Summary
Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.
Abstract
La cuantificación de las diferencias en la abundancia de ARNm es un enfoque clásico para entender el impacto de una mutación genética dada en la fisiología celular. Sin embargo, caracterizar las diferencias en el translatome (la totalidad de los ARNM traducidos) proporciona una capa adicional de información particularmente útil cuando se trata de entender la función del ARN que regula o une proteínas. Se han desarrollado una serie de métodos para lograr esto, incluyendo perfiles ribosomas y análisis de polisoma. Sin embargo, ambos métodos conllevan desafíos técnicos significativos y no se pueden aplicar a poblaciones celulares específicas dentro de un tejido a menos que se combinen con métodos de clasificación adicionales. Por el contrario, el método RiboTag es una alternativa basada en la genética, eficiente y técnicamente sencilla que permite la identificación de ARN asociados ribosoma de poblaciones celulares específicas sin pasos de clasificación adicionales, siempre que esté disponible un controlador Cre específico para células aplicable. Este método consiste en la cría para generar los modelos genéticos, la recolección de muestras, la inmunoprecipitación y los análisis de ARN aguas abajo. Aquí, delineamos este proceso en células germinales de ratón macho adulto mutante para una proteína de unión al ARN necesaria para la fertilidad masculina. Se presta especial atención a las consideraciones para la cría con un enfoque en el manejo eficiente de las colonias y la generación de antecedentes genéticos correctos y la inmunoprecipitación con el fin de reducir el fondo y optimizar la producción. También se incluye una explicación sobre las opciones de solución de problemas, experimentos confirmatorios adicionales y posibles aplicaciones posteriores. Las herramientas genéticas y los protocolos moleculares presentados representan una forma poderosa de describir los ARN asociados al ribososo de poblaciones celulares específicas en tejidos complejos o en sistemas con almacenamiento y traducción de ARNm aberrantes con el objetivo de informar sobre los factores moleculares de los fenotipos mutantes.
Introduction
El análisis de la abundancia de ARN de una célula o tejido, según lo examinado por microarray o secuenciación de ARN, ha demostrado ser una poderosa herramienta para entender los factores moleculares de los fenotipos mutantes. Sin embargo, estas herramientas de análisis relativamente incompletas pueden no informar sobre la fisiología o el proteome de la célula, especialmente en sistemas donde muchos ARNm se almacenan antes de la traducción, como las células neuronales y germinales. En estos sistemas, definir la población de ARNm que se traduce activamente en proteína, o el traducción de la célula, puede ser un mejor indicador del estado fisiológico real de la célula1,2. Por ejemplo, las células germinales en varias etapas de desarrollo transcriben los ARN que se almacenan para su posterior traducción, impulsados por el desarrollo3 o las señales de señalización4. Este proceso se ejemplifica con las protaminas de codificación mRNAs, en las que la transcripción del ARNm es detectable días antes de que la proteína se haga1,2,5,6. Del mismo modo, las células neurales transcriben el ARN en el núcleo y lo transportan por el axón, como es el caso de la actina7. Además de estos sistemas celulares especializados, es poco probable que los transcriptomas de estado estacionario sean informativos en modelos donde se ve afectado el almacenamiento de ARN, la biogénesis ribosoma o la traducción de ARNm. Múltiples otros factores también pueden afectar la acumulación de ARN de estado estacionario de una célula incluyen la descomposición del ARNm y la actividad de las proteínas de unión al ARN. En estos casos, es más probable que las herramientas robustas para analizar ARN o ARNm asociados a ribosomas bajo traducción activa produzcan resultados biológicamente relevantes.
Con ese fin, se han desarrollado varios métodos para identificar mensajes asociados al ribosoma o traducidos activamente. La generación de perfiles de polisoma, que proporciona una instantánea de las transcripciones asociadas al ribososoma, se ha utilizado durante muchas décadas para aislar los ARN intactos asociados con subunidades ribosomales o complejos mono-, di-y poli-ribosoma3. Brevemente, los lysaanos de celda recogidos se aplican a un gradiente de sacarosa lineal y se centrifugan como alta velocidad, lo que resulta en la separación de las subunidades ribosomas, ribosomas intactos y polisomas por tamaño. Tradicionalmente, esta técnica se ha aplicado para estudiar uno o algunos ARNM, pero recientemente este método se ha combinado con estudios de ARN-seq para dilucidar la función de los reguladores traslacionales potenciales8,9 Mientras que una manera poderosa de diferenciar entre traducir activamente y no traducir arNM10,el perfilado de polisomas requiere métodos que consumen mucho tiempo (fraccionamiento de gradiente y ultracentrifugar) y puede requerir una buena parte de la toma de muestras poblaciones desafiantes.
Un enfoque alternativo al examen del translatome es la elaboración de perfiles ribosomasomas, que identifica las partes de las transcripciones directamente asociadas con el ribosoma. En resumen, los fragmentos de ARN asociados ribosoma se generan a través del ensayo de protección RNase, los complejos ribosomaindividuales individuales separados a través de gradiente de sacarosa y los fragmentos de ARN asociados aislados y convertidos en etiquetas de ARN-seq susceptibles de secuenciación profunda11. Uno de los principales beneficios para el perfilado ribosoma es la capacidad de determinar las ubicaciones específicas de los ribosomas en el momento del aislamiento que permite la identificación de los sitios de inicio de traducción, el cálculo de la ocupación y distribución ribosomal, y la identificación de los establos ribosomas12. Sin embargo, este método tiene varios inconvenientes inherentes, incluyendo las necesidades de equipos (fraccionador de gradiente y ultracentrifuge), un protocolo relativamente complejo que requiere una solución de problemas extensa, y problemas computacionales no manejados fácilmente por el usuario inexperto11. Es importante destacar que el perfilado de ribosoma se aplica principalmente a células aisladas en el cultivo y requiere material sustancial, haciendo su aplicación a tejidos de tipo celular mezclados o células ordenadas a partir de in vivo limitado.
El método RiboTag de mamíferos, desarrollado por Sanz et al. en 200913, elimina una serie de cuestiones inherentes al perfil de polisome y ribosoma. En este método, los ARN asociados al ribosoma se pueden aislar de tipos específicos de células que permiten la investigación de traduccións específicas de tipo celular en tejidos complejos sin técnicas de aislamiento adicionales y equipos especializados, como es necesario en otros métodos13,14. La base del método RiboTag es un modelo de ratón transgénico (RiboTag) que lleva un locus modificado para el gen de proteína de subunidad ribosomal 60S Rpl22. Este locus (Rpl22-HA) incluye un exón terminal floxed seguido de una copia adicional del exón terminal modificado para incluir una etiqueta de hemaglutinina C-terminal (HA) dentro de la región de codificación. Cuando se cruza a un ratón que expresa una Cre Recombinase específica de la celda, el exón floxed se elimina permitiendo la expresión de RPL22 etiquetado HA de una manera específica de la celda (Figura 1). La etiqueta HA se puede utilizar para inmunoprecipitar ribosomas (IP) y sus ARN asociados del tipo de célula seleccionado.
Además de la publicación inicial que desarrolló la técnica, varios otros laboratorios han utilizado el modelo RiboTag. Se han perfilado y estudiado diversos tejidos como las células sertoli y Leydig15,microglia16,neuronas17,18,ovocitos19y células cultivadas20. Aunque este protocolo es claramente capaz de aislar con éxito ribosomas y los ARN asociados a través de diversos tipos de tejidos todavía hay áreas que necesitan mejoras, especialmente cuando se aplica a los sistemas mutantes. En particular, la dependencia común del tejido fresco da lugar a una mayor variación técnica que puede reducir en gran medida la potencia del análisis. En segundo lugar, la identificación segura de los objetivos traducidos diferencialmente se hace más difícil cuando se producen altos antecedentes de inmunoprecipitación a partir de tipos de células no combinadasde Cre, como se informó anteriormente13. Mientras que Sanz y otros diseñaron la premisa básica de la técnica, en este manuscrito el laboratorio Snyder presenta la optimización del protocolo para reducir estas preocupaciones, haciendo que el método sea más práctico y eficiente.
La intención de este artículo es explicar los pasos para la cría de ratones que expresan ribosomas etiquetados con HA específicos de las células, inmunopreciando estos ribosomas a partir de muestras congeladas y purificando sus ARN asociados para análisis posteriores. Como la célula germinal masculina de los mamíferos y la mutación de infertilidad estudiada proporcionan desafíos únicos, se han hecho esfuerzos para iluminar las formas en que esta técnica se puede adaptar a otros sistemas celulares.
Protocol
Todas las prácticas de uso y manejo de animales han sido aprobadas por el Comité Interno de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de la Universidad rutgers.
1. Crianza de ratones
- Criar ratones hembra homocigotos para una mutación de proteína de unión al ARN que conduce a la infertilidad masculina (manuscrito en preparación, referido en el presente documento como el gen de interés) en apareamientos de trío a machos hemizygous para el alelo Stra8-iCre (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre+), ya que el emparejamiento de dos hembras con cada macho aumenta la eficiencia dereproducción.
NOTA: El gen mutante de interés (M) fue aprobado maternalmente, ya que las hembras homocigotos para M tienen fertilidad normal. Esto tiene el beneficio adicional de permitir la transmisión paterna de la célula germinal masculina Cre (hemizygous), como se recomienda21 y optimizar el porcentaje de descendencia con la combinación alélica deseada. Debido a que los Cres homocigotos exhiben toxicidad de células germinales22, se recomienda que el alelo se mantenga y pase en un estado heterocigoto o hemizygous. Es importante destacar que la expresión Cre no debe coexistir con el alelo Rpl22-HA hasta la población experimental. Si no se aísla el alelo Rpl22-HA de Cre en animales reproductores, se producirán crías que expresan a nivel mundial Rpl22-HA debido a la actividad de Cre de células germinales. Este problema es específico de la célula germinal. Además, el Stra8-iCre es específico de la población celular de los autores de interés22,apuntando a las células que pasan a y muy temprano en la meiosis, incluyendo preleptotenos y leptotenos. En su lugar, se puede utilizar un controlador Cre diferente específico para otro tipo de actividad. La práctica común dicta que la célula germinal masculina expresó que Cres se transmite en el lado paterno. Sin embargo, es posible que la transmisión materna del Stra8-iCre resulte en una expresión transgénica similar en la descendencia masculina. Independientemente del esquema de cría seleccionado, con el fin de generar descendencia con expresión Cre equivalente, todas las muestras experimentales deben generarse a través de la transmisión Cre desde el mismo lado parental (ya sea siempre materna o siempre paterna). - Cachorros masculinos resultantes del genotipo como se describe en la sección 2.4. Seleccione aquellos que lleven el alelo M y positivos para Cre (+/M:Cre+) para la cría aguas abajo.
- Criar ratones hembra homocigotos para el alelo M en apareamientos de trío a machos homocigotos para Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ).
NOTA: El fondo Rpl22-HA es altamente mezclado, por lo que se debe tener cuidado al evaluar fenotipos específicos de la cepa. - Cachorros hembra resultantes del genotipo para identificar a los que llevan el alelo M y positivos para Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (ver sección 2.3). Seleccione estas hembras para la cría aguas abajo.
- Cross +/M:Cre+ machos con +/M:Rpl22+ hembras en apareamientos de trío. Genotipo los cachorros resultantes (ver secciones 2.3 y 2.4) para identificar a los machos que son Cre+ y Rpl22+ y como wildtype o M/M.
NOTA: Como este trabajo se centra en una mutación que resulta en una infertilidad masculina completa, se han tomado consideraciones especiales en el esquema de reproducción para obtener de manera más eficiente los genotipos experimentales deseados. Tales consideraciones pueden ser innecesarias en otros modelos experimentales. Consulte la Figura 2 para obtener un esquema de cría completo y una leyenda que lo acompaña para obtener más información sobre las consideraciones de reproducción.
2. Recogida de muestras
- Recoger los testículos de ratones machos a los 21 días después del parto (dpp).
- Sacrificar ratones por inhalación deCO2 seguida de luxación cervical. Hacer una incisión ventral (3 cm) en cada animal flanqueado por dos incisiones laterales más cortas (2 cm cada una), conectadas. Tire de la piel y del peritoneo hacia atrás para revelar los testículos.
- Usando fórceps, tire de la almohadilla de grasa epidimal de un lado de la cavidad corporal para revelar el epidídimo y los testículos. Con tijeras de tenotomía, extirpar los testículos, teniendo cuidado de recortar el epidídilo, la grasa circundante, y cualquier vasculatura externa. Coloque los testículos intactos en un tubo limpio de 1,7 ml.
- Repita con otro lado, añadiendo los segundos testículos al primer tubo. Tapar este tubo e inmediatamente sumergirlo en nitrógeno líquido para congelarlo.
NOTA: Las muestras se pueden conservar a -80 oC hasta su uso.
- Recoger muestras adicionales de punta de cola para cada animal (2 mm) para la confirmación del genotipado.
- Para extraer el ADN, añadir 100 ml de 50 mM de NaOH a una punta de cola de 2 mm en un tubo de 1,7 ml y hervir a 95 oC durante 30 min. Añadir 100 ml de 50 mM de HCl y 20 ml de 1 M Tris-HCl pH 8.0 y centrifugar durante 3 muestras mínimas a 10.000 x g. Conservar el sobrenadante (que contiene ADN genómico) y almacenar el ADN extraído a 4 oC hasta que se utilice como plantilla para las siguientes reacciones de genotipado.
- Realizar el genotipado Rpl22-HA siguiendo un método adaptado de Sanz et al.13 utilizando los siguientes cebadores: adelante: 5' GGGAGGCTTGCTGGATG 3'; reverso: 5' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3'.
- Preparar una mezcla de reacción que consista en 2 ml de ADN extraído en el paso 2.2.1, 0,08 l de dNTPs de 25 mM, 0,1 l de imprimación delantera de 10 mM, 0,1 ml de imprimación inversa de 10 mM, 2 ml de un tampón de reacción en cadena de polimerasa (PCR) (650 mM Tris pH a 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2y 0,1% Tween), 0,2 ml de polimerasa Taq y H2O sin nucleasa a un volumen total de 20 ol.
- Utilice las siguientes condiciones termociclas: un paso de fusión de imprimación de 30 s a 95 oC, un recocido de 30 s a 64 oC y un alargamiento de 30 s a 72 oC, repetido 37 veces con un alargamiento final de 5 minutos a 72 oC.
NOTA: Esto produjo un tamaño de producto de 260 bp para muestras de tipo silvestre y 292 bp para muestras que eran Rpl22-HA+
- Realizar el genotipado De Cre utilizando los siguientes imprimadores: adelante: 5' GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; reverso: 5' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3'. Prepare la reacción PCR como se describe en el paso 2.3.2 utilizando los imprimadores Cre en sulugar. Utilice las siguientes condiciones termociclas: un paso de fusión de imprimación de 30 s a 95 oC, un recocido de 30 s a 60 oC y un alargamiento de 15 s a 72 oC, repetido 35 veces con un alargamiento final de 5 minutos a 72 oC.
- Llevar a cabo el genotipado del gen de interés como es estándar para el gen en cuestión.
NOTA: El protocolo de genotipado del autor utiliza un Taqpersonalizado concentrado, y como tal, otros usuarios pueden tener que modificar las condiciones para adaptarse a sus requisitos enzimáticos. Con el fin de comprender mejor el impacto de la pérdida de este gen de interés en la traducción, los machos que eran de tipo salvaje o homocigotos para el alelo mutante de interés y que también eran Cre+ y Rpl22+ fueron seleccionados para ser las muestras experimentales. La selección del genotipo se describe más arriba en la sección 1.
3. Preparación de soluciones
NOTA: La preparación de soluciones y todos los pasos posteriores deben realizarse en condiciones estrictas.
- Para preparar el tampón de homogeneización (HB), añadir 2,5 ml de 1 M Tris pH 7,4, 5 ml de 1 M KCl, 600 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de NP-40 a un tubo de 50 ml. Llevar al volumen (50 mL) en pirocarbonato dietílico (DEPC) H2O y mezclar hasta que se incorporen todos los componentes.
NOTA: Las concentraciones finales serán las siguientes: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2y 1% NP-40. - Para preparar tampón de lavado de sal alto (HSWB), añadir 2,5 ml de 1 M Tris pH 7,4, 15 ml de 1 M KCl, 600 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de NP-40 a un tubo de 50 ml. Lleve al volumen (50 mL) en DEPC H2O y mezcle hasta que se incorporen todos los componentes.
NOTA: Las concentraciones finales serán las siguientes: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2y 1% NP-40El protocolo se puede pausar aquí, y las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.
4. Preparación del tejido
- Prepesar todos los tubos de muestra, peso de registro y preenfriamiento en nitrógeno líquido.
- Preenfríe el mortero estéril, el pestillo y la espátula de pesaje sobre hielo seco.
- Moler muestras de tejido congelado sin flash en un polvo fino utilizando un mortero preenfriado y estéril y un pestillo sobre hielo seco.
- Coloque el tejido congelado en el mortero preenfriado sobre hielo seco. Rompe suavemente el tejido en trozos grandes usando peste y muele lentamente hasta que el tejido sea un polvo fino.
NOTA: Aunque también se puede utilizar tejido fresco, según el protocolo original13, no se observa ninguna diferencia significativa en el resultado con el uso de tejidos congelados. Consulte Resultados representativos y discusión para obtener más información. - Transfiera cuidadosamente la muestra molida al tubo de recogida preenfriado raspando polvo de mortero utilizando espátula preenfriada. Asegúrese de que sólo se recoja el tejido y que no se deposite humedad en el mortero frío.
- Pesar el tubo con tejido, teniendo cuidado de mantener el hielo seco siempre que sea posible. Calcular la masa de tejido restando el peso inicial del tubo del peso del tubo con la muestra en él. Registre este valor para el cálculo posterior de volúmenes de búfer de lisis.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, y las muestras se pueden almacenar a -80 oC hasta su uso.
- Coloque el tejido congelado en el mortero preenfriado sobre hielo seco. Rompe suavemente el tejido en trozos grandes usando peste y muele lentamente hasta que el tejido sea un polvo fino.
5. Homogeneización de la muestra
- Preparar el tampón de lisis (10 ml de HB + suplementos) añadiendo 10 ml de ditiothreitol de 1 M (TDT), 1 comprimido inhibidor de la proteasa, 50 ml de inhibidor de la RNase (40.000 unidades/ml), 200 ml de 5 mg/ml de cicloheximida y 100 ml de heparina de 100 mg/ml a 10 ml de heparina a 10 ml de HB. Mezcle hasta que todos los componentes se incorporen y manténgalos en hielo hasta su uso.
NOTA: Las concentraciones finales de los suplementos en 10 ml de HB serán las siguientes: 1 mM de TDT, 200 U/ml de inhibidor de la rnalosa, 100 g/ml de cicloheximida y 1 mg/ml de heparina. Esta solución debe utilizarse dentro de las 24 horas de la adición de los suplementos y se puede mantener a 4 oC o en hielo hasta su uso. - Por cada 100 mg de la muestra, agregue 1 ml de tampón de lisis. Con la misma pipeta utilizada para agregar el tampón de lisis, pipetee cuidadosamente el lisado resultante hacia arriba y hacia abajo para fragmentar las células y mezclar. Continúe pipeteando hasta que la muestra deje de ser viscosa, generalmente de 25 a 30 trazos.
NOTA: Debido a que la solución es muy viscosa al principio, se debe utilizar una pipeta de gran diámetro para mezclar la solución. Un estándar de 1000 l es normalmente suficiente para 100 mg de tejido. - Ponga las muestras en hielo durante 10 minutos para licrear. A continuación, esgire muestras en una centrífuga preenfriada (4 oC) durante 10 min a 10.000 x g. Se debe formar un pellet grande, suelto y turbio en la parte inferior del tubo.
- Teniendo cuidado de no molestar el pellet, recoger el lysate en un nuevo tubo y volumen de registro para cada muestra. Para evitar la desgredataion de la muestra, asegúrese de que las muestras permanezcan frescas durante todo el protocolo restante, almacenándose en hielo o a 4oC siempre que sea posible.
6. Equilibrio de cuentas
- Utilizando el volumen de lisado del paso 5.2, calcule el volumen requerido de cuentas magnéticas acopladas a la proteína de unión de anticuerpos apropiada (en este caso, proteína G). Para 1 ml de lisato, utilice 375 ml de perlas proteicas G (30 mg/ml).
NOTA: La elección de las perlas conjugadas variará con el anticuerpo anti-HA utilizado; por ejemplo, si se selecciona un anticuerpo anti-HA generado por conejo, las cuentas de proteína A serán preferibles. - Con un bastidor de tubo magnético, retire el disolvente de cuentas y agregue el mismo volumen de tampón de lisis fresca a las perlas. Girar 5 min a 4oC para lavar. Realice todos los pasos de rotación utilizando un rotador de tubo de sobremesa ajustado a 20 rpm.
- Coloque el tubo en el bastidor del tubo magnético y retire el tampón de lavado.
- Repita los pasos 6.1 a 6.3 dos veces más.
- Agregue el búfer de lisis en el volumen original a los perlas equilibradas. Conservar a 4oC o sobre hielo hasta su uso.
7. Muestra de preclearing
- Añadir 50 l de perlas equilibradas por cada 1 ml de lisado a sobrenadante de muestra de lysed (lisado) y girar a 4 oC durante 1 h.
- Coloque el tubo en el estante del imán y recoja el lysate en un tubo nuevo. Deseche las cuentas usadas.
- Al lisado añadir 25 éL de perlas equilibradas por cada 1 ml y rotar a 4 oC durante 1 h. Almacenar las cuentas G de proteína equilibrada restantes a 4 oC durante la noche.
- Coloque el tubo en el estante del imán y recoja el lisado en un tubo nuevo. Deseche las cuentas usadas. Desde el lisado despejado, conserve 50 s para actuar como control de entrada de muestra. Conservar a -80oC.
NOTA: La muestra de entrada actúa como un control que representa la población total de ARN de la muestra, incluidos los ARN asociados con otros tipos de células en el tejido, que se utilizará durante los análisis posteriores para corregir los cambios en la expresión génica en función de la mutación.
8. Incubación de anticuerpos
- Por cada 1 ml de lisato despejado, añadir 5 g de anticuerpo anti-HA. Para evitar la pérdida de muestra, selle la tapa del tubo con película de laboratorio. Gire las muestras de 16 a 18 h a 4 oC.
NOTA: No se ha optimizado el tiempo de incubación y la concentración de anticuerpos. Los autores encontraron que una incubación durante la noche con 5 g era suficiente; sin embargo, es posible que una incubación más corta o menos anticuerpos sea adecuada, o que una incubación más larga o más anticuerpos mejoren la unión.
9. Incubación de cuentas
- Por cada 1 ml de lisato transparente, añadir 300 ml de cuentas de proteína G. Vuelva a sellar la tapa del tubo con película de laboratorio y gire durante 2 h a 4 oC.
10. Lavado de perlas
- Coloque el tubo de muestra en el bastidor del imán para permitir que las perlas se separen del lisado IPed. Pipetear el lisado de flujo y desechar, conservando las perlas.
- Aplicar 800 s de HSWB a las perlas y dejar girar durante 10 minutos a 4 oC. Coloque el tubo de muestra en el estante del imán y deje que las perlas se separen del lavado. Retire y deseche el lavado.
- Aplique otros 800 l de HSWB a las perlas. Cierre la muestra y deje girar durante 5 minutos a 4 oC. Coloque el tubo de muestra en el estante del imán y deje que las perlas se separen del lavado. Retire y deseche el lavado.
- Repita el paso 10.3 una vez más.
11. Extracción de ARN
- Coloque el tubo de muestra en el estante del imán y deje que las perlas se separen del lavado. Pipetear y desechar el lavado, reteniendo las perlas para la extracción de ARN. Añadir 3,5 l de beta-mercaptoetanol de 14,2 M (bME) a las perlas y mezclar mediante vórtice durante 15 s.
- Extraiga el ARN utilizando un kit de purificación de ARN comercial, según las instrucciones del fabricante. Muestra de eluto en 30 l de RNase libre H2O.
NOTA: Aunque el tratamiento dNase de 10 ml/muestra es opcional para la mayoría de los kits, se recomienda encarecidamente. Este paso de limpieza opcional reduce significativamente el fondo, lo que permite una concentración final más precisa. Se recomienda encarecidamente utilizar un kit que contenga beta-mercaptoetanol (bME) en el tampón de lisis. bME actúa como un inhibidor adicional de la RNase para prevenir la degradación de la muestra durante el aislamiento del ARN. - Almacene la muestra a -80 oC o analice inmediatamente.
12. Cuantificación y análisis de muestras
- Utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, cuantifique la concentración de ARN y la calidad preliminar.
- Analizar la calidad del ARN extraído de las muestras a través de un bioanalizador.
NOTA: El ARN resultante se puede utilizar para la secuenciación de ARN u otros análisis aguas abajo, como la hincha de norte o la PCR cuantitativa de transcripción inversa (qRT-PCR).
Representative Results
Informes anteriores han sugerido inmunoprecipitación no específica de células que carecen de Cre14. Para determinar si este fue el caso en nuestro protocolo modificado, la eficiencia de la P.I. se determinó en muestras derivadas de animales que transportaban tanto Cre y Rpl22-HA como animales que transportaban sólo uno pero no el otro con la expectativa de que sin un Cre-driver y Rpl22-HA,el ARN inmunoprecipitado debería ser mínimo. Como se muestra en la Figura 3,muy poco ARN se aísla de muestras que carecen de Cre o Rpl22-HA que demuestran la eficacia de este protocolo para reducir el fondo IP y aislar ARN ribosomas genuinos etiquetados con HA. Además, tanto las muestras Cre-como Rpl22-HA-only representan controles negativos adecuados.
Dada la posibilidad de que la fuente de reactivos afecte significativamente a la eficiencia de la P.I., se probaron una serie de anticuerpos y protocolos de aislamiento de ARN(Figura 4) en muestras positivas De Cre y Rpl22-HA. Estos resultados demuestran que la selección de reactivos puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la P.I., por lo que cualquier cambio en la selección de reactivos debe realizarse con cuidado.
Para probar este protocolo en el contexto de una proteína de unión al ARN mutante, wildtype-Cre+Rpl22-HA+ (tipo salvaje) y gen de interés-/--Cre+Rpl22-HA+ (Gene de interés-/-) se examinaron los testículos para la eficacia del sistema RiboTag para aislar el ARN asociado ribosoma ( Figura5). Cuando se comparó la concentración de ARN de la entrada de tipo silvestre y la p.i. con la entrada Gene of interest-/- y la IP, no se vio ninguna diferencia significativa entre los genotipos. Para ambos genotipos, sin embargo, la concentración de entrada fue significativamente mayor que la concentración de IP, lo que indica que había más ARN en la muestra de entrada(Figura 5B). Este resultado se espera, ya que no todos los ARNm presentes en la célula están asociados con el ribosoma en un momento dado, especialmente en el caso de las células germinales donde los ARN pueden transcribirse mucho antes de que se traduzcan.
Con el fin de confirmar la calidad de las muestras de ARN enviadas para la secuenciación, se ejecutaron muestras en un bioanalizador. Los números de integridad del ARN (RIN), normalmente calculados como la relación de los picos de rRNA 28S y 18S, se compararon entre muestras. En las agrupaciones totales de ARN, se espera que los valores RIN estén cerca de 10 con un RIN más alto correlacionado con una mayor integridad y calidad de la muestra inferida. Si bien las muestras IP tenían un RIN más bajo que las entradas, los RIN seguían dentro de un rango aceptable y no dependían del genotipo de la muestra(Figura 5C). Los valores reducidos de RIN para las muestras IPed son probablemente el resultado de la degradación del ARN, aunque muy leve sin la disminución relativamente pequeña de la longitud media de los nucleótidos de los ARN analizados. Dada la longitud del protocolo y las temperaturas necesarias para la inmunoprecipitación se espera cierta degradación. También es posible que la longitud reducida de RIN y ARN sea una función de enriquecimiento para especies no-RRNA, como los ARNm.
Figura 1: El método RiboTag. La premisa del método es biológicamente simple. Un nuevo Exon 4 se inserta en la secuencia para el locus Rpl22 aguas abajo del Exon 4 original. En presencia de un conductor Cre, se cortan los sitios loxP a ambos lados del Exon 4 original, excising el exón floxed. El Exon 4 con etiqueta HA ahora se incorpora a Rpl22 mRNA, generando un HA etiquetado RPL22 en las células que expresan CRE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de reproducción de muestras para ratones RiboTag. Se muestra el esquema de cría utilizado para generar animales experimentales. Se utilizó un esquema de dos vertientes. En la generación 1, se establecieron dos conjuntos paralelos de tríos de criadores. Un lado combinaba el alelo de interés (transportado maternalmente ya que esta mutación específica resulta en infertilidad masculina) con el cre hemizygous y por otro combinando el alelo de interés, de nuevo llevado maternalmente, con Rpl22-HA. Luego, en la generación 2, los machos del primer maridaje que llevan el alelo de interés y el Cre se cruzan a la descendencia femenina del segundo emparejamiento que llevan el alelo de interés y Rpl22-HA. Los genotipos de la descendencia resultante son determinados, y los animales experimentalmente relevantes seleccionados (en este caso ya sea de tipo salvaje o mutante homocigoto que llevan los alelos Cre y Rpl22-HA). Es importante tener en cuenta para la célula germinal que expresa Cre-conductores, los alelos Cre y Rpl22-HA no deben reproducirse juntos hasta la generación experimental. La exposición del alelo Rpl22-HA a Cre expresado por células germinales en generaciones de cría impulsará la escisión de células germinales Rpl22-HA. Cualquier descendencia resultante expresará globalmente Rpl22-HA evitando así el aislamiento ribosoma específico de la célula. En el sistema descrito en el presente documento, un n a 4 por genotipo proporcionaba suficiente potencia estadística para los análisis posteriores. Se debe determinar el número de réplica biológica para cada sistema experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Confirmación de controles negativos. Las muestras que son Cre+ y Rpl22-HA+ muestran un desconexión de ARN más alto que las muestras que son Cre+ o Rpl22-HA+ solas. No hay diferencia significativa entre la eficacia de extracción de ARN de muestra Cre+ y Rpl22-HA+, lo que indica que las muestras que carecen de Cre o Rpl22-HA son controles negativos adecuados. Un "+" indica que el alelo o transgén correspondiente estaba presente en estas muestras y un "-" denota su ausencia. IP/entrada representa la relación entre ARN inmunoprecipitado (IP) sobre el ARN total (entrada). Valor calculado a partir de la concentración en nanogramos. ** indica p < 0025. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los reactivos afectan al éxito del protocolo. (A) El tejido congelado flash da como resultado una eficiencia de inmunoprecipitación similar a la del tejido fresco. (B) Se determinó la eficiencia de la P.I. para dos anticuerpos comerciales, designados como Anticuerpo 1 y Anticuerpo 2(Tabla de materiales). Cuando se probó, el Anticuerpo 1 fue más eficiente tirando del ARN que el Anticuerpo 2 que parecía ser incapaz de diferenciar entre negativo (no expresando Cre o Rpl22-HA+) y controles positivos (expresando tanto Cre como Rpl22-HA+). Puntos indicativos de la relación de ARN IPed versus entrada para réplicas biológicas individuales. (C) Cuando se compararon los kits de extracción de ARN(Tabla de materiales),el Kit 2 superó significativamente al Kit 1. Aunque ambos kits dieron una cantidad similar de ARN de los controles negativos, el Kit 2 resultó en un rendimiento de ARN significativamente mayor de muestras positivas. * indica p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aplicación del método a un modelo mutante. (A) Muestra de confirmación del genotipo de interés a través de la hincha occidental utilizando un anticuerpo interno personalizado contra el gen de la proteína de interés demuestra Gene de interés-/- (M/M) los machos no producen la proteína asociada. GAPDH se muestra como un control de carga. (B) Salida de bioanalizador gráfico de entradas emparejadas y muestras IPed para muestras de tipo salvaje y mutantes. (C) Comparación de números de integridad de ARN (RIN) por tipo de muestra y genotipo. (D) Longitud media de nucleótidos de las especies de ARN analizadas por bioanalizador por tipo de muestra y genotipo. * indica p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01, N.S. no significativo. N 4 por genotipo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplo de confirmación del controlador Cre. Cuantificación de un gen traducido al principio del desarrollo de células germinales (Stra8) y dos genes traducidos tarde en el desarrollo de células germinales (Tnp1 y Prm1) analizados por qRT-PCR de ARN inmunoprecipitado de RPL22-HA impulsado por dos células germinales diferentes Cres, Stra8-iCre (expresado temprano en el desarrollo de células germinales) y Hspa2-Cre (expresado más tarde en el desarrollo celular, específicamente después de Stra8). Aquí, HA-IP de Stra8 se logra con el controlador Cre de células germinales tempranas, pero no con el conductor Cre de células germinales posterior que demuestra la especificidad celular de la inmunoprecipitación. Por el contrario, HA-IP de transcripciones traducidas en células germinales tardías se logra tanto por Stra8-iCre como por Hspa2-Cre. Esto se espera ya que las celdas que expresan Stra8-iCre generarán RPL22 con etiqueta HA a lo largo de la totalidad de su desarrollo, mientras que aquellos que expresan Hspa2-Cre solo lo harán durante las partes posteriores de su desarrollo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Comprender el traducción de un tipo de célula en particular es invaluable para comprender con mayor precisión la fisiología de una célula en el estado normal o mutante. Se ve un beneficio especial en sistemas en los que la traducción se desacopla de la transcripción, como en el tejido neural, donde la traducción se produce muy lejos de la transcripción, o en las células germinales donde la transcripción se produce mucho antes de la traducción. En relación con otros métodos de análisis de traducción, la mayor ventaja del sistema RiboTag proviene del uso del sistema recombinaso Cre. Esto permite la libertad de dirigirse a cualquier población celular que tenga un conductor Cre relevante. En segundo lugar, la IP de RiboTag tal como se describe en el presente documento es eficaz y mucho menos difícil técnicamente y requiere mucho tiempo que la elaboración de perfiles de polisoma o ribosoma. Por último, RiboTag IP se puede realizar fácilmente en la mesa de trabajo.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. El principal de ellos es el establecimiento de la línea de ratón RiboTag y la generación de animales experimentales para el estudio. En cuanto a todos los modelos genéticos, se debe aplicar un seguimiento cuidadoso de los individuos dentro de la colonia de ratones, así como protocolos de genotipado cuidadosos. El genotipado de PCR según Sanz et al. debe incluir imprimaciones dirigidas al sitio loxP 5' del exón 4 de tipo salvaje para distinguir entre alelos de tipo salvaje (260 bp) y mutantes (290 bp)13. Para el caso del análisis de RiboTag en modelos de células germinales, deben cumplirse requisitos de reproducción muy específicos. En primer lugar, en el caso de los mutantes que resultan en infertilidad, las estrategias de reproducción reflexivas deben incluir métodos para optimizar el número de crías con el genotipo deseado en generaciones intermedias y experimentales. En segundo lugar, en el caso de Cresespecífico de células germinales , se debe tener cuidado con respecto a Cre-zygosity dada la sensibilidad de las células germinales a la toxicidad de Cre. En la célula germinal, altos niveles de proteína Cre pueden tener efectos nocivos22,lo que prohíbe el uso de animales Cre /Cre en el esquema de cría. Por último, cuando se utiliza la célula germinal Cres, es importante aislar el alelo RiboTag del Cre hasta que la generación final como cre expresión en la célula germinal de una generación intermedia dará lugar a la descendencia que expresa Rpl22-HA a nivel mundial.
Independientemente del sistema celular, una serie de controles recomendados son posibles para verificar la robustez de la expresión Cre y la especificidad. La expresión adecuada de su Cre y la escisión esperada de Rpl22-HA se pueden determinar utilizando múltiples métodos. En la primera, el tejido aislado de animales experimentales se puede teñir para HA utilizando inmunohistoquímica o inmunofluorescencia15. Este método es óptimo en el sentido de que no requiere ningún conocimiento a priori de los ARNM traducidos en los tipos de celda de destino. El segundo método, un ejemplo de los cuales se muestra en la figura 6, requiere cierto conocimiento de los mensajes regulados por traducción en los tipos de celda de destino. En este método, el enriquecimiento de un ARNm regulado por traducción conocido se puede confirmar desde el Cre-driver seleccionado utilizando PCR cuantitativo de IPed versus ARN de entrada. Del mismo modo, la expresión Rpl22-HA robusta se puede confirmar mediante la comparación de muestras Cre+/Rpl22+ (controles positivos) con muestras Cre-/Rpl22+ o Cre+/Rpl22- que actúan como controles negativos efectivos (véase la figura 3). Estas comparaciones pueden hacerse en el ARN IPed total o por enriquecimiento para un ARNm regulado por traducción conocido evaluado por qRT-PCR o algún otro método cuantitativo.
Los problemas comunes en la ejecución del protocolo tienden a hacerse evidentes sólo cuando el rendimiento del ARN es inesperadamente bajo o alto. La causa más común de estos fracasos surge de un genotipado incorrecto de individuos. Recomendamos retener tejido adicional de la muestra recogida para confirmar los genotipos de todas las muestras en caso de rendimientos inesperados de ARN. Una vez confirmada, se deben considerar otras posibilidades, incluida la posibilidad de contaminación por RNase o degradación de la muestra. El almacenamiento cuidadoso de muestras, la manipulación y el mantenimiento de las zonas francas de RNase dentro del laboratorio pueden reducir o eliminar en gran medida estos problemas. Aunque los problemas de aislamiento de ARN son otro problema potencial en este protocolo, el uso de kits comerciales reduce en gran medida este problema, aunque se debe tener cuidado de asegurarse de que se mantienen como libres de RNase y no contienen soluciones caducadas. Por último, al igual que con todos los procedimientos basados en anticuerpos, las variaciones en el lote, las condiciones de almacenamiento, la concentración o incluso el envío tienen el potencial de afectar negativamente la calidad del anticuerpo y el éxito posterior del derribo. Como resultado, después de pruebas cuidadosas y repetidas, elegimos el anticuerpo más consistente y eficiente disponible.
Este protocolo contiene dos modificaciones importantes en relación con otros protocolos RiboTag publicados que mejoran significativamente la probabilidad de éxito. Una es la capacidad de utilizar tejido congelado flash, mitigando así cualquier problema relacionado con variaciones de lote, técnico o carrera técnica. Las muestras se pueden recoger y almacenar permitiendo el aislamiento de HA-ribosomas de todas las muestras a la vez, reduciendo lo que pueden ser las principales fuentes de variación. En segundo lugar, la adición del paso preclear reduce sustancialmente el tipo de fondo reportado por otros usuarios del sistema RiboTag. Recientemente, un informe de protocolo de Sanz et al. indica la presencia de altos antecedentes debido a la abundancia de transcripciones asociadas al ribosomas de células no impulsadas porCre-14. Nuestro protocolo soluciona este problema mediante la inclusión de un paso de preclearing, eliminando eficazmente la presencia de ARN en las muestras IP negativas de Cre.
Al igual que todos los sistemas, las limitaciones inherentes del sistema RiboTag deben tenerse en cuenta. Cuando se utilizan controladores Cre no caracterizados, el análisis de la expresión debe realizarse antes de la producción experimental de la muestra. Desde la perspectiva de la traducción, deben tenerse en cuenta varios matices de este método. En primer lugar, RiboTag no permite la diferenciación entre los ARNm listos para traducir y los que se traducen activamente. Como tal, los métodos actuales basados en RiboTag no permiten la cuantificación de la eficiencia de la traducción en función de los ARNm individuales. Si la eficiencia de la traducción es de interés, se puede medir sobre una base específica de la celda si el método RiboTag se combina con otras herramientas de análisis de traducción, como la generación de perfiles de polisoma. En segundo lugar, es fundamental tener en cuenta los cambios totales en la abundancia de ARN derivados de la varianza individual o dependiente del genotipo. Es por esta razón que el aislamiento cuidadoso del ARN de entrada acompaña la inmunoprecipitación y las muestras derivadas de cada una permanecen emparejadas a lo largo de cualquier análisis posterior. Por último, y en lo que respecta al análisis basado en RiboTag, hay que recordar que la asociación con un ribosoma no necesariamente demuestra que se está produciendo la traducción. Deben realizarse métodos secundarios de análisis para confirmar la regulación traslacional en los objetivos de interés.
Este protocolo describe el aislamiento de ARN asociados a ribosomas de las células germinales de ratones machos utilizando el modelo RiboTag. Sin tener en cuenta la cría de ratones y la recolección de muestras, el protocolo tarda dos días, con tres horas el primer día, mejor hecho por la tarde, una incubación durante la noche, seguido de cinco horas de trabajo la mañana siguiente. Se recomienda encarecidamente que la preparación de soluciones de stock (HB y HSWB) así como la molienda de tejidos se realice con antelación. El éxito general del protocolo depende de un genotipado correcto y de condiciones rigurosamente libres de RNase. La capacidad de examinar el traducción de tipos de células específicos permitirá a los estudios futuros comprender mejor la relación entre la transcripción, la traducción y el proteome en innumerables tipos de células y fondos mutantes.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la concesión de NIH NICHD R00HD083521 a EMS y el apoyo interno de la Universidad rutgers a EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
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