Summary
هنا ، نصف الترسيب المناعي للريبوسوم والحمض النووي الريبي المرتبط به من مجموعات مختارة من الخلايا الجرثومية الذكور الذكور البالغين باستخدام نظام RiboTag. التربية الاستراتيجية والتناهيال المناعة دقيق يؤدي إلى نتائج نظيفة، قابلة للاستنساخ التي تبلغ عن الترجمة الخلية الجرثومية وتوفير نظرة ثاقبة في آليات الظواهر المتحولة.
Abstract
قياس الاختلافات في وفرة مرنا هو نهج كلاسيكي لفهم تأثير طفرة جينية معينة على فسيولوجيا الخلايا. ومع ذلك ، فإن توصيف الاختلافات في الترجمة (كل mRNAs المترجمة) يوفر طبقة إضافية من المعلومات المفيدة بشكل خاص عند محاولة فهم وظيفة الحمض النووي الريبي ينظم أو البروتينات الملزمة. وقد تم تطوير عدد من الطرق لتحقيق ذلك، بما في ذلك التنميط الريبوسوم وتحليل تعدد الاتجاهات. ومع ذلك، تحمل كلتا الطريقتين تحديات تقنية كبيرة ولا يمكن تطبيقها على مجموعات خلايا محددة داخل الأنسجة ما لم تقترن بأساليب فرز إضافية. وعلى النقيض من ذلك، فإن طريقة RiboTag هي بديل وراثي وفعال ومباشر تقنيًا يسمح بتحديد الحمض النووي الريبوي المرتبط من مجموعات خلايا محددة دون خطوات فرز إضافية، شريطة توفر برنامج تشغيل Cre محدد الخلية. تتكون هذه الطريقة من التربية لتوليد النماذج الوراثية، وجمع العينات، والهطول المناعي، وتحليلات الحمض النووي الريبي المصب. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه العملية في الخلايا الجرثومية الماوس الذكور الكبار متحولة لبروتين الحمض النووي الريبي ملزمة المطلوبة لخصوبة الذكور. ويولى اهتمام خاص لاعتبارات التربية مع التركيز على كفاءة إدارة المستعمرة وتوليد الخلفيات الوراثية الصحيحة والهطول المناعي من أجل الحد من الخلفية وتحسين الناتج. كما يتم تضمين مناقشة خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتجارب التأكيدية الإضافية والتطبيقات النهائية المحتملة. تمثل الأدوات الوراثية والبروتوكولات الجزيئية المقدمة طريقة قوية لوصف الحمض النووي الريبي المرتبط بالخلايا الريبية لتجمعات خلايا محددة في أنسجة معقدة أو في أنظمة تخزين وترجمة مرنا شاذة بهدف الإبلاغ عن الدوافع الجزيئية للأنماط الظاهرية المتحولة.
Introduction
وقد ثبت تحليل وفرة الحمض النووي الريبي للخلية أو الأنسجة ، كما تم فحصها من قبل microarray أو تسلسل الحمض النووي الريبي ، أداة قوية لفهم الدوافع الجزيئية للأنماط الظاهرية المتحولة. ومع ذلك ، قد لا تبلغ أدوات التحليل غير المكتملة نسبيًا عن فسيولوجيا الخلية أو بروتيومها ، خاصة في الأنظمة التي يتم فيها تخزين العديد من المواد المرنازة قبل الترجمة مثل الخلايا العصبية والجرثومية. في هذه الأنظمة، قد يكون تحديد عدد الـ mRNAs الذي يتم ترجمته بنشاط إلى بروتين، أو ترجمة الخلية، مؤشرًا أفضل لحالة الخلية الفسيولوجية الفعلية1،2. على سبيل المثال، الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة من التنمية نسخ الحمض النووي الريبي التي يتم تخزينها للترجمة في وقت لاحق، مدفوعة إما عن طريق التنموية3 أو الإشارات الإشارات4. وتتمثل هذه العملية من خلال بروتامينات ترميز mRNAs، حيث يمكن الكشف عن نسخة مرنا قبل أيام من البروتين يتم1،2،5،6. وبالمثل ، تقوم الخلايا العصبية بتدوين الحمض النووي الريبي في النواة ونقله إلى أسفل محور عصبي ، كما هو الحال مع α-actin7. بالإضافة إلى أنظمة الخلايا المتخصصة هذه ، من غير المرجح أن تكون النسخ الثابتة الحالة مفيدة في النماذج التي تتأثر فيها تخزين الحمض النووي الريبي ، أو التكوين الحيوي الريبوسوم ، أو ترجمة مرنا. عوامل أخرى متعددة قد تؤثر أيضا على تجمع الحمض النووي الريبي ثابت في الخلية تشمل الاضمحلال مرنا ونشاط البروتينات الملزمة الجيش الملكي النيبالي. وفي هذه الحالات، من المرجح أن تسفر الأدوات القوية لتحليل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم أو الحمض النووي الريبي تحت الترجمة النشطة عن نتائج ذات صلة بيولوجياً.
وتحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير عدة أساليب لتحديد الرسائل المرتبطة بالريسوم أو التي تترجم بنشاط. وقد استخدمت التنميط المتعدد، الذي يوفر لقطة من النصوص المرتبطة الريبوسوم، لعدة عقود لعزل الحمض النووي الريبي سليمة المرتبطة إما الوحدات الفرعية risomeal أو أحادية، دي، وبولي ريبوسوم المجمعات3. لفترة وجيزة، يتم تطبيق الخلايا التي تم جمعها على تدرج السكروز الخطي والطرد المركزي وسرعة عالية، مما أدى إلى فصل الوحدات الفرعية الريبوسوم، الريبوسوم سليمة، والبوليسومات حسب الحجم. تقليديا، وقد تم تطبيق هذه التقنية لدراسة واحد أو عدد قليل من mRNAs، ولكن في الآونة الأخيرة تم الجمع بين هذه الطريقة مع دراسات RNA-seq لتوضيح وظيفة المنظمين الانتقالية المحتملة8،9 في حين أن وسيلة قوية للتمييز بين ترجمة بنشاط وعدم ترجمة mRNAs10،التنميط متعددة الجوانب لا تتطلب أساليب تستغرق وقتا طويلا (التدرج الكسور والطرد المركزي) ويمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من عينة صنع تحليل خلية نادرة السكان تحديا.
وهناك نهج بديل لفحص الترجمة هو التنميط الريبوسمي ، الذي يحدد أجزاء من النصوص المرتبطة مباشرة مع الريبوسم. باختصار ، يتم إنشاء شظايا الحمض النووي الريبي المرتبطة بها عبر تحليل حماية RNase ، ومجمعات الريبوسوم الفردية المنفصلة عن طريق تدرج السكروز ، وشظايا الحمض النووي الريبي المرتبطة بها المعزولة وتحويلها إلى علامات RNA-seq قابلة للتسلسل العميق11. واحدة من الفوائد الرئيسية لتنميط الريبوسوم هو القدرة على تحديد مواقع محددة من الريبوسوم في وقت العزلة التي تسمح بتحديد مواقع بدء الترجمة، وحساب شغل الريالصدر والتوزيع، وتحديد أكشاك الريبوسوم12. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها العديد من العيوب المتأصلة ، بما في ذلك احتياجات المعدات (الكسر التدرجي وultracentrifuge) ، وهو بروتوكول معقد نسبيًا يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها على نطاق واسع ، والمشكلات الحسابية التي لا يمكن التعامل معها بسهولة من قبل المستخدم11عديم الخبرة . الأهم من ذلك ، يتم تطبيق التنميط الريبوسوم في المقام الأول على الخلايا المعزولة في الثقافة ويتطلب مواد كبيرة ، مما يجعل تطبيقه على الأنسجة المختلطة من نوع الخلايا أو الخلايا المصنفة من في الجسم الحي محدودة.
طريقة ريبوتاغ الثدييات، التي وضعتها سانز وآخرون في عام 200913،يلغي عددا من القضايا الكامنة في كل من التنميط المتعدد والريبوسوم. في هذه الطريقة ، يمكن عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم عن أنواع الخلايا المحددة مما يسمح بالتحقيق في الترجمة المحددة من نوع الخلية في الأنسجة المعقدة دون تقنيات عزل إضافية ومعدات متخصصة ، كما هو ضروري في طرق أخرى13،14. أساس طريقة RiboTag هو نموذج الماوس المعدلة وراثيا (RiboTag) تحمل مكان تعديل ل60S ribosomal subunit بروتين الجينات Rpl22. يتضمن هذا الموضع(Rpl22-HA)إكسون محطة متخبط ة متبوعة بنسخة إضافية من exon المحطة الطرفية المعدلة لتشمل علامة Hemagglutinin C-terminal (HA) داخل منطقة الترميز. عندما عبرت إلى ماوس يعبر عن الـ Cre Recombinase خاصة بالخلية، تتم إزالة exon floxed السماح بالتعبير عن RPL22 الموسومة HA بطريقة محددة الخلية(الشكل 1). ويمكن بعد ذلك استخدام علامة HA للترسبات الريبوسوم المناعية (IP) والحمض النووي الريبي المرتبط بها من نوع الخلية المحدد.
وبالإضافة إلى النشر الأولي الذي طور هذه التقنية، استخدمت عدة مختبرات أخرى نموذج ريبوتاغ. الأنسجة المتنوعة مثل الماوس سيرتولي وخلايا ليديغ15، microglia16، الخلايا العصبية17،18، البويضات19، والخلايا المستزرعة20 وقد تم لمحة ودراستها. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو واضح قادرة على عزل بنجاح الريبوسوم والرناس المرتبطة بها عبر أنواع الأنسجة المتنوعة لا تزال هناك مناطق تحتاج إلى تحسين، وخاصة عندما تطبق على أنظمة متحولة. على وجه الخصوص ، يؤدي الاعتماد المشترك على الأنسجة الطازجة إلى زيادة الاختلاف التقني الذي يمكن أن يقلل إلى حد كبير من قوة التحليل. ثانياً، يتم جعل التحديد الواثق للأهداف المترجمة بشكل تفاضلي أكثر صعوبة عندما تحدث خلفية عالية من التهطال المناعي من أنواع الخلايا غير المؤتلفة كما تم الإبلاغ عنها سابقًافي 13. في حين أن سانز وآخرين هندسوا الفرضية الأساسية للتقنية ، في هذه المخطوطة يقدم مختبر سنايدر التحسين من البروتوكول للحد من هذه المخاوف ، مما يجعل الأسلوب أكثر عملية وكفاءة.
الغرض من هذه المقالة هو شرح الخطوات لتربية الفئران التي تعبر عن الريبوسوم المحددة بالخلايا ، وترسيب هذه الريبوسوم من العينات المجمدة فلاش ، وتنقية الحمض النووي المرتبطة بها لمزيد من التحليلات المصب. وبما أن الخلية الجرثومية الذكورية للثدييات وطفرة العقم المدروسة توفران تحديات فريدة من نوعها، فقد بُذلت جهود لإلقاء الضوء على الطرق التي يمكن بها تكييف هذه التقنية مع أنظمة الخلايا الأخرى.
Protocol
تمت الموافقة على جميع ممارسات استخدام الحيوانات والتعامل معها من قبل لجنة رعاية الحيوانات الداخلية واستخدامها في جامعة روتجرز (IACUC).
1. تربية الفئران
- تولد أنثى الفئران homozygous لطفرة البروتين الحمض النووي الملزمة التي تؤدي إلى العقم الذكور (مخطوطة في إعداد، ويشار هنا باسم الجين من الفائدة) في التزاوج الثلاثي للذكور hemizygous لأليل Stra8-iCre (B6). FVB-Tg (Stra8-iCre)1Reb/LguJ)(Cre+)، كما الاقتران اثنين من الإناث إلى كل ذكر يزيد من كفاءةالتربية.
ملاحظة: تم تمرير الجين المتحول ة ذات الأهمية (M) أمياً، حيث أن الإناث المتماثلات لـ M لديهم خصوبة طبيعية. هذا له فائدة إضافية من السماح انتقال الأب من الخلية الجرثومية الذكور كري (hemizygous), كما أوصت21 وتحسين نسبة في المئة من النسل مع الجمع بين أليلك المطلوب. لأن homozygous كريس يحمل سمية الخلايا الجرثومية22، فمن المستحسن أن يتم الحفاظ على أليل وتمريرها في حالة heterozygous أو hemizygous. الأهم من ذلك، يجب ألا يحدث تعبير Cre مع أليل Rpl22-HA حتى السكان التجريبيين. الفشل في عزل أليل Rpl22-HA من الكري في تربية الحيوانات سيؤدي إلى ذرية تعبر على الصعيد العالمي Rpl22-HA بسبب نشاط الخلايا الجرثومية Cre. هذه المشكلة خاصة الخلية الجرثومية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن Stra8- iCre محددة لسكان الخلايا المؤلفين من الفائدة22، واستهداف الخلايا التي تنتقل إلى ومبكرة جدا في meiosis ، بما في ذلك السيليبوتين واللبتوتينات. يمكن استخدام برنامج تشغيل Cre مختلف خاص بنوع خلية آخر من الفائدة بدلاً من ذلك. الممارسة الشائعة تملي ذكر الخلية الجرثومية أعرب كريس تنتقل على الجانب الأبوي. ومع ذلك، فمن الممكن انتقال الأم من Stra8-iكري سيؤدي إلى التعبير transgene مماثلة في ذرية الذكور. بغض النظر عن نظام التربية المختارة ، من أجل توليد النسل مع التعبير الكري المكافئ ، يجب إنشاء جميع العينات التجريبية عن طريق انتقال الكري من نفس الجانب الأبوي (إما الأم دائمًا أو الأبويدائمًا). - النمط الجيني الناتج عن الجراء الذكور على النحو المبين في القسم 2.4. حدد تلك التي تحمل أليل M وإيجابية لCre (+/M:Cre+) لتربية المصب.
- سلالة الفئران الإناث homozygous لأليل M في التزاوج الثلاثي إلى الذكور homozygous لRpl22-HA (B6J.129 (Cg)-Rpl22tm1.1Psam/ SjJ).
ملاحظة: الخلفية Rpl22-HA مختلطة للغاية، لذلك يجب توخي الحذر عند تقييم الأنماط الظاهرية الخاصة بالإجهاد. - الجراء الأنثوية الناتجة عن النمط الجيني لتحديد أولئك الذين يحملون أليل M وإيجابية لRpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (انظر القسم 2.3). حدد هؤلاء الإناث لتربية المصب.
- عبر +/M:Cre+ الذكور مع +/M:Rpl22+ الإناث في التزاوج الثلاثي. نمط جينيالالجراء الناتجة (انظر القسمين 2.3 و 2.4) لتحديد الذكور الذين هم على حد سواء Cre + و Rpl22 + وإما البرية أو M / M.
ملاحظة: بما أن هذا العمل يركز على طفرة تؤدي إلى العقم الكامل للذكور، فقد تم أخذ اعتبارات خاصة في مخطط التربية للحصول على الأنماط الجينية التجريبية المطلوبة بكفاءة أكبر. وقد تكون هذه الاعتبارات غير ضرورية في نماذج تجريبية أخرى. انظر الشكل 2 للحصول على مخطط تربية كاملة والأسطورة المصاحبة لمناقشة إضافية لاعتبارات التربية.
2. جمع العينات
- جمع الخصيات من الفئران الذكور في 21 يوما بعد الولادة (dpp).
- الفئران التضحية عن طريق استنشاق CO2 تليها خلع عنق الرحم. قم بعمل شق بطني (3 سم) على كل من الحيوانات يحيط به اثنان أقصر (2 سم لكل منهما) ، شقوق جانبية متصلة. سحب الجلد وبريتونيوم مرة أخرى للكشف عن الخصيتي.
- باستخدام ملقط، اسحب وسادة الدهون البديمامنة من جانب واحد من تجويف الجسم للكشف عن البديميسية والخصية. مع مقص فحس، استئصال الخصية، مع الحرص على تقليم بعيدا epididymis، والدهون المحيطة بها، وأي الأوعية الدموية الخارجية. ضع الخصاب سليمة في أنبوب 1.7 مل نظيفة.
- كرر مع الجانب الآخر، إضافة الخصية الثانية إلى الأنبوب الأول. كاب هذا الأنبوب وغمره على الفور في النيتروجين السائل لتجميد الفلاش.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- جمع عينات تلميح ذيل إضافية لكل الحيوان (2 ملم) لتأكيد الجينوبتايب.
- لاستخراج الحمض النووي، أضف 100 ميكرولتر من 50 مل NaOH إلى طرف ذيل 2 مم في أنبوب 1.7 مل وغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من 50 مل من HCl و 20 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl pH 8.0 وعينات الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة عند 10000 × ز. الاحتفاظ بـ supernatant (يحتوي على الحمض النووي الجينومي) وتخزين الحمض النووي المستخرج عند 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه كقالب لتفاعلات الجينوبة التالية.
- تنفيذ Rpl22-HA genotyping باتباع طريقة مقتبسة من Sanz et al.13 باستخدام الالتمهيديالتالي التالي: إلى الأمام: 5' GGGAGGCTTGCTGGATATG 3'; عكس: 5'TTCCAGACACAGGCTAAAACAC 3'.
- إعداد خليط رد فعل يتكون من 2 ميكرولتر من الحمض النووي كما هو مستخرج في الخطوة 2.2.1، 0.08 ميكرولتر من 25 mM dNTPs، 0.1 μL من 10 mM التمهيدي إلى الأمام، 0.1 ميكرولتر من 10 مللي متر مربع عكسي، 2 ميكرولتر من حاجز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (650 mM Tris pH = 8.8، 165 مللي متر (NH4)2SO4،30 mM MgCl2،و 0.1٪ Tween)، 0.2 μL من بيمرماز تق، وNclease خالية H2O إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
- استخدام الشروط الحرارية التالية: خطوة ذوبان التمهيدي 30 s في 95 درجة مئوية، 30 s الصلب في 64 درجة مئوية و30 s اطالة في 72 درجة مئوية، وكرر 37 مرات مع اطالة 5 دقيقة النهائي في 72 درجة مئوية.
ملاحظة: أدى هذا حجم المنتج من 260 bp لعينات البرية و 292 bp للعينات التي كانت Rpl22-HA +
- أداء الكريات المخروطية باستخدام التمهيديات التالية: إلى الأمام: 5 ' GTGCCAGCTGCGAACAACAGGA 3'; عكس: 5 'AGGGACACAGCATTGGAGTC 3'. إعداد رد فعل PCR كما هو موضح في الخطوة 2.3.2 باستخدام التمهيديات كري بدلا من ذلك. استخدام الشروط الحرارية التالية: خطوة ذوبان التمهيدي 30 s في 95 درجة مئوية، 30 s الصلب في 60 درجة مئوية و15 s اطالة في 72 درجة مئوية، وكرر 35 مرة مع اطالة 5 دقيقة النهائي في 72 درجة مئوية.
- تنفيذ الجينات ذات الأهمية الجينية كما هو المعيار للجين في السؤال.
ملاحظة: يستخدم بروتوكول الطباعة الجينية للمؤلف طاقةمخصصة مركزة ، وعلى هذا النحو ، قد يضطر المستخدمون الآخرون إلى تعديل الشروط لتتناسب مع متطلباتهم الأنزيمية. من أجل فهم أفضل لتأثير هذا الجين من فقدان الفائدة على الترجمة، تم اختيار الذكور التي كانت إما البرية أو homozygous للأليل متحولة من الفائدة، التي كانت أيضا Cre + و Rpl22 + لتكون العينات التجريبية. ويناقش اختيار النمط الجيني كذلك في الفرع 1.
3- إعداد الحلول
ملاحظة: يجب إعداد الحلول وجميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف صارمة.
- لإعداد العازلة التجانس (HB)، إضافة 2.5 مل من 1 M تريس درجة الحموضة 7.4، 5 مل من 1 M KCl، 600 ميكرولتر من 1 M MgCl2،و 500 ميكرولتر من NP-40 إلى أنبوب 50 مل. جلب إلى حجم (50 مل) في البيروكربونات الديثيل (DEPC) H2O ومزيج حتى يتم دمج جميع المكونات.
ملاحظة: ستكون التركيزات النهائية على النحو التالي: 50 mM Tris pH 7.4، 100 mM KCl، 12 mM MgCl2،و 1٪ NP-40. - لإعداد عالية مغسلة الملح عازلة (HSWB)، إضافة 2.5 مل من 1 M تريس درجة الحموضة 7.4، 15 مل من 1 M KCl، 600 ميكرولتر من 1 M MgCl2،و 500 ميكرولتر من NP-40 إلى أنبوب 50 مل. جلب إلى حجم (50 مل) في DEPC H2O ومزيج حتى يتم دمج جميع المكونات.
ملاحظة: ستكون التركيزات النهائية على النحو التالي: 50 mM Tris pH 7.4، 300 mM KCl، 12 mM MgCl2،و 1٪ NP-40يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا، ويمكن تخزين الحلول في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
4. إعداد الأنسجة
- تزن قبل جميع أنابيب العينة، وتسجيل الوزن، وprecool في النيتروجين السائل.
- قذيفة هاون معقمة مسبقة البرودة، والحشرات، ووزن ملعقة على الجليد الجاف.
- طحن عينات الأنسجة المجمدة فلاش إلى مسحوق ناعم باستخدام مدافع هاون معقمة مسبقة التبريد والحشرات على الجليد الجاف.
- ضع الأنسجة المجمدة فلاش في هاون مبردة مسبقا على الجليد الجاف. كسر بلطف الأنسجة إلى قطع كبيرة باستخدام الحشرات وطحن ببطء حتى الأنسجة هو مسحوق ناعم.
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن أيضًا استخدام الأنسجة الطازجة ، حسب البروتوكول الأصلي13، لا يلاحظ أي اختلاف كبير في النتيجة مع استخدام الأنسجة المجمدة. راجع النتائج التمثيلية والمناقشة للحصول على التفاصيل. - نقل بعناية عينة الأرض إلى أنبوب جمع مسبق التبريد عن طريق كشط مسحوق من هاون باستخدام ملعقة مبردة مسبقا. تأكد من جمع الأنسجة فقط وليس أي رطوبة مودعة على الهاون البارد.
- وزن الأنبوب مع الأنسجة، مع الحرص على الحفاظ على الجليد الجاف كلما كان ذلك ممكنا. حساب كتلة الأنسجة عن طريق طرح الوزن الأولي للأنبوب من وزن الأنبوب مع العينة في ذلك. تسجيل هذه القيمة للحساب الأحدث لوحدات تخزين المخزن المؤقت للإنس.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا، ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ضع الأنسجة المجمدة فلاش في هاون مبردة مسبقا على الجليد الجاف. كسر بلطف الأنسجة إلى قطع كبيرة باستخدام الحشرات وطحن ببطء حتى الأنسجة هو مسحوق ناعم.
5. تجانس العينة
- إعداد العازلة الليسي (10 مل HB + ملاحق) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol (DTT), 1 قرص مثبط البروتياز, 50 μL من مثبط RNase (40,000 وحدة/مل), 200 ميكرولتر من 5 ملغ/مل cycloheximide, و 100 ميكرولتر من 100 ملغ/مل الهيبارين إلى 10 مل من تخلط حتى يتم دمج جميع المكونات وتبقي على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: ستكون التركيزات النهائية للمكملات الغذائية في 10 مل HB على النحو التالي: 1 mM DTT، 200 U/mL RNase مثبط، 100 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيد، و 1 ملغ/مل هيبارين. يجب استخدام هذا الحل في غضون 24 ساعة من إضافة المكملات الغذائية ويمكن الاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام. - لكل 100 ملغ من العينة، إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للانليس. مع نفس ماصة المستخدمة لإضافة المخزن المؤقت lysis، ماصة بعناية lysate الناتجة صعودا وهبوطا إلى أجزاء الخلايا ومزيج. استمر في الأنابيب حتى لا تصبح العينة لزجة، بشكل عام 25-30 ضربة.
ملاحظة: لأن الحل لزج جداً في البداية، يجب استخدام ماصة قطرها كبير لخلط الحل. معيار 1000 ميكرولتر عادة ما تكون كافية ل100 ملغ من الأنسجة. - تعيين عينات على الجليد لمدة 10 دقيقة لlyse. ثم، تدور العينات في جهاز طرد مركزي مبرد ة مسبقا (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة في 10،000 × ز. وينبغي أن تشكل كبيرة، فضفاضة، بيليه غائم في الجزء السفلي من الأنبوب.
- الحرص على عدم إزعاج بيليه، وجمع lysate في أنبوب جديد وسجل حجم لكل عينة. لمنع إزالة العينات، تأكد من أن العينات لا تزال باردة في جميع أنحاء البروتوكول المتبقي، وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية كلما كان ذلك ممكنا.
6. توازن الخرز
- باستخدام حجم الليزات من الخطوة 5.2 ، قم بحساب الحجم المطلوب من الخرز المغناطيسي إلى جانب بروتين ربط الأجسام المضادة المناسبة (في هذه الحالة ، البروتين G). ل1 مل من ليسات، واستخدام 375 ميكرولتر من البروتين G الخرز (30 ملغ /مل).
ملاحظة: اختيار الخرز المترافق سوف تختلف مع الأجسام المضادة المضادة لHA المستخدمة; على سبيل المثال، إذا تم اختيار جسم مضاد مضاد لـ HA يتم إنشاؤه بواسطة الأرانب، فإن البروتين A الخرز سيكون أفضل. - باستخدام رف أنبوب مغناطيسي، وإزالة المذيبات حبة وإضافة حجم متساو من المخزن المؤقت التحلل الطازج إلى الخرز. تدوير 5 دقيقة في 4 درجة مئوية لغسل. تنفيذ جميع خطوات التناوب باستخدام أنبوب مقاعد البدلاء الدوار تعيين إلى 20 دورة في الدقيقة.
- ضع الأنبوب على رف الأنبوب المغناطيسي وأزل المخزن المؤقت للغسيل.
- كرر الخطوات 6.1−6.3 مرتين.
- إضافة المخزن المؤقت للإنطول في وحدة التخزين الأصلية إلى الخرز المتوازن. تخزينها في 4 درجة مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام.
7. عينة المقاصة المسبقة
- أضف 50 ميكرولتر من الخرز المتوازن لكل مل من الليفات إلى supernatant من العينة المنسّحة (الليزات) وتدويرها عند 4 درجات مئوية لساعة واحدة.
- وضع أنبوب على رف المغناطيس وجمع lysate في أنبوب جديد. تجاهل الخرز المستخدم.
- إلى lysate إضافة 25 ميكرولتر من الخرز المتوازن لكل 1 مل وتدوير في 4 درجة مئوية ل1 ح. تخزين المتبقية بروتين حبات G في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وضع أنبوب على رف المغناطيس وجمع lysate في أنبوب جديد. تجاهل الخرز المستخدم. من lysate مسح، والاحتفاظ 50 ميكرولتر لتكون بمثابة عينة التحكم في المدخلات. تخزين في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: تعمل عينة الإدخال كعنصر تحكم يمثل إجمالي عدد الحمض النووي الريبي للعينة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المرتبط بأنواع الخلايا الأخرى في الأنسجة، لاستخدامها أثناء التحليلات النهائية لتصحيح تغيرات التعبير الجيني كدالة للطفرة.
8. احتضان الأجسام المضادة
- لكل 1 مل من الليزات المطهرة، أضف 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة لـ HA. لمنع فقدان العينة، ختم غطاء أنبوب مع فيلم المختبر. تدوير العينات 16−18 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لم يتم تحسين وقت حضانة الأجسام المضادة والتركيز. ووجد المؤلفون أن الحضانة بين عشية وضحاها مع 5 ميكروغرام كافية؛ ومع ذلك ، فمن الممكن أن حضانة أقصر أو أقل الأجسام المضادة ستكون كافية ، أو أن حضانة أطول أو أكثر من الأجسام المضادة سوف تحسن الربط.
9. احتضان الخرز
- لكل 1 مل من الليزات الخالية، إضافة 300 ميكرولتر من البروتين G الخرز. إعادة ختم غطاء أنبوب مع فيلم المختبر وتدوير ل2 ساعة في 4 درجة مئوية.
10. غسل الخرز
- ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس للسماح للحبات بالانفصال عن الـ IPed lysate. ماسيت قبالة تدفق من خلال lysate وتجاهل، والإبقاء على الخرز.
- تطبيق 800 ميكرولتر من HSWB على الخرز والسماح لتدوير لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس واسمح للحبات بالانفصال عن الغسيل. إزالة والتخلص من غسل.
- تطبيق آخر 800 ميكرولتر من HSWB على الخرز. إغلاق العينة والسماح لتدوير لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس واسمح للحبات بالانفصال عن الغسيل. إزالة والتخلص من غسل.
- كرر الخطوة 10.3 مرة أخرى.
11. استخراج الحمض النووي الريبي
- ضع أنبوب العينة على رف المغناطيس واسمح للحبات بالانفصال عن الغسيل. ماسيت قبالة وتجاهل غسل، والاحتفاظ الخرز لاستخراج الحمض النووي الريبي. أضف 3.5 ميكرولتر من 14.2 M بيتا-ميركابتوإيثانول (bME) إلى الخرز وتخلط عن طريق الدوامة لمدة 15 s.
- استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي التجارية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عينة Elute في 30 ميكرولتر من RNase الحرة H2O.
ملاحظة: على الرغم من أن العلاج DNase 10 μL/sample اختياري لمعظم المجموعات، إلا أنه يتم تشجيعه بقوة. تقلل خطوة التنظيف الاختيارية هذه بشكل كبير من الخلفية، مما يسمح بتركيز نهائي أكثر دقة. يتم recommened بقوة لاستخدام مجموعة تحتوي على بيتا ميركابتوإيثانول (bME) في المخزن المؤقت للانليس. bME بمثابة مثبط RNase إضافية لمنع تدهور العينة أثناء عزل الحمض النووي الريبي. - تخزين عينة في -80 درجة مئوية أو تحليل على الفور.
12 - القياس الكمي وتحليل العينات
- باستخدام مقياس الطيف بالأشعة فوق البنفسجية، يمكنك قياس تركيز الحمض النووي الريبي والجودة الأولية.
- تحليل جودة الحمض النووي الريبي المستخرج من العينات عن طريق محلل حيوي.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك استخدام الحمض النووي الريبي الناتج لتسلسل الحمض النووي الريبي أو التحليلات الأخرى في المصب مثل النشاف الشمالي أو النسخ الكمي العكسي PCR (qRT-PCR).
Representative Results
وقد اقترحت تقارير سابقة هطول المناعة غير محددة من الخلايا التي تفتقر إلى Cre14. من أجل تحديد ما إذا كان هذا هو الحال في بروتوكولنا المعدل ، تم تحديد كفاءة IP في العينات المشتقة من الحيوانات التي تحمل كل من Cre و Rpl22-HA والحيوانات التي تحمل واحدة فقط ولكن ليس الأخرى مع توقع أنه بدون كل من Cre-driver و Rpl22-HA، يجب أن يكون الحمض النووي الريبي المناعي ضئيلًا. كما هو مبين في الشكل 3، يتم عزل القليل جدا من الحمض النووي الريبي من العينات التي تفتقر إما Cre أو Rpl22-HA مما يدل على فعالية هذا البروتوكول للحد من خلفية الملكية الفكرية وعزل الحمض النووي الريبوي الحقيقي الريبوسوم HA الموسومة. علاوة على ذلك ، كل من Cre -فقط وRpl22 -HA- عينات فقط تمثل الضوابط السلبية المناسبة.
وبالنظر إلى احتمال أن يؤثر مصدر الكاشف تأثيراً كبيراً على كفاءة الملكية الفكرية، تم اختبار سلسلة من الأجسام المضادة وبروتوكولات عزل الحمض النووي الريبي(الشكل 4)في عينات إيجابية من الكري وRpl22-HA. هذه النتائج تبين اختيار كاشف يمكن أن يكون لها تأثير كبير على كفاءة الملكية الفكرية وبالتالي أي تغييرات في اختيار كاشف ينبغي أن يتم ذلك بعناية.
من أجل اختبار هذا البروتوكول في سياق بروتين ملزم RNA متحولة، wildtype-Cre +Rpl22-HA+ (wildtype) والجينات ذات الأهمية-/--Cre+Rpl22-HA+ (جين الفائدة-/-) تم فحص الخصية لفعالية نظام RiboTag لعزل الريبوسوم المرتبطة بالحمض النووي الريبي(الشكل 5). عندما تمت مقارنة تركيز الحمض النووي الريبي من مدخلات النمط البري والملكية الفكرية بجين الفائدة-/- الإدخال والملكية الفكرية، لم يكن هناك فرق كبير بين الأنماط الجينية. أما بالنسبة لكلا النمطين الجينيين، فقد كان تركيز المدخلات أعلى بكثير من تركيز بروتوكول الإنترنت، مما يشير إلى وجود المزيد من الحمض النووي الريبي في عينة المدخلات(الشكل 5باء). ومن المتوقع أن تكون هذه النتيجة، حيث لا ترتبط جميع الـ mRNAs الموجودة في الخلية بالريبوسوم في أي وقت من الأوقات، وخاصة في حالة الخلايا الجرثومية حيث يمكن نسخ الحمض النووي الريبي قبل ترجمتها بوقت طويل.
من أجل تأكيد جودة عينات الحمض النووي الريبي المرسلة للتسلسل ، تم تشغيل العينات على محلل حيوي. تم مقارنة أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (RINs)، التي تحسب عادة كنسبة من قمم 28S و 18S rRNA، عبر العينات. في مجموع برك الحمض النووي الريبي، ومن المتوقع أن تكون قيم رين بالقرب من 10 مع أعلى RIN المرتبطة أعلى تكامل العينة الاستدلال والجودة. في حين أن عينات IP كان RIN أقل من المدخلات، كانت RINs لا تزال ضمن نطاق مقبول ولم تكن تعتمد على نموذج الجينوم(الشكل 5C). ومن المرجح أن تكون قيم الرين المخفضة للعينات الـ IPed نتيجة لتدهور الحمض النووي الريبي على الرغم من صغر حجمها نظراً للانخفاض الصغير نسبياً في متوسط طول النيوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي الذي تم تحليله. وبالنظر إلى طول البروتوكول ودرجات الحرارة اللازمة للهطول المناعي، من المتوقع حدوث بعض التدهور. ومن الممكن أيضا انخفاض RIN وطول الحمض النووي الريبي هو وظيفة من التخصيب للأنواع غير rRNA، مثل مرنا.
الشكل 1: طريقة ريبوتاغ. فرضية الأسلوب هو بسيط بيولوجيا. يتم إدراج Exon 4 جديد في تسلسل لRpl22 locus المصب من Exon 4 الأصلي. في وجود سائق Cre ، يتم قطع مواقع loxP على جانبي Exon 4 الأصلي ، واستئصال الإكسيون المتعثر. يتم دمج EXON 4 الموسومة HA الآن في Rpl22 مرنا، وتوليد HA الموسومة RPL22 في الخلايا التي تعبر عن CRE. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تربية العينات لفئران ريبوتاغ. ويظهر مخطط التربية المستخدم لتوليد الحيوانات التجريبية. واستخدم مخطط ذو شقين. في الجيل 1، تم إنشاء مجموعتين متوازيتين من الثلاثيات المربي. جانب واحد الجمع بين أليل الفائدة (حملت الأمومية كما يؤدي هذا الطفرة المحددة في العقم عند الذكور) مع cre hemizygous وعلى الآخر الجمع بين أليل الفائدة, حملت مرة أخرى أمومي, مع Rpl22-HA. ثم، في الجيل 2، يتم عبرت الذكور من الاقتران الأول التي تحمل أليل الفائدة وكري إلى ذرية الإناث من الاقتران الثاني التي تحمل أليل الفائدة وRpl22-HA. يتم تحديد الأنماط الجينية للنسل الناتج ، ويتم اختيار الحيوانات ذات الصلة تجريبيًا (في هذه الحالة إما النمط البري أو متحولة متجانسة تحمل كل من Cre و Rpl22-HA alleles). من المهم أن نلاحظ للخلية الجرثومية التعبير عن السائقين Cre، وCre و Rpl22-HA alleles لا ينبغي أن تولد معا حتى الجيل التجريبي. التعرض للأليل Rpl22-HA لكري الخلايا الجرثومية التي أعرب عنها في أجيال التكاثر سوف تدفع الختان Rpl22-HA الخلية الجرثومية. أي ذرية الناتجة سوف تعبر على الصعيد العالمي Rpl22-HA وبالتالي منع عزل الريبوسوسوم خلية محددة. وفي النظام الموصوف هنا، يوفر العدد = 4 لكل نمط جيني قوة إحصائية كافية لإجراء تحليلات نهاية الطريق. وينبغي تحديد عدد التكرار البيولوجي لكل نظام تجريبي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تأكيد الضوابط السلبية. العينات التي هي Cre + و Rpl22- HA + تظهر أعلى من سحب الجيش الملكي النيبالي من العينات التي هي Cre + أو Rpl22 - HA + وحدها. لا يوجد فرق كبير بين Cre + و Rpl22-HA + عينة الجيش الملكي النيبالي الفعالية المنسدلة، مشيرا إلى أن العينات التي تفتقر إما كري أو Rpl22-HA هي ضوابط سلبية مناسبة. يشير "+" إلى أن الأليل أو الترانسجين المقابل كان موجودًا في هذه العينات وأن "-" تدل على عدم وجودها. الملكية الفكرية / المدخلات يمثل نسبة الحمض النووي الريبي المنافي (الملكية الفكرية) على مجموع (المدخلات) RNA. القيمة المحسوبة من التركيز في النانوغرام. ** يشير إلى p < 0025. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير الكواشف نجاح البروتوكول. (أ)فلاش الأنسجة المجمدة النتائج في كفاءة الهطول المناعي مماثلة لتلك التي من الأنسجة الطازجة. (ب)تم تحديد كفاءة الملكية الفكرية لاثنين من الأجسام المضادة التجارية، والمعينة كأجسام مضادة 1 والأجسام المضادة 2(جدول المواد). عند اختبارها ، كان الجسم المضاد 1 أكثر كفاءة في سحب الحمض النووي الريبي من الجسم المضاد 2 الذي يبدو أنه غير قادر على التمييز بين السلبية (عدم التعبير عن الـ Cre أو Rpl22-HA +) والضوابط الإيجابية (التي تعبر عن كل من Cre و Rpl22-HA + ). النقاط التي تدل على نسبة الحمض النووي الريبي الـIPed مقابل المدخلات ليكرر اتّحادي. (C)عندما تم مقارنة مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي(جدول المواد)، كيت 2 تفوقت بشكل كبير كيت 1. على الرغم من أن كلا المجموعتين IPed كمية مماثلة من الحمض النووي الريبي من الضوابط السلبية، كيت 2 أدى إلى ارتفاع كبير في غلة الجيش الملكي النيبالي من عينات إيجابية. * يشير إلى p < 0.05، ** p < 0.025، *** p < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تطبيق الأسلوب على نموذج متحول. (أ)عينة الجينات من الفائدة تأكيد النمط الجيني عن طريق النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة في المنزل مخصص ضد الجينات من البروتين الفائدة يوضح جين الفائدة-/- (M / M)الذكور تفشل في إنتاج البروتين المرتبطة بها. GAPDH يظهر كعنصر تحكم التحميل. (ب)إخراج محلل حيوي رسومي من مدخلات مقترنة وعينات IPed للعينات البرية والمتحولة. (C)مقارنة أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) حسب نوع العينة والنمط الجيني. (D)متوسط طول النيوكليوتيدات من أنواع الحمض النووي الريبي تحليلها من قبل محلل حيوي حسب نوع العينة والنمط الجيني. * يشير إلى p < 0.05، ** p < 0.025، *** p < 0.01، N.S. ليست كبيرة. N = 4 لكل نمط جيني. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مثال على تأكيد برنامج تشغيل Cre. القياس الكمي لجين ترجم في وقت مبكر في تطوير الخلايا الجرثومية(Stra8)واثنين من الجينات ترجمت في وقت متأخر من تطور الخلايا الجرثومية(Tnp1 وPrm1)تحليلها من قبل qRT-PCR من الحمض النووي الريبي منمناة من RPL22-HA مدفوعة من قبل اثنين من الخلايا الجرثومية المختلفة كريس، Stra8-iCre (أعرب في وقت مبكر في تطوير الخلايا الجرثومية) وHspa2-Cre (أعرب عنه في وقت لاحق في تطوير الخلايا الجرثومية ، وتحديدا بعد هنا ، يتم تحقيق HA -IP من Stra8 مع برنامج تشغيل الخلايا الجرثومية المبكرة ولكن ليس مع برنامج تشغيل الخلايا الجرثومية اللاحقة Cre مما يدل على خصوصية الخلية من التهطال. في المقابل ، يتم تحقيق HA -IP من النصوص المترجمة في الخلايا الجرثومية المتأخرة من قبل كل من Stra8-iCre و Hspa2-Cre. ومن المتوقع أن هذا الخلايا التي تعبر عن Stra8-iCre سوف تولد HA الموسومة RPL22 في جميع أنحاء تنميتها في حين أن أولئك الذين يعبرون عن Hspa2-Cre لن تفعل ذلك إلا خلال الأجزاء اللاحقة من تنميتها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
فهم الترجمة من نوع خلية معينة لا تقدر بثمن لفهم علم وظائف الأعضاء في الخلية بشكل أكثر دقة في الحالة العادية أو المتحولة. وينظر إلى فائدة خاصة في النظم حيث يتم فصل الترجمة من النسخ، كما هو الحال في الأنسجة العصبية حيث تحدث الترجمة بعيدا جدا عن النسخ، أو في الخلايا الجرثومية حيث يحدث النسخ قبل وقت طويل من الترجمة. نسبة إلى أساليب أخرى لتحليل الترجمة ، فإن أكبر ميزة لنظام RiboTag تأتي من استخدام نظام Rere recombinase. وهذا يسمح بحرية استهداف أي مجموعة خلايا لديها برنامج تشغيل Cre ذات الصلة. ثانياً، إن IP RiboTag كما هو موضح هنا فعال وأقل تحدياً من الناحية التقنية ويستغرق وقتاً طويلاً من التنميط المتعدد أو الريبوسوم. وأخيرا، يمكن أن ينفذ ريبوتاغ IP بسهولة في مقاعد البدلاء.
هناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. ومن أهمها إنشاء خط الماوس ريبوتاغ وتوليد الحيوانات التجريبية للدراسة. أما بالنسبة لجميع النماذج الوراثية ، ينبغي تطبيق تتبع دقيق للأفراد داخل مستعمرة الماوس وكذلك بروتوكولات الجينية الدقيقة. يجب أن يتضمن PCR genotyping حسب Sanz et al. المبادئ التمهيدية التي تستهدف موقع loxP 5 ' من exon 4 من النمط البري للتمييز بين alleles النمط البري (260 bp) ومتحولة (290 bp)13. بالنسبة لحالة تحليل RiboTag في نماذج الخلايا الجرثومية ، يجب الالتزام بمتطلبات تربية محددة للغاية. أولاً، في حالة المسوخ التي تؤدي إلى العقم، ينبغي أن تتضمن استراتيجيات التربية المدروسة أساليب لتحسين عدد النسل الذي يحتوي على النمط الجيني المطلوب في الأجيال المتوسطة والتجريبية. ثانيا ، في حالة الخلاياالجرثومية محددة كريس ، ينبغي توخي الحذر بشأن الكري- zygosity نظرا لحساسية الخلايا الجرثومية لسمية الكري. في الخلية الجرثومية ، يمكن أن يكون لمستويات عالية من بروتين الكري آثار ضارة22، تحظر استخدام الحيوانات Cre / Cre في مخطط التربية. وأخيرا، عند استخدام الخلية الجرثومية Cres، من المهم عزل أليل RiboTag من الكري حتى الجيل الأخير كتعبير كري في الخلية الجرثومية من جيل وسيطة سيؤدي إلى ذرية التعبير Rpl22-HA على الصعيد العالمي.
بغض النظر عن نظام الخلية، يمكن التحقق من متانة كل من التعبير والتحديد. يمكن تحديد التعبير السليم لـ Cre وختان Rpl22-HA المتوقع باستخدام طرق متعددة. في الأول ، يمكن تلطيخ الأنسجة المعزولة عن الحيوانات التجريبية لHA باستخدام إما الكيمياء المناعية أو الفلورة المناعية15. هذه الطريقة هي الأمثل من حيث أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من mRNAs المترجمة في أنواع الخلايا المستهدفة. الطريقة الثانية ، مثال على ذلك هو موضح في الشكل 6، يتطلب بعض المعرفة من الرسائل المنظمة ترجمة في أنواع الخلايا المستهدفة. في هذه الطريقة، يمكن تأكيد الإثراء لمرنا الخاضعة للترجمة المعروفة من برنامج تشغيل Cre-driverالمحدد باستخدام PCR الكمي من IPed مقابل RNA المدخل. وبالمثل، يمكن تأكيد التعبير Rpl22-HA قوية من خلال مقارنة عينات Cre +/Rpl22+ (الضوابط الإيجابية) مع إما Cre-/Rpl22+ أو Cre+/Rpl22-العينات التي تعمل كعناصر تحكم سلبية فعالة (انظر الشكل 3). ويمكن لهذه المقارنات إما القيام بها على مجموع الحمض النووي الريبي IPed أو التخصيب لمرنا منظمة ترجمة معروفة تقييمها من قبل qRT-PCR أو بعض الأسلوب الكمي الأخرى.
المشاكل الشائعة في تنفيذ البروتوكول تميل إلى أن تصبح واضحة فقط عندما يكون العائد الحمض النووي الريبي منخفضة بشكل غير متوقع أو عالية. السبب الأكثر شيوعا لهذه الإخفاقات تنشأ من الجينوية غير صحيحة من الأفراد. نوصي بالاحتفاظ بأنسجة إضافية من العينات التي تم جمعها لتأكيد الأنماط الجينية لجميع العينات في حالة غلة الحمض النووي الريبي غير المتوقعة. وبمجرد التأكد من ذلك، ينبغي النظر في إمكانيات أخرى تشمل إمكانية تلوث RNase أو تحلل العينات. يمكن تخزين العينة بعناية والتعامل مع وصيانة المناطق الحرة RNase داخل المختبر إلى حد كبير أو القضاء على هذه القضايا. على الرغم من أن قضايا العزل الجيش الملكي النيبالي هي مشكلة أخرى محتملة في هذا البروتوكول، فإن استخدام مجموعات التجارية يقلل كثيرا من هذه المسألة على الرغم من أنه ينبغي الحرص على ضمان الحفاظ عليها كما RNase الحرة وتحتوي على أي حلول منتهية الصلاحية. وأخيراً، وكما هو الحال مع جميع الإجراءات القائمة على الأجسام المضادة، فإن الاختلافات في الكثير، وظروف التخزين، والتركيز، أو حتى الشحن لها القدرة على التأثير سلباً على جودة الجسم المضاد والنجاح اللاحق للسحب. ونتيجة لذلك، وبعد إجراء اختبارات دقيقة ومتكررة، اخترنا الأجسام المضادة الأكثر اتساقًا وكفاءة المتاحة.
يحتوي هذا البروتوكول على تعديلين رئيسيين بالنسبة لبروتوكولات RiboTag المنشورة الأخرى التي تعزز بشكل كبير احتمال النجاح. واحد هو القدرة على استخدام الأنسجة المجمدة فلاش، وبالتالي التخفيف من أي قضايا تنطوي على الكثير، فني، أو الاختلافات تشغيل التقنية. يمكن جمع العينات وتخزينها مما يسمح بعزل HA-ribosomes من جميع العينات في وقت واحد ، مما يقلل مما قد يكون مصادر رئيسية للاختلاف. ثانياً، إن إضافة الخطوة الواضحة مسبقاً تقلل إلى حد كبير من نوع الخلفية التي أبلغ عنها المستخدمون الآخرون لنظام ريبوتاغ. في الآونة الأخيرة ، يشير تقرير بروتوكول من قبل سانز وآخرون إلى وجود خلفية عالية بسبب وفرة النصوص المرتبطة بالريبوسوسوم من الخلايا غير الموجهة إلىCre14. لدينا بروتوكول العلاجات هذه المسألة عن طريق تضمين خطوة preclearing ، والقضاء على نحو فعال وجود الجيش الملكي النيبالي في عينات الملكية الفكرية السلبية Cre.
ومثل جميع النظم، ينبغي أن توضع في الاعتبار القيود المتأصلة في نظام ريبوتاغ. عند استخدام برامج تشغيل الـ Cre غير المحددة، يجب إجراء تحليل التعبير قبل إنتاج العينات التجريبية. ومن منظور الترجمة، ينبغي ملاحظة عدة فروق دقيقة في هذه الطريقة. أولاً، لا يسمح RiboTag بالتفريق بين mRNAs التي تستعد للترجمة وتلك التي تترجم بنشاط. وعلى هذا النحو، فإن الأساليب الحالية القائمة على الريبوتاغ لا تسمح بتقدير كفاءة الترجمة كدالة لفرادى المواد المتعددة الرنانة والمواد الرنانة. إذا كانت كفاءة الترجمة ذات أهمية، يمكن قياسها على أساس خاص بالخلية إذا تم دمج طريقة RiboTag مع أدوات تحليل الترجمة الأخرى مثل التنميط المتعدد. ثانياً، من الأساسي أن تؤخذ في الاعتبار إجمالي التغيرات في وفرة الحمض النووي الريبي الناجمة عن التباين الفردي أو الجيني المعتمد. ولهذا السبب فإن العزلالدقيق للحمض النووي الريبي المصاحب للحمض النووي الريبي المدخلات وتبقى العينات المستمدة من كل منها مقترنة في جميع التحليلات النهائية. وأخيراً، وفيما يتعلق بالتحليل القائم على الريبوتاغ، ينبغي أن نتذكر أن الارتباط بالريبوسوم لا يثبت بالضرورة أن الترجمة تحدث. وينبغي إجراء أساليب ثانوية للتحليل لتأكيد التنظيم الترجمي في الأهداف ذات الاهتمام.
يصف هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوسوم من الخلايا الجرثومية للفئران الذكور باستخدام نموذج RiboTag. لا المحاسبة لتربية الفئران وجمع العينات ، والبروتوكول يستغرق يومين ، مع ثلاث ساعات في اليوم الأول ، وأفضل القيام به في فترة ما بعد الظهر ، وحضانة بين عشية وضحاها ، تليها خمس ساعات من العمل في الصباح التالي. ويوصى بشدة أن إعداد حلول الأسهم (HB وHSWB) وكذلك طحن الأنسجة أن يتم مقدما. يعتمد النجاح العام للبروتوكول على الطباعة الجينية الصحيحة والظروف الخالية من RNase بشكل صارم. وتسمح القدرة على فحص الترجمة لأنواع معينة من الخلايا الدراسات المستقبلية لفهم أفضل للعلاقة بين النسخ والترجمة والبروتيوم في أنواع الخلايا لا تعد ولا تحصى والخلفيات المتحولة.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة NICHD R00HD083521 إلى EMS والدعم الداخلي من جامعة روتجرز إلى EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
