rpl22-HA पृष्ठभूमि अत्यधिक मिश्रित है, इसलिए तनाव-विशिष्ट फेनोटाइप का आकलन करते समय देखभाल का प्रयोग किया जाना चाहिए।
  4. जीनोटाइप जिसके परिणामस्वरूप महिला पिल्ले एम एलील ले जाने वालों की पहचान करने के लिए और Rpl22-HA के लिए सकारात्मक(+/M:Rpl22-HA +)(धारा २.३ देखें) । डाउनस्ट्रीम प्रजनन के लिए इन महिलाओं का चयन करें।
  5. क्रॉस +/M:Cre + पुरुषों के साथ +/M:Rpl22 + महिलाओं के साथ तीनों संभोग में । जीनोटाइप परिणामी पिल्ले (सेक्शन 2.3 और 2.4 देखें) पुरुषों की पहचान करने के लिए जो क्रे + और आरपीएल22 + और या तो वाइल्डटाइप या एम/एम दोनों हैं।
    नोट: चूंकि यह कार्य एक उत्परिवर्तन पर केंद्रित है जिसके परिणामस्वरूप पूर्ण पुरुष प्रजनन, प्रजनन योजना में वांछित प्रायोगिक जीनोटाइप प्राप्त करने के लिए विशेष विचार किए गए हैं। इस तरह के विचार अन्य प्रयोगात्मक मॉडलों में अनावश्यक हो सकते हैं। प्रजनन विचारों की अतिरिक्त चर्चा के लिए एक पूर्ण प्रजनन योजनाबद्ध और साथ किंवदंती के लिए चित्रा 2 देखें।

2. नमूना संग्रह

  1. 21 दिनों के बाद पार्टम (डीपीपी) पर पुरुष चूहों से टेस्ट ले लीजिए।
    1. सीओ2 साँस लेना द्वारा चूहों का बलिदान गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद। दो छोटे (2 सेमी प्रत्येक), जुड़े पार्श्व चीरों से घिरे प्रत्येक जानवर पर एक वेंट्रल चीरा (3 सेमी) बनाएं। वृषण प्रकट करने के लिए त्वचा और पेरिटोनम को वापस खींचें।
    2. संदंश का उपयोग करके, एपिडिडिमिस और टेस्टिस को प्रकट करने के लिए शरीर गुहा के एक तरफ से एपिडिमल फैट पैड खींचें। टेनोटॉमी कैंची के साथ, टेस्टिस को उत्पादित करें, एपिडिडिमिस, आसपास के वसा और किसी भी बाहरी वास्कुल्चर को ट्रिम करने का ख्याल रखें। एक साफ 1.7 mL ट्यूब में बरकरार टेस्ट रखें।
    3. दूसरी तरफ से दोहराएं, पहली ट्यूब में दूसरा टेस्ट जोड़ें। इस ट्यूब को कैप करें और तुरंत इसे फ्लैश-फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन में जलमग्न कर दें।
      नोट: नमूने उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है।
  2. जीनोटीपिंग पुष्टि के लिए प्रत्येक जानवर (2 मिमी) के लिए अतिरिक्त पूंछ टिप नमूने एकत्र करें।
    1. डीएनए निकालने के लिए 17 एमएम की नफा टटोलना में 50 एमएम की 100 माइक्रोन डालकर 30 एमएम ट्यूब में 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें। 50 एम एम एचसीएल के 100 माइक्रोन और 1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 के 20 माइक्रोन और 1 000 एक्स जीमें 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज सैंपल जोड़ें। निम्नलिखित जीनोटिंग प्रतिक्रियाओं के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनेटेंट (जीनोमिक डीएनए युक्त) बनाए रखें और स्टोर निकाला गया डीएनए।
  3. निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करके सैंज एट अल.13 से अनुकूलित विधि के बाद Rpl22-HA genotyping करें: फॉरवर्ड: 5'GGGAGGCTTGCTGGATATG 3'; रिवर्स: 5 ' टीटीटीसीकैगसीएकैगजीसीटीएएजीटीएसीएसी 3'।
    1. चरण 2.2.1, 25 एमएम डीएनटीपी के 0.08 माइक्रोन, 10 मीटर फॉरवर्ड प्राइमर के 0.1 माइक्रोन में निकाले गए डीएनए के 2 माइक्रोन से युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें, 10 मीटर रिवर्स प्राइमर के 0.1 माइक्रोन, पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) बफर (650 एमएम ट्रिस पीएच = 8.8, 165 एमएम (एनएच4)2एसओ4,30 एमएम एमजीसीएल2,और 0.1% ट्वीन), ताक़ पॉलीमरेज के 0.2 माइक्रोन, और न्यूलीज-फ्री एच2ओ ओ कुल मात्रा में 20 00
    2. निम्नलिखित थर्मोसाइकिलर स्थितियों का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस प्राइमर पिघलने का कदम, 64 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस एनील और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस विस्तार, 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 5 मिन विस्तार के साथ 37 बार दोहराया गया।
      नोट: यह वाइल्डटाइप नमूनों के लिए २६० बीपी का एक उत्पाद आकार और नमूनों के लिए २९२ बीपी है कि Rpl22-HA + थे मिले
  4. निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करके क्रे गेनोटीपिंग करें: फॉरवर्ड: 5'GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; रिवर्स: 5 'AGGGACACAGCATTGTC 3'। इसके बजाय क्रे प्राइमर का उपयोग करते हुए चरण 2.3.2 में वर्णित पीसीआर प्रतिक्रिया तैयारकरें। निम्नलिखित थर्मोसाइकिलर स्थितियों का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस प्राइमर पिघलने का कदम, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस एनील और 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस विस्तार, 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 5 मिन विस्तार के साथ 35 बार दोहराया गया।
  5. प्रश्न में जीन के लिए मानक के रूप में ब्याज genotyping के जीन बाहर ले जाएं ।
    नोट: लेखक का जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल एक केंद्रित कस्टम Taqका उपयोग करता है, और इस तरह, अन्य उपयोगकर्ताओं को अपनी एंजाइमैटिक आवश्यकताओं के अनुरूप स्थितियों को संशोधित करना पड़ सकता है। अनुवाद पर ब्याज के नुकसान के इस जीन के प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए, पुरुष जो या तो वाइल्डटाइप थे या ब्याज के उत्परिवर्ती एलील के लिए होमोज़ियास थे और जो क्रे + और आरपीएल22 + को प्रायोगिक नमूने के रूप में चुना गया था। जीनोटाइप चयन पर धारा 1 में ऊपर चर्चा की जाती है ।

3. समाधान की तैयारी

नोट: समाधान की तैयारी और बाद के सभी कदमों को कड़े शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।

  1. समरूपता बफर (एचबी) तैयार करने के लिए, 1 एम ट्रिस पीएच 7.4 का 2.5 मिलील, 1 एम केसीएल का 5 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2का 600 माइक्रोन और एनपी-40 का 500 माइक्रोन 50 मीटर ट्यूब में जोड़ें। आहार पायरोकार्बोनेट (डीईपीसी) एच2ओ में मात्रा (50 मिली) पर लाएं और सभी घटकों को शामिल किए जाने तक मिलाएं।
    नोट: अंतिम सांद्रता इस प्रकार होगी: 50 एमएम ट्रिस पीएच 7.4, 100 एमएम केसीएल, 12 एमएम एमजीसीएल2और 1% एनपी-40।
  2. उच्च नमक धोने बफर (एचएसडब्ल्यूबी) तैयार करने के लिए, 1 एम ट्रिस पीएच 7.4, 1 एम केसीएल के 15 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2के 600 माइक्रोन और 500 माइक्रोन एनपी-40 के 500 माइक्रोन को 50 मीटर ट्यूब में जोड़ें। डीईपीसी एच2ओ में वॉल्यूम (50 मिलील) पर लाएं और सभी घटकों को शामिल न होने तक मिलाएं।
    नोट: अंतिम सांद्रता इस प्रकार होगी: 50 एम ट्रिस पीएच 7.4, 300 एमएम केसीएल, 12 एमएम एमजीसीएल2और 1% एनपी-40यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है, और समाधान उपयोग तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. ऊतक की तैयारी

  1. सभी नमूना ट्यूबों, रिकॉर्डिंग वजन, और तरल नाइट्रोजन में प्रीकूल से पल्ला झाड़ना।
  2. सूखी बर्फ पर प्रीकूल बाँझ मोर्टार, मूसल और वजनी स्पैटुला।
  3. एक प्रीकूल्ड, बाँझ मोर्टार और सूखी बर्फ पर मूसल का उपयोग कर एक ठीक पाउडर के लिए फ्लैश जमे हुए ऊतक के नमूनों को पीसें ।
    1. सूखी बर्फ पर प्रीकूल्ड मोर्टार में फ्लैश फ्रोजन टिश्यू रखें। धीरे-धीरे मूसल का उपयोग करके ऊतकों को बड़े टुकड़ों में तोड़ें और धीरे-धीरे पीसलें जब तक ऊतक एक अच्छा पाउडर न हो।
      नोट: हालांकि ताजा ऊतक का भी उपयोग किया जा सकता है, मूल प्रोटोकॉल13के अनुसार, फ्लैश-फ्रोजन ऊतकों के उपयोग के साथ परिणाम में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है। विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा देखें।
    2. प्रीकूल्ड स्पैटुला का उपयोग करके मोर्टार से पाउडर स्क्रैप करके प्रीकूल्ड संग्रह ट्यूब पर ग्राउंड सैंपल को सावधानी से स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि केवल ऊतक एकत्र किया जाता है और ठंडे मोर्टार पर जमा किसी भी नमी नहीं है।
    3. ऊतक के साथ ट्यूब वजन, ध्यान रखने के लिए सूखी बर्फ पर रखने के लिए जब भी संभव हो । इसमें नमूने के साथ ट्यूब के वजन से ट्यूब के प्रारंभिक वजन को घटाकर ऊतक के द्रव्यमान की गणना करें। lysis बफर संस्करणों की बाद में गणना के लिए इस मूल्य रिकॉर्ड।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, और नमूने उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

5. नमूने का समरूपीकरण

  1. 1 एम डिथियोथ्रेटोल (डीटीटी), 1 प्रोटीज अवरोधक टैबलेट, 50 माइक्रोन ऑफ आरएनसे अवरोधक (40,000 यूनिट/एमएल), 200 माइक्रोन ऑफ 5 एमजी/एमएल साइक्लोहेक्सिमिड, और 100 एमजी/एमएल हेपर को 100 मिलीग्राम/एमएल के 100 माइक्रोन जोड़कर तैयार करें। मिश्रण जब तक सभी घटकों को शामिल कर रहे है और उपयोग तक बर्फ पर रहते हैं ।
    नोट: 10 mL एचबी में पूरक की अंतिम सांद्रता इस प्रकार होगी: 1 एमएम डीटीटी, २०० यू/एमएल RNase अवरोधक, १०० μg/mL cycloheximide, और 1 मिलीग्राम/mL heparin । इस समाधान की खुराक के अलावा के 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखा जा सकता है।
  2. हर 100 मिलीग्राम के नमूने के लिए, लाइसिस बफर का 1 मिलीग्राम जोड़ें। एक ही पिपेट के साथ lysis बफर जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया, ध्यान से जिसके परिणामस्वरूप lysate और टुकड़ा कोशिकाओं और मिश्रण करने के लिए नीचे पिपेट । जब तक नमूना चिपचिपा नहीं होता, तब तक पाइपिंग जारी रखें।
    नोट: क्योंकि समाधान पहली बार में बहुत चिपचिपा है, समाधान मिश्रण करने के लिए एक बड़े व्यास पिपेट का उपयोग किया जाना चाहिए। एक मानक 1000 माइक्रोन सामान्य रूप से 100 मिलीग्राम ऊतक के लिए पर्याप्त है।
  3. लायसे के लिए 10 मिन के लिए बर्फ पर नमूने सेट करें। फिर, 10,000 x ग्रामपर 10 मीटर के लिए प्रीकूल्ड अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में नमूने स्पिन करें। एक बड़ा, ढीला, बादल गोली ट्यूब के नीचे में रूपहोना चाहिए।
  4. सावधान होने के नाते गोली परेशान करने के लिए नहीं, एक नई ट्यूब में lysate इकट्ठा और प्रत्येक नमूने के लिए रिकॉर्ड मात्रा । नमूना degredataion को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि नमूने शेष प्रोटोकॉल भर में शांत रहते हैं, बर्फ पर भंडारण या 4 डिग्री सेल्सियस पर जब भी संभव हो ।

6. मोतियों की तुल्यता

  1. चरण 5.2 से लाइसेट की मात्रा का उपयोग करके, उपयुक्त एंटीबॉडी बाध्यकारी प्रोटीन (इस मामले में, प्रोटीन जी) के साथ चुंबकीय मोतियों की आवश्यक मात्रा की गणना करें। लाइसेट के 1 मिलील के लिए 375 माइक्रोन प्रोटीन जी मोतियों (30 मिलीग्राम/एमजी) का इस्तेमाल करें।
    नोट: संयुग्मित मोतियों का चुनाव एंटी-हा एंटीबॉडी के साथ अलग-अलग होगा; उदाहरण के लिए, यदि खरगोश जनित एंटी-हा एंटीबॉडी का चयन किया जाता है, तो प्रोटीन एक मोती बेहतर होगा।
  2. चुंबकीय ट्यूब रैक का उपयोग करके, मनका सॉल्वेंट को हटा दें और मोतियों में ताजा लिसिस बफर की बराबर मात्रा जोड़ें। धोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन घुमाएं। 20 आरपीएम के लिए सेट बेंचटॉप ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके सभी रोटेशन चरणों का प्रदर्शन करें।
  3. ट्यूब को मैग्नेटिक ट्यूब रैक पर रखें और वॉश बफर को हटा दें।
  4. दो बार और दोहराएं कदम 6.1−6.3।
  5. समान मोती के लिए मूल मात्रा में lysis बफर जोड़ें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर स्टोर करें।

7. प्रीक्लीयरिंग नमूना

  1. लाइसेट के हर 1 मिलीएल के लिए समतुल्य मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
  2. चुंबक रैक पर ट्यूब रखें और एक ताजा ट्यूब में lysate इकट्ठा। इस्तेमाल किए गए मोतियों को त्यागें।
  3. लाइसेट के लिए हर 1 mL के लिए समतुल्य मोतियों के 25 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाए ँ।
  4. चुंबक रैक पर ट्यूब रखें और एक ताजा ट्यूब में lysate इकट्ठा। इस्तेमाल किए गए मोतियों को त्यागें। क्लीयर लाइसेट से, नमूना इनपुट नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए 50 माइक्रोन बनाए रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इनपुट नमूना नमूने की कुल आरएनए आबादी का प्रतिनिधित्व करने वाले नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जिसमें ऊतक में अन्य सेल प्रकारों से जुड़े आरएनए शामिल हैं, जो उत्परिवर्तन के कार्य के रूप में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों के लिए सही करने के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के दौरान उपयोग किए जाते हैं।

8. एंटीबॉडी का ऊष्मायन

  1. क्लीयर लाइसेट के हर 1 mL के लिए, एंटी-हा एंटीबॉडी के 5 μg जोड़ें। सैंपल लॉस को रोकने के लिए लेबोरेटरी फिल्म के साथ ट्यूब कैप को सील करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16−18 घंटे के नमूने घुमाएं।
    नोट: एंटीबॉडी ऊष्मायन समय और एकाग्रता अनुकूलित नहीं किया गया है। लेखकों को पर्याप्त होने के लिए 5 μg के साथ एक रात ऊष्मायन पाया; हालांकि, यह संभव है कि एक छोटा ऊष्मायन या कम एंटीबॉडी पर्याप्त होगा, या कि एक लंबे ऊष्मायन या अधिक एंटीबॉडी बाध्यकारी में सुधार होगा।

9. मोतियों का इनक्यूबेशन

  1. क्लीयर लाइसेट के हर 1 मिलीएल के लिए, प्रोटीन जी मोतियों के 300 माइक्रोन जोड़ें। प्रयोगशाला फिल्म के साथ ट्यूब कैप को फिर से सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए घुमाएं।

10. मोतियों की धुलाई

  1. नमूना ट्यूब चुंबक रैक पर रखें ताकि मोतियों को आईपीईडी लाइसेट से अलग होने की अनुमति दी जा सके। मोतियों को बनाए रखते हुए, प्रवाह के माध्यम से लिसेट और त्यागने से पिपेट करें।
  2. मोतियों के लिए एचएसडब्ल्यूबी के 800 माइक्रोन लगाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सीन के लिए घुमाने की अनुमति दें। चुंबक रैक पर नमूना ट्यूब रखें और मोतियों को धोने से अलग होने दें। धोने को निकालें और त्यागें।
  3. मोतियों के लिए एचएसडब्ल्यूबी का एक और 800 माइक्रोन लगाएं। नमूना बंद करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए घुमाने की अनुमति दें। चुंबक रैक पर नमूना ट्यूब रखें और मोतियों को धोने से अलग होने दें। धोने को निकालें और त्यागें।
  4. एक बार फिर चरण 10.3 दोहराएं।

11. आरएनए निष्कर्षण

  1. चुंबक रैक पर नमूना ट्यूब रखें और मोतियों को धोने से अलग होने दें। बंद पिपेट और त्यागने धोने, आरएनए निष्कर्षण के लिए मोती बनाए रखने । मोतियों में 14.2 एम बीटा-मर्काप्टोथेनॉल (बीएमई) के 3.5 माइक्रोन जोड़ें और 15 एस के लिए भंवर द्वारा मिलाएं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक वाणिज्यिक आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करआरएन निकालें। RNase मुक्त एच2O के 30 μL में Elute नमूना।
    नोट: हालांकि 10 μL/नमूना DNase उपचार सबसे किट के लिए वैकल्पिक है, यह दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है । यह वैकल्पिक सफाई कदम पृष्ठभूमि को काफी कम कर देता है, जिससे अधिक सटीक अंतिम एकाग्रता की अनुमति मिलती है। यह दृढ़ता से एक किट है कि lysis बफर में बीटा-mercaptoethanol (बीएमई) शामिल का उपयोग करने के लिए recommened है । बीएमई आरएनए अलगाव के दौरान नमूना क्षरण को रोकने के लिए एक अतिरिक्त RNase अवरोधक के रूप में कार्य करता है।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें या तुरंत विश्लेषण करें।

12. क्वांटिफिकेशन और नमूना विश्लेषण

  1. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करना, आरएनए एकाग्रता और प्रारंभिक गुणवत्ता की मात्रा निर्धारित करना।
  2. एक बायोएनालाइजर के माध्यम से नमूनों से निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण करें।
    नोट: परिणामस्वरूप आरएनए तो आरएनए अनुक्रमण या अन्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषण जैसे नॉर्थिंग ब्लॉटिंग या मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Representative Results

पिछली रिपोर्टों में सीआरई14की कमी वाली कोशिकाओं से गैर-विशिष्ट इम्यूनोप्रिसिप्रिशन का सुझाव दिया गया है । आदेश में निर्धारित करने के लिए अगर यह हमारे संशोधित प्रोटोकॉल में मामला था, आईपी दक्षता दोनों Cre और Rpl22-HA और जानवरों को ले जाने के जानवरों से प्राप्त नमूनों में निर्धारित किया गया था केवल एक लेकिन इस उंमीद के साथ अंय नहीं है कि दोनों एक क्रेचालक और Rpl22-HAके बिना, इम्यूनोप्रिसिपेटेड आरएनए ंयूनतम होना चाहिए । जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, बहुत कम आरएनए या तो क्रे या Rpl22-HA आईपी पृष्ठभूमि को कम करने और वास्तविक एचए-टैग राइबोसोम RNAs को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करने की कमी वाले नमूनों से अलग है। इसके अलावा, केवल क्रे-और Rpl22-HAदोनों-केवल नमूने उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण ों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

आईपी की दक्षता को काफी प्रभावित करने के लिए अभिकर्मक स्रोत की क्षमता को देखते हुए, एंटीबॉडी और आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का परीक्षण किया गया(चित्रा 4) सीआरई और Rpl22-HA सकारात्मक नमूनों में। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि अभिकर्मक चयन का आईपी दक्षता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है इस प्रकार अभिकर्मक चयन में किसी भी परिवर्तन को देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।

आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन उत्परिवर्ती, वाइल्डटाइप-क्रे+Rpl22-HA+ (वाइल्डटाइप) और ब्याज के जीन के संदर्भ में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए-/-क्रे+ Rpl22-HA + (ब्याज केजीन-/) टेस्टिस रिबोटैग प्रणाली की प्रभावशीलता के लिए जांच की गई ताकि राइबोटैग सिस्टम की प्रभावशीलता के लिए राइबोकम संबद्ध आरएनए(चित्रा 5)को अलग किया जा सके । जब वाइल्डटाइप इनपुट और आईपी की आरएनए एकाग्रता की तुलना ब्याजके जीन-/-इनपुट और आईपी से की गई थी, तो जीनोटाइप के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । दोनों जीनोटाइप के लिए, हालांकि, इनपुट एकाग्रता आईपी एकाग्रता की तुलना में काफी अधिक थी, यह दर्शाता है कि इनपुट नमूने(चित्रा 5बी)में अधिक आरएनए था। इस परिणाम की उम्मीद है, क्योंकि सेल में मौजूद सभी mRNAs किसी भी समय राइबोसोम से जुड़े नहीं हैं, खासकर रोगाणु कोशिकाओं के मामले में जहां आरएनए का अनुवाद करने से बहुत पहले लिखित किया जा सकता है।

अनुक्रमण के लिए भेजे गए आरएनए नमूनों की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, नमूने बायोएनालाइजर पर चलाए गए थे। आरएनए अखंडता संख्या (RINs), आम तौर पर 28S और 18S rRNA चोटियों के अनुपात के रूप में गणना की, नमूनों में तुलना की गई । कुल आरएनए पूल में, आरआईनए मान उच्च अनुमानित नमूना अखंडता और गुणवत्ता से सहसंबद्ध उच्च आरआईआर के साथ 10 के पास होने की उम्मीद है। जबकि आईपी नमूनों इनपुट की तुलना में कम RIN था, RINs अभी भी एक स्वीकार्य सीमा के भीतर थे और नमूना जीनोटाइप(चित्रा 5सी)पर निर्भर नहीं थे । आईपीईडी नमूनों के लिए कम आरआईएन मूल्यों की संभावना आरएनए गिरावट का परिणाम है, हालांकि विश्लेषण RNAs की औसत न्यूक्लियोटाइड लंबाई में अपेक्षाकृत कम कमी को देखते हुए बहुत मामूली है। प्रोटोकॉल की लंबाई और इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए आवश्यक तापमान को देखते हुए कुछ गिरावट की उम्मीद है। यह भी संभव है कम RIN और आरएनए लंबाई गैर rRNA प्रजातियों के लिए संवर्धन का एक समारोह है, जैसे mRNAs ।

Figure 1
चित्रा 1: रिबोटैग विधि। विधि का आधार जैविक रूप से सरल है। मूल एक्सॉन 4 के Rpl22 लोकस डाउनस्ट्रीम के लिए अनुक्रम में एक नया एक्सन 4 डाला गया है। एक क्रे ड्राइवर की उपस्थिति में, मूल एक्सॉन 4 के दोनों ओर loxP साइटों में कटौती कर रहे हैं, floxed एक्सॉन excising । एचए-टैग एक्सोन 4 को अब Rpl22 mRNA में शामिल किया गया है, जो सीआरई व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में एक एचए टैग आरपीएल22 पैदा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: रिबोटैग चूहों के लिए नमूना प्रजनन योजना। प्रायोगिक पशुओं को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रजनन योजना को दर्शाया गया है। एक दो सूत्री योजना का उपयोग किया गया। 1 पीढ़ी में, ब्रीडर तिकड़ी के दो समानांतर सेट स्थापित किए गए थे । एक तरफ ब्याज के allele संयुक्त (पुरुष प्रजनन में इस विशिष्ट उत्परिवर्तन परिणाम के रूप में मातृ किया) hemizygous सीआर के साथ और दूसरे पर ब्याज की एलील के संयोजन, फिर से मातृ किया, Rpl22-HA के साथ । फिर, 2 पीढ़ी में, पहली बांधना है कि ब्याज की एलीले ले और सीआरई दूसरी बांधना है कि ब्याज और Rpl22-HA के allele ले की महिला संतानों को पार कर रहे है से पुरुषों । परिणामस्वरूप संतानों के जीनोटाइप निर्धारित किए जाते हैं, और प्रयोगात्मक रूप से प्रासंगिक जानवरों का चयन किया जाता है (इस मामले में या तो वाइल्डटाइप या होमोज़िगौस उत्परिवर्ती दोनों क्रे और Rpl22-HA एलील्स ले जाते हैं)। यह सीआर-ड्राइवरोंव्यक्त रोगाणु सेल के लिए ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है, सीआरई और Rpl22-HA alleles प्रायोगिक पीढ़ी तक एक साथ नस्ल नहीं होना चाहिए । प्रजनन पीढ़ियों में रोगाणु सेल-व्यक्त क्रे के लिए Rpl22-HA एलील का एक्सपोजर रोगाणु-कोशिका Rpl22-HA एक्सीशन को चलाएंगे। किसी भी परिणामी संतान विश्व स्तर पर Rpl22-HA व्यक्त करेगा इस प्रकार सेल विशिष्ट राइबोसोम अलगाव को रोकने । यहां वर्णित प्रणाली में, एक एन = 4 प्रति जीनोटाइप ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति प्रदान की। जैविक दोहराने संख्या प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नकारात्मक नियंत्रण की पुष्टि। क्रे + और Rpl22-HA + हैं कि नमूने कि क्रे + या Rpl22-HA + अकेले कर रहे है की तुलना में उच्च आरएनए पुलडाउन दिखाते हैं । क्रे + और Rpl22-HA + नमूना आरएनए पुलडाउन प्रभावकारिता के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, यह दर्शाता है कि या तो क्रे या Rpl22-HA की कमी वाले नमूनों उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण हैं । एक "+" इंगित करता है कि इसी एलील या ट्रांसजीन इन नमूनों में मौजूद था और एक "-" इसकी अनुपस्थिति को दर्शाता है। आईपी/इनपुट कुल (इनपुट) आरएनए पर आरएनए इम्यूनोप्रीसिपिटिट (आईपी) के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है । नैनोग्राम में एकाग्रता से गणना की गई मूल्य। ** पी एंड एलटी; 0025 को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अभिकर्मक प्रोटोकॉल सफलता को प्रभावित करते हैं। (A)फ्लैश फ्रोजन टिश्यू के परिणामस्वरूप ताजा ऊतक के समान इम्यूनोप्रिसिप्रिमिटन दक्षता होती है। (ख)दो वाणिज्यिक एंटीबॉडी के लिए आईपी दक्षता निर्धारित की गई थी, जिसे एंटीबॉडी 1 और एंटीबॉडी 2(टेबल ऑफ मैटेरियल)के रूप में नामित किया गया था । जब परीक्षण किया जाता है, तो एंटीबॉडी 1 एंटीबॉडी 2 की तुलना में आरएनए को नीचे खींचने में अधिक कुशल था जो नकारात्मक (या तो क्रे या Rpl22-HA +) और सकारात्मक नियंत्रण (क्रे और Rpl22-HA +दोनों को व्यक्त करने) के बीच अंतर करने में असमर्थ दिखाई दिया। डॉट्स व्यक्तिगत जैविक प्रतिकृति के लिए आईपेड बनाम इनपुट आरएनए के अनुपात का संकेत देते हैं। (ग)जब आरएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका) कीतुलना की गई, किट 2 काफी किट 1 से बेहतर प्रदर्शन किया । हालांकि दोनों किट नकारात्मक नियंत्रण से आरएनए की एक समान राशि IPed, किट 2 सकारात्मक नमूनों से एक काफी अधिक आरएनए उपज के परिणामस्वरूप । * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.025, *** पी एंड एलटी; 0.01 को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक उत्परिवर्ती मॉडल के लिए विधि का आवेदन। (A) ब्याज प्रोटीन के जीन के खिलाफ कस्टम इन-हाउस एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा के माध्यम से ब्याज जीनोटाइप पुष्टि का नमूना जीन ब्याज के जीन को दर्शाता है-/(एम/एम) पुरुष संबद्ध प्रोटीन का उत्पादन करने में विफल रहते हैं । एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में दिखाया गया GAPDH। (ख)वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती नमूनों के लिए जोड़े गए इनपुट और आईपेड नमूनों से ग्राफिकल बायोएनालाइजर आउटपुट। (C)नमूना प्रकार और जीनोटाइप द्वारा तुलना आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) । (D)नमूना प्रकार और जीनोटाइप द्वारा बायोएनालाइजर द्वारा विश्लेषण की गई आरएनए प्रजातियों की औसत न्यूक्लियोटाइड लंबाई। * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.025, *** पी एंड एलटी; 0.01, एन.एस. एन = 4 प्रति जीनोटाइप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: क्रे ड्राइवर पुष्टि का उदाहरण। रोगाणु कोशिका विकास (Stra8)में जल्दी अनुवादित जीन का परिमाणीकरण और दो जीन रोगाणु सेल विकास में देर से अनुवाद(Tnp1 और Prm1)RRT द्वारा विश्लेषण-आरएनए इम्यूनोप्रिसिपिटिट के RPL22-HA से संचालित दो अलग अलग रोगाणु कोशिका Cres, Stra8-iCre (रोगाणु सेल विकास में जल्दी व्यक्त) और Hspa2-Cre (रोगाणु सेल के विकास में बाद में व्यक्त) यहां, Stra8 के एचए-आईपी प्रारंभिक रोगाणु सेल क्रे ड्राइवर के साथ हासिल किया जाता है, लेकिन बाद में रोगाणु कोशिका सीआरई चालक के साथ इम्यूनोप्रिसिपिटेशन की सेल-विशिष्टता का प्रदर्शन नहीं करता है। इसके विपरीत, देर से रोगाणु कोशिकाओं में अनुवादित ट्रांसक्रिप्ट का एचए-आईपी स्ट्रै8-iCre और Hspa2-Creदोनों द्वारा प्राप्त किया जाता है। यह उन कोशिकाओं के रूप में उम्मीद की जाती है जो स्ट्रै8-आईक्रे को उनके विकास की संपूर्णता में एचए-टैग आरपीएल22 उत्पन्न करेंगी जबकि Hspa2-Cre व्यक्त करने वाले केवल अपने विकास के बाद के भागों के दौरान ऐसा करेंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

सामान्य या उत्परिवर्ती अवस्था में कोशिका के शरीर विज्ञान को अधिक सटीक रूप से समझने के लिए किसी विशेष कोशिका प्रकार के अनुवाद को समझना अमूल्य है। विशेष लाभ सिस्टम में देखा जाता है जिसमें अनुवाद प्रतिलेखन से अयुग्मित होता है, जैसे तंत्रिका ऊतक में जहां अनुवाद प्रतिलेखन से बहुत दूर होता है, या रोगाणु कोशिकाओं में जहां अनुवाद से बहुत पहले होता है। अनुवाद विश्लेषण के अन्य तरीकों के सापेक्ष, रिबोटैग सिस्टम का सबसे बड़ा लाभ क्रे रिकॉम्बिनेज़ सिस्टम के उपयोग से आता है। यह स्वतंत्रता किसी भी सेल आबादी है कि एक प्रासंगिक सीआरई चालक है लक्षित करने की अनुमति देता है । दूसरे, रिबोटैग आईपी जैसा कि यहां वर्णित है, प्रभावी है और पॉलीसम या राइबोसोम प्रोफाइलिंग की तुलना में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला बहुत कम है। अंत में, रिबटैग आईपी आसानी से बेंचटॉप पर प्रदर्शन किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । उनमें से प्रमुख रिबोटैग माउस लाइन की स्थापना और अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक जानवरों की पीढ़ी है । सभी आनुवंशिक मॉडलों के लिए, माउस कॉलोनी के भीतर व्यक्तियों की सावधानीपूर्वक ट्रैकिंग के साथ-साथ सावधान जेनोटपिंग प्रोटोकॉल लागू किया जाना चाहिए। सैंज एट अल के अनुसार पीसीआर गेनोटाइपिंग में वाइल्डटाइप एक्सॉन 4 के लोक्सपी साइट 5 ' को लक्षित करने वाले प्राइमर शामिल होने चाहिए ताकि वाइल्डटाइप एलील्स (260 बीपी) और उत्परिवर्ती (290 बीपी)13के बीच अंतर किया जा सके। रोगाणु सेल मॉडल में रिबोटैग विश्लेषण के मामले के लिए, बहुत विशिष्ट प्रजनन आवश्यकताओं का पालन किया जाना चाहिए। सबसे पहले, म्यूटेंट के मामले में, जिसके परिणामस्वरूप प्रजनन, विचारशील प्रजनन रणनीतियों में मध्यवर्ती और प्रयोगात्मक पीढ़ियों में वांछित जीनोटाइप के साथ संतानों की संख्या को अनुकूलित करने के तरीके शामिल होने चाहिए। दूसरा, रोगाणु कोशिका विशिष्ट क्रेसके मामले में, क्रे विषाक्तता के लिए रोगाणु कोशिकाओं की संवेदनशीलता को देखते हुए क्रे-zygosity के बारे में देखभाल की जानी चाहिए । रोगाणु कोशिका में, सीआरई प्रोटीन के उच्च स्तर पर प्रजनन योजना में क्रे/क्रे जानवरों के उपयोग पर रोक लगाते हुए22हानिकारक प्रभाव हो सकते हैं । अंत में, रोगाणु कोशिका क्रेएस का उपयोग करते समय, एक मध्यवर्ती पीढ़ी के रोगाणु कोशिका में क्रे अभिव्यक्ति के रूप में अंतिम पीढ़ी तक क्रे से रिबोटैग एलील को अलग करना महत्वपूर्ण है, जिसके परिणामस्वरूप विश्व स्तर पर Rpl22-HA व्यक्त करने वाली संतान होगी।

सेल सिस्टम की परवाह किए बिना, कई अनुशंसित नियंत्रण क्रे अभिव्यक्ति और विशिष्टता दोनों की मजबूती को सत्यापित करने के लिए संभव हैं। अपने सीआरई की उचित अभिव्यक्ति और Rpl22-HA की अपेक्षित एक्सीक्शन कई तरीकों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। पहले, प्रयोगात्मक जानवरों से अलग ऊतक को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोलुनोरेंस15का उपयोग करके एचए के लिए दाग दिया जा सकता है। यह विधि इष्टतम है कि इसके लिए लक्ष्य सेल प्रकारों में अनुवादित mRNA के प्राथमिकताज्ञान की आवश्यकता नहीं है। दूसरी विधि, जिसका एक उदाहरण चित्र 6में प्रदर्शित किया जाता है, लक्ष्य सेल प्रकार में अनुवाद ित संदेशों के कुछ ज्ञान की आवश्यकता है । इस विधि में, एक ज्ञात अनुवाद विनियमित एमआरएनए के लिए संवर्धन की पुष्टि चयनित क्रे-ड्राइवरसे आईपीईडी बनाम इनपुट आरएनए की मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके की जा सकती है। इसी तरह, मजबूत Rpl22-HA अभिव्यक्ति की पुष्टि क्रे +/Rpl22 + नमूनों (सकारात्मक नियंत्रण) की तुलना में या तो क्रे-/Rpl22 + या Cre+/Rpl22-नमूनों के साथ की जा सकती है जो प्रभावी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं (चित्रा 3देखें) । ये तुलना या तो कुल आईपेड आरएनए या संवर्धन पर क्यूआरटी-पीसीआर या कुछ अन्य मात्रात्मक विधि द्वारा मूल्यांकन किए गए ज्ञात अनुवाद रूप से विनियमित एमआरएनए के लिए की जा सकती है।

प्रोटोकॉल के निष्पादन में आम समस्याएं केवल स्पष्ट हो जाती हैं जब आरएनए उपज अप्रत्याशित रूप से कम या उच्च होती है। इन विफलताओं के लिए सबसे आम कारण व्यक्तियों के गलत genotyping से उत्पन्न होता है। हम अप्रत्याशित आरएनए पैदावार के मामले में सभी नमूनों के जीनोटाइप की पुष्टि करने के लिए एकत्र किए गए नमूने से अतिरिक्त ऊतक को बनाए रखने की सलाह देते हैं। एक बार पुष्टि होने के बाद, अन्य संभावनाओं पर विचार किया जाना चाहिए जिसमें RNase संदूषण या नमूना क्षरण की संभावना शामिल है। प्रयोगशाला के भीतर RNase मुक्त क्षेत्रों के सावधानीपूर्वक नमूना भंडारण और हैंडलिंग और रखरखाव इन मुद्दों को बहुत कम या खत्म कर सकते हैं। हालांकि आरएनए अलगाव के मुद्दों को इस प्रोटोकॉल में एक और संभावित समस्या है, वाणिज्यिक किट का उपयोग बहुत इस मुद्दे को कम कर देता है, हालांकि देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि वे RNase मुक्त के रूप में बनाए रखा जाता है और कोई समाप्त समाधान होते है लिया जाना चाहिए । अंत में, सभी एंटीबॉडी-आधारित प्रक्रियाओं के साथ, बहुत में भिन्नता, भंडारण की स्थिति, एकाग्रता, या यहां तक कि शिपिंग में एंटीबॉडी की गुणवत्ता और पुलडाउन की बाद की सफलता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने की क्षमता है। नतीजतन, सावधान और दोहराया परीक्षण के बाद, हम सबसे सुसंगत और कुशल एंटीबॉडी उपलब्ध चुना ।

इस प्रोटोकॉल में अन्य प्रकाशित रिबोटैग प्रोटोकॉल के सापेक्ष दो प्रमुख संशोधन शामिल हैं जो सफलता की संभावना को काफी बढ़ाते हैं। एक फ्लैश जमे हुए ऊतक का उपयोग करने की क्षमता है, जिससे किसी भी बहुत, तकनीशियन, या तकनीकी रन विविधताओं से जुड़े मुद्दों को कम करने । नमूनों को एकत्र किया जा सकता है और एक बार में सभी नमूनों से हा-राइबोसोम्स के अलगाव की अनुमति संग्रहीत किया जा सकता है, जो भिन्नता के प्रमुख स्रोत हो सकते हैं। दूसरा, प्रीक्लियर स्टेप के अलावा रिबोटैग सिस्टम के अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा रिपोर्ट की गई पृष्ठभूमि की तरह को काफी कम कर देता है। हाल ही में, Sanz एट अल द्वारा एक प्रोटोकॉल रिपोर्ट गैरक्रेसंचालित कोशिकाओं14से राइबोसोम से जुड़े टेप की बहुतायत के कारण उच्च पृष्ठभूमि की उपस्थिति को इंगित करता है । हमारा प्रोटोकॉल एक प्रीक्लियरिंग कदम को शामिल करके इस मुद्दे को उपचार करता है, प्रभावी रूप से क्रे नकारात्मक आईपी नमूनों में आरएनए की उपस्थिति को नष्ट करता है।

सभी प्रणालियों की तरह, रिबोटैग सिस्टम की अंतर्निहित सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। जब अविशेषता सीआरई ड्राइवरों का उपयोग करते हैं, तो अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्रयोगात्मक नमूना उत्पादन से पहले किया जाना चाहिए। अनुवाद के नजरिए से, इस विधि की कई बारीकियों को नोट किया जाना चाहिए। सबसे पहले, रिबोटैग अनुवाद करने के लिए तैयार mRNAs और सक्रिय रूप से अनुवाद करने वालों के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देता है। इस प्रकार, वर्तमान रिबोटैग-आधारित विधियां अनुवाद दक्षता के मात्राकरण को व्यक्तिगत mRNAs के कार्य के रूप में अनुमति नहीं देती हैं। यदि अनुवाद दक्षता रुचि की है, तो इसे सेल-विशिष्ट आधार पर मापा जा सकता है यदि रिबोटैग विधि को पॉलीसम प्रोफाइलिंग जैसे अन्य अनुवाद विश्लेषण उपकरणों के साथ जोड़ा जाता है। दूसरे, व्यक्तिगत या जीनोटाइप निर्भर विचरण से उपजी कुल आरएनए बहुतायत परिवर्तनों को ध्यान में रखना मौलिक है । यही कारण है कि इनपुट आरएनए के सावधानीपूर्वक अलगाव इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के साथ और प्रत्येक से प्राप्त नमूनों को किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ों में जोड़ा जाता है। अंत में, और में RiboTag आधारित विश्लेषण के संबंध में, यह याद किया जाना चाहिए कि एक राइबोसोम के साथ सहयोग जरूरी साबित नहीं होता अनुवाद हो रहा है । ब्याज के लक्ष्यों में अनुवादविनियमन की पुष्टि करने के लिए विश्लेषण के माध्यमिक तरीकों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

यह प्रोटोकॉल रिबोटैग मॉडल का उपयोग करके पुरुष चूहों की रोगाणु कोशिकाओं से राइबोसोम से जुड़े आरएनए के अलगाव का वर्णन करता है। माउस प्रजनन और नमूना संग्रह के लिए लेखांकन नहीं, प्रोटोकॉल दो दिन लगते हैं, तीन घंटे पहले दिन के साथ, सबसे अच्छा दोपहर में किया, एक रात ऊष्मायन, काम के पांच घंटे बाद सुबह के बाद । यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि स्टॉक समाधान (एचबी और एचएसडब्ल्यूबी) के साथ-साथ ऊतक पीसने की तैयारी पहले से की जाए। प्रोटोकॉल की समग्र सफलता सही genotyping और कड़ाई से RNase मुक्त शर्तों पर निर्भर है । विशिष्ट सेल प्रकारों के अनुवाद की जांच करने की क्षमता भविष्य के अध्ययनों को प्रतिलेखन, अनुवाद और असंख्य सेल प्रकारों और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में प्रोटेम के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देगी।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच ग्रांट एनआईसीएचडी आर00एचडीआर083521 द्वारा ईएमएस और रटगर्स यूनिवर्सिटी से ईएमएस तक आंतरिक समर्थन के लिए वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL mechanical pipette Preference of researcher
1,4-Dithio-DL-threitol (8% Alfa Aesar A15797
1.7 mL or 2mL tubes Preference of researcher
10 mL conical tubes Preference of researcher
10 mL serological pippettes Preference of researcher
10 uL mechanical pipette Preference of researcher
20 uL mechanical pipette Preference of researcher
200 uL mechanical pipette Preference of researcher
5 mL serological pipettes Preference of researcher
50 mL conical tubes Preference of researcher
Anti-HA tag antibody Abcam ab18181 Antibody 1
Anti-HA tag antibody Antibodies.com A85278 Antibody 2
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice The Jackson Laboratory 17490 Or mice carrying Cre driver of choice
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice The Jackson Laboratory 11029
Benchtop centrifuge Preference of researcher
C1000 Touch thermal cycler BioRad 184-1100 Or equivalent thermal cycler
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000537 Or equivalent refrigerated centrifuge
Cyclohexamide Sigma Aldrich C7698-1g
Dissection scissors Preference of researcher
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen by ThermoFisher Scientific 10009D
DynaMag-2 Magnet rack Invitrogen by ThermoFisher Scientific 12321D
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 OMEGA 6834-01 Kit 1
Heat block Preference of researcher
Heparin Sigma Aldrich 84020
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272-500g
Microdissection forceps Preference of researcher
Microdissection scissors Preference of researcher
MiRNeasy kit Qiagen 217004 Kit 2
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Or equivalent spectrophotometer
NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem Millipore Sigma 492016
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free ThermoFisher Scientific A32965
Potassium (KCl) Sigma Aldrich P3911-2.5kg
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs Inc. M0314
SI vortex-genie 2 Scientific Industries SI-0236 Or equivalent benchtop vortex
Tips for 1 mL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 10 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 20 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 200 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-500
Tube Revolver / Rotator ThermoFisher Scientific 88881001 Or equivalent rotator
VWR Powerpette Plus pipet controller VWR 75856-450 Or equivalent pipette controller

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 सेल-विशिष्ट पुरुष रोगाणु कोशिका आरएनए रिबोटैग रिबोसोम अनुवाद शुक्राणुजनन
पुरुष माउस की रोगाणु कोशिकाओं में रिबोटैग इम्यूनोप्रिसिप्रिमिटेशन
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Chukrallah, L. G., Seltzer, K.,… More

Chukrallah, L. G., Seltzer, K., Snyder, E. M. RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse. J. Vis. Exp. (157), e60927, doi:10.3791/60927 (2020).

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