원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.
원자력 현미경 검사법 (AFM) 기반 단일 분자 힘 분광법은 단일 폴리머와 표면 사이의 상호 작용을 조사하기위한 이상적인 도구입니다. 진정한 단일 분자 실험을 위해, 프로브 분자의 공유 부착은 그 때 에만 1개의 동일한 단 하나 분자를 가진 힘 연장 추적의 수백을 장악할 수 있기 때문에 필수적입니다. 많은 흔적은 단독으로 단 하나 분자가 탐사된다는 것을 증명하기 위하여 차례로 필요합니다. 또한 단일 프로브 분자와 AFM 캔틸레버 팁, AFM 캔틸레버 팁과 기본 표면 간의 원치 않는 상호 작용을 방지하는 데 패시베이션이 중요합니다. 여기에 제시된 기능화 프로토콜은 신뢰할 수 있고 다양한 폴리머에 쉽게 적용할 수 있습니다. 특징적인 단일 분자 이벤트(즉, 스트레칭 및 고원)는 힘 연장 추적에서 검출됩니다. 이러한 이벤트에서 는 연신력, 탈착력 및 탈착 길이와 같은 물리적 파라미터를 얻을 수 있습니다. 이것은 단 하나 분자 수준에 자극 반응하는 시스템의 정밀한 조사를 위해 특히 중요합니다. 예시적인 시스템인 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(N-이소프로필라크릴라미드) (PNiPAM) 및 폴리스티렌(PS)은 SiOx(PEG 및 PNiPAM용) 및 소수성 자가 조립단열 표면(PS용)으로부터 연신 및 탈착된다.N
1980년대1호에발명된 이래, 원자력 현미경(AFM)은 나노미터 이하의 공간 분해능, 서브피코뉴턴 힘 분해능 및 다양한 용매 및 온도 조건에서 측정할 수 있는 가능성을 특징으로 하는 자연과학에서 가장 중요한 이미징 기술 중 하나가되었으며, 2,3,34,,5,46,7.,7
,이미징8,9,AFM은 단일 중합체와 표면 간의 접착제 상호 작용, 단일 중합체의 물리적 특성 및 단백질,7,,7,10,11,,12,,13,14,15,16사이의 점착 작용에 대한 통찰력을 제공하는 단일 분자 힘 분광법 (SMFS)을 수행하는 데 사용됩니다.,, 정기적인 SMFS 실험에서 기능화된 캔틸레버 팁이 표면과 접촉하여 AFM 캔틸레버의 폴리머가 이 표면에 물리를 수 있도록 합니다. 표면에서 AFM 캔틸레버 팁을 후퇴시킴으로써, AFM 캔틸레버의 편향의 변화는 힘 연장곡선(4)으로이어지는 힘으로 변환된다. 연신력, 탈착력 및 탈착 길이와 같은 물리적 파라미터는 당기기 속도, 표면에 거주 시간, 표면에 대한 들여쓰기 깊이, 온도, 용매17,,18 및 고체 기질, 폴리머 필름 또는 지지성 지질 이중층19,20,,,,21, 22와같은 상이한 파라미터에 따라 결정될 수 있다.21 더욱이, 중합체는 상이한 공간 방향으로 조사될 수 있고, 따라서 중합체23,,24,,25,,26의마찰 특성을 조사한다.
조사된 폴리머를 AFM 캔틸레버 팁에 공유 부착하는 것은 이러한 연구에 필수적입니다. 따라서, AFM 캔틸레버 팁에 결합된 하나의 단일 분자 발생물의 높은 수율은 AFM 캔틸레버27,,28,다양한 부착점29 또는 다양한 폴리머(상이한 윤곽 길이)의 보정으로 인한 결과의 어떠한 편향도 방지한다(다양한 윤곽 길이)는 나노피싱 실험의 경우30,,31, 32.,32 또한, 다른 중합체와의 상호 작용뿐만 아니라 평균 효과는 널리 방지 될 수있다18,,28. AFM 캔틸레버 팁에 폴리머를 공유 부착하기 위해 다양한 유형의 화학 적 변형을 적용 할 수 있으며, 그 중 많은 부분이 Hermanson33에의해 책에 요약되어 있습니다. 아민 및 티올 기반 연결 반응뿐만 아니라 클릭 화학은 AFM 캔틸레버 팁 기능화34,,35,,36,,37,38, 39,,39,,40,,41, 42에서가장 일반적으로 사용되는 방법을 나타낸다.41, Becke et al.40은 AFM 캔틸레버 팁에 단백질을 부착하기 위해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디미드(EDC)/NHS 화학을 사용하는 방법을 보여준다. 그러나, 이러한 작용기는 상호 연결되는 경향이 있어 기능의 손실로 이어진다43,,44. 또한, 카보디마이드는용액(43)에서가수분해가 빠른 경향을 보여준다. 말레미드와 티올 그룹은 일반적으로 더 안정적이며 가교 반응을 보이지 않습니다. 제시된 프로토콜은 참조35,,39에주어진 이전에 게시된 프로토콜의 최적화이다.
여기서, 등고선 길이 또는 소수성등의 성질에 관계없이 많은 수의 상이한 중합체로 용이하게 조절할 수 있는 신뢰할 수 있는 기능화 프로토콜이 제시된다. 3개의 상이한 중합체는 예를 들면: 친수성 폴리에틸렌N글리콜 (PEG) 및 폴리 (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) 뿐만 아니라 높은 몰 질량 소수성 폴리스티렌 (PS). 적절한 링커 분자를 가진 공유 결합 기능을 제공하기 위해, 3개의 중합체는 기능성 말단군으로서 텔레첼릭 티올 모에티를 특징으로 하기 위해 선택되었다. 링커 분자 자체는 전형적으로 2개의 활성 부위를 가진 짧은 PEG 중합체, 한쪽 끝에 실란 군 및 다른 쪽 끝에 있는 말미마이드 그룹이다. 전자는 AFM 캔틸레버 팁에 공유 부착을 가능하게 하고 후자는 기능화된 고몰 질량 중합체의 티올 기와 결합 반응을 가능하게 한다. 또한 비활성 PEG 링커 분자는 프로브 폴리머와 AFM 캔틸레버 팁 뿐만 아니라 AFM 캔틸레버 팁과 기본 표면 사이의 원치 않는 상호 작용을 방지하는 패시베이션 층역할을 합니다.
AFM 기반 SMFS는 중합체 물리학에서 단일 분자 상호 작용을 조사하기위한 주요 도구 중 하나입니다. 진정한 단일 분자 실험을 위해서는 AFM 캔틸레버 팁에 프로브 폴리머를 공유 부착하는 것이 필수적입니다.
많은 이전 작품은 나노 피싱 실험을 기반으로, 특히 PNiPAM에 대한, 여기서 폴리머는 표면에 흡착하고 무작위로 AFM 캔틸레버 팁30,,31을사용하여 기판에서 그들을 따기로 뻗어있다. 이것은 결과를 바꾸고 단 하나 분자 행동의 오해로 이끌어 낼 수 있습니다. 인접한 폴리머와의 상호 작용을 배제할 수 없기 때문에 협조적인 효과가 결과를 지배할 수 있습니다. 이는 결과에 큰 영향을 미치며, 특히 단일 단리 분자57,,58에비해 대량으로 유의하게 다른 거동을 보이는 폴리머에 대해.
여기에 제시된 기능화 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 윤곽 길이, 소수성 또는 단량체의 입체적 장애에 관계없이 다양한 폴리머에 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한 단일 프로브 폴리머와 AFM 캔틸레버 팁, AFM 캔틸레버 팁과 기본 표면 간의 원치 않는 상호 작용을 방지하기 위한 패시베이션이 제공됩니다. 또한 스트레칭 이벤트를 보여주는 힘 연장 곡선의 평가가 표시됩니다. 거기에서 마스터 힘 확장 곡선의 결정을 위한 절차가 제안됩니다. 이는 예를 들어 힘 확장 동작에 대한 온도 관련 효과를 더 잘 드러내는 더 나은 수단을 제공합니다. 더욱이, 일정한 힘 고원을 특징으로 하는 단 하나 분자 탈착 사건의 분석은 제공됩니다. 또한, 힘 확장 곡선에서 정현파 힘 신호 아티팩트를 보정하는 간단한 방법이 제공되어 실험 결과를 손상시킬 수 있습니다.
Stetter et al.39에비해, 여기에 제시된 기능화 절차는 4단계가 아닌 3단계로 감소하고 절차의 견고성이 향상된다. 한 단계에서 PEGylation 및 실란화를 수행하는 주요 이점은 더 잘 제어된 반응을 가지고 수율을 높이는 것입니다. 또한 준비할 수 있는 솔루션이 줄어들고 헹구는 단계가 줄어듭니다. 이것은 준비를 위한 노력과 시간을 감소시키고 재현성을 증가시킵니다. 또한 AFM 캔틸레버를 이동하는 것은 항상 기능화 프로세스의 중요한 부분입니다. 한 솔루션에서 다른 솔루션으로 의한 전송은 항상 공기-물 인터페이스를 통한 전송 또는 핀셋의 부적절한 사용으로 AFM 캔틸레버를 잃어버리는 기능화 품질에 큰 영향을 미칠 위험이 있습니다.
AFM 캔틸레버 팁에 단일 폴리머의 적절한 공유 부착을 증명하기 위해서는 서로 다른 조건이 충족되어야 합니다. 첫째, 제어 AFM 캔틸레버가 매우 중요하며 모든 기능화에 대비해야 합니다. 실험을 수행하기 위한 기능화 과정 및 유체 세포는 소수의 힘 연장 곡선이 대조군 실험에서 늘어나거나 고원을 보이는 경우에만 깨끗한 것으로 간주된다(제시된 예에서 2% 미만).
더 이상 방울이나 최대가없는 명확한 스트레칭 패턴은 적절한 단일 분자 스트레칭 이벤트를 갖는 데 필수적이다. 부가적으로, 다중중합체(59,,60)의동시 탈착을 배제하기 위해서는 파열 또는 연신 곡선의 완전한 탄성 반응에서의 힘 하중 속도에 대한 파열력의 의존성을 분석해야 한다. PEG 및 PNiPAM의 경우, 표면의 상이한 위치에서 취해진 힘 연장 곡선의 19% 및 42%는 각각 이러한 연신 패턴을 보였다. 스트레칭 이벤트를 얻기 위해서는 각각의 기본 표면에 대한 폴리머의 물리 흡착이 강해야 합니다. 그렇지 않으면 고원과 같은 탈착 이벤트가 관찰됩니다. 이것은 높은 힘 (최대 500 pN 이상)에서 스트레칭 이벤트를 감지하는 데 더욱 결정적입니다. 이 강력한 물리 발생은 모든 힘 연장 곡선에 대해 충족되지 않기 때문에, 그러한 이벤트의 수율은 순수한 고원과 같은 탈착 이벤트보다 적습니다. 대안으로, 폴리머와 기본 표면 사이의 카테콜 또는 화학흡수와 같은 강하게 밀착하는 그룹이 사용될 수 있다. 그러나, 이는 폴리머61,,62에서추가의 작용기 또는 커플링 부위의 도입이 요구한다.
실제로, 중합체의 질량(즉, 윤곽 길이)은 귀중한 지문을 제공한다. 질량은 다음과 같은 이유로 측정된 등고선 길이로 직접 변환될 수 없지만 길이 분포는 단일 분자 이벤트를 정의하는 데 매우 유용합니다. 낮은 다분산성을 가진 PNiPAM 폴리머의경우(θ = 1.28), 우리는 실험에서 수득된 연산 이벤트(및 따라서 폴리머 길이)에 대한 확장 값에서 유의한 차이를 발견했다. 그 이유 중 하나는 폴리머 길이및 분포의 결정일 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서, 표적 중합체의 상대적인 중량은 PS 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA)63과같은 표준과 비교하여 결정된다. 추정된 상대 중량은 표적 중합체및 표준의 유체역학적 반경이 현저하게 다를 수 있기 때문에 절대 분자량에서 벗어날 것으로 예상된다. 부가적으로, 실린층은 기능화 과정 동안 톨루엔내의 스퓨리어스 워터에 의해 올리고머화될 수 있다. AFM 캔틸레버 팁에 이러한 올리고머를 부착하면 앵커포인트가 64가적어보다 유연한 레이어가 됩니다. 또한, 실리콘 층에 폴리머의 부착점은 반드시 검출된 길이값(29)의이동으로 이어지는 정점에 있지 않을 수도 있다. 웜라이크 체인(WLC) 또는 자유 관절 사슬(FJC) 모델과 같은 폴리머 모델은 전체,확장 범위18,29,,41,65,,66에걸쳐 PEG 또는 PNiPAM에 대한 각각의 힘 확장 거동을 적절하게 재현할 수 없지만, 이러한 폴리머 모델은 다른 중합체 및 단백질 시스템10,,15,,,67,,68에유용할 수 있다.
단일 PS 폴리머(윤곽 길이가 1 μm 이상)의 공유 부착은 상당한 수의 힘 연장 곡선이 일정한 힘의 충분히 긴 고원을 보일 때 성공적이라고간주됩니다(그림 5). 단일 폴리머를 탈착하여 발생하는 고원은 도 5A에주어진 바와 같이 특정 연장에서 기준선에 일정한 힘의 단일 날카로운 강하에 의해 정의된다. 더 많은 중합체가 AFM 캔틸레버 팁에 부착되는 경우, 고원의 폭포가관찰된다(도 5C).Figure 5 고원 길이(탈착 길이)는 폴리머 윤곽길이(51)와상관관계가 있으며, AFM 캔틸레버 팁의 비특이적 접착력으로 인해 임의의 접착 피크보다 훨씬 더 길어야 한다(여기 약 200 nm). 단일 힘 확장 곡선에만 나타나는 피쳐를 해석해서는 안 됩니다. 제시된 실험에서, 100개의 곡선 중 적어도 80개는 표면의 두 개의 상이한 지점에서 적어도 2개의 힘 맵에서 200 nm 보다 더 긴 고원을 보였다. 또한 그림 5B 및 5D와같은 산란플롯을 사용하여 탈착 길이의 분포는 AFM 캔틸레버 팁에 결합된 중합체의 수와 수를 보여줍니다. PS의 경우, 포스 익스텐션 커브의 고원에서 가져온 탈착력과 길이의 좁은 분포는 성공적인 공유 부착의 증거로 작용했습니다. 이것은 마침내 기능화 프로토콜의 성공을 입증했습니다. 따라서 이러한 힘과 길이 분포를 출판물에 표시하는 것이 좋습니다.
미리 설정된 많은 매개 변수를 구성하는 기본 제공 알고리즘을 사용하여 힘 확장 곡선을 평가하면 주의해서 수행해야 합니다. 예를 들어 고정 샘플링 속도가 적용된 모든 끌어당기 속도에 적합하지 않거나 힘 확장 곡선의 자동 스무딩이 중요한 세부 정보를 평균화할 수 있기 때문에 그 이유가 있습니다. 일반적으로 각 평가 절차를 적절히 이해하면 평가 절차의 오류를 방지할 수 있으며, 이는 AFM 기반 SMFS 실험의 최종 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
요약하자면, 우리는 신뢰할 수 있고 다양한 폴리머에 쉽게 적용 될 수있는 기능화 프로토콜을 제시한다. 또한 단일 분자 힘 확장 곡선의 적절한 평가가 제공되어 연신력, 탈착력 및 탈착 길이와 같은 물리적 파라미터를 결정할 수 있습니다. 제시된 프로토콜 및 절차는 단일 분자 수준에서 자극 반응 시스템의 조사에 유용합니다.
The authors have nothing to disclose.
B.N.B. 및 T.H.는 독일의 우수 전략에 따라 도이치 포르충제마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)의 자금 지원을 인정합니다 – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, 및 부여 HU 997/1-13 (프로젝트 # 420798410). M.G.는 헤센 주 고등 교육, 연구 및 예술부의 LOEWE 프로젝트 iNAPO 의 프레임에서 부분적인 지원을 인정합니다. 우리는 고품질의 금 코팅 실리콘 웨이퍼의 기부에 대한 응용 솔리드 스테이트 물리학 IAF에 대한 프라운 호퍼 연구소에서 박사 볼프강 브로너와 아그네 주카우스카이트 박사에게 감사드립니다.
1-Dodecanethiol (≥98%) | Sigma-Aldrich, USA | 417364-500ML | Used for SAM |
Ammonia solution (30%) | Roth, Germany | CP17.2 | Used for cleaning |
Cypher ES | Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA | – | AFM |
Ethanol (≥99.9%) | Roth, Germany | PO76.1 | Solvent |
Gold coated silicon wafer | Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany | – | Used for SAM |
High Resolution Replicating Compound | Microset Products Ltd, UK | 101RF | Bonding agent |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Used for cleaning |
Igor Pro | Wavemetrics, USA | – | Software environment |
Tetra-30-LF-PC | Diener Electronic, Germany | – | Plasma chamber |
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane | Creative PEG works, USA | PHB-1923 | Linker polymer |
MLCT-Bio-DC | Bruker, USA | MLCT-Bio-DC | AFM cantilever |
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm | MicroChemicals, Germany | WSA40600250 P1314SNN1 | Silicon wafer |
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm | Elga LabWater, Germany | 10034-540 | Ultrapure water source |
R3 SA | Vomm GmbH, Germany | 5803 Blank | Tweezers |
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) | Gallei Group, Saarland University, Germany | – | PNiPAM probe polymer |
Thiol terminated polystyrene | Polymer Source, Canada | P40722-SSH | PS probe polymer |
Thiol-polyethylene glycol-thiol | Creative PEGWorks, USA | PSB-615 | PEG probe polymer |
Toluene (99.99%) | Fisher Chemicals | T324-500 | Solvent |