Summary
Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.
Abstract
Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.
Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP'lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC'ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.
Introduction
Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik polimerlerle karşılaştırıldığında, proteinaceous yapı taşları genetik düzeyde acil supramoleküler yapılar6 üzerinde hassas kontrol sağlar. Bireysel protein yapı taşlarının birincil amino asit (aa) dizisi, molekülerden makroskopik düzeye kadar olan montaj potansiyeline yönelik bilgileri ve son supramoleküler yapının üç boyutlu şekli ve fiziksel özelliklerini özünde kodlar7.
Farklı supramoleküler yapıların biraraya toplanması için bildirilen yöntemler genellikle ısıya duyarlı elastin benzeri proteinler (ELP) gibi amfilik proteinleri içerir.5,8,9, rekombinant oleosin10ve yapay protein amphiphiles11. Sıcaklık tetiklenen yöntemler misellerin montajına yol açmıştır4,10,12Lif13Yaprak14ve veziküller9,15,16. Dinamik protein bazlı veziküllerin oluşumu için organik çözücüler içeren yöntemler uygulanmıştır.8,11,14. Şimdiye kadar, vezikül oluşumu için uygulanan protokoller genellikle mikrometre büyüklüğündeki montajlar üzerinde montaj kontrolü eksikliği16,17veya sınırlı montaj verime sahip5. Buna ek olarak, rapor edilen bazı ELP bazlı veziküller kapsülleme potansiyelini bozmuş12veya zaman içinde sınırlı stabilite9. Sunulan protokoller, bu sakıncaları ele alarak, farklı fizyokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme potansiyeline ve uzun süreli stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıların kendi kendine biraraya getirilmesini sağlar. Özel ampifilik ELP'ler, uygulanan protokol ve ilgili çevre koşullarına bağlı olarak küresel koaservatlar ve yüksek derecede sıralanmış bükümlü lif demetlerinden unilamellar veziküllere kadar geniş bir yelpazeyi kapsayan supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Büyük vesiküler Protein Membran Esaslı Bölmeler (PMBC) membran füzyonu ve faz ayırma davranışı gibi tüm ana fenotipleri lipozomlara benzer olarak ortaya koymaktadır. PMBC'ler, basit epifloresan mikroskobu kullanılarak izlenebilen kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini etkin bir şekilde kapsüllerler. Bu çalışmada kullanılan tekrarlayan ELP alanları protein bazlı supramoleküler mimariler için çekici yapı taşlarıdır.18. ELP pentapeptid tekrar ünitesi (VPGVG) yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korurken, dördüncü pozisyonda proline (valine, V) dışında farklı aa tolere bilinmektedir19. Farklı hidrofilik ve hidrofobik etki alanları içeren amfilik ELP'lerin tasarımı, VPGXG'ye farklı hidrofobiklik, polarite ve şarj ile aa konuk kalıntıları (X) yerleştirilerek gerçekleştirildi.20. Hidrofilik etki alanı misafir kalıntısı olarak yüklü glutamik asit (E) veya arginin (R) içererken, hidrofobik fenilalanin (F) veya izolösin (I) ile donatılmış amfilik ELP etki alanları. Uygun amfilik ELP yapıları ve ilgili aa dizileri listesi ek bilgi ve referanslar bulunabilir8,21. Floresan mikroskopisi ile görselleştirme için küçük floresan boyalar veya floresan proteinler ile donatılmış tüm yapı taşları. mEGFP ve diğer floresan proteinler N-terminalel ELP amphiphiles hidrofilik etki alanlarında erimiş edildi. Organik boyalar bakıriçermeyen suşu ile alkine-azid sikloaddition (SPAAC) ile eş-çeviriile doğal olmayan amino asit (UAA) ile konjuge edildi. UAA'nın ortak çevirisipara-azidophenylalanine (pAzF)22hidrofilik ELP etki alanının N-terminal modifikasyonuna izin verir. Bu şekilde yeşil floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) veya süzme siklotine sahip herhangi bir küçük floresan molekül floresan prob olarak kullanılabilir. UAA pAzF'in başarılı bir şekilde eklenmesi ve boyanın SPAAC ile sikloeklenmesi, ilgili triptik peptidlerin verimli iyonizasyonu nedeniyle LC-MS/MS ile kolayca doğrulanabilir.8. Floresan proteinler çoğu organik çözücüile uyumsuz olduğundan, bu küçük organik boya montaj protokolleri için çözücü seçimini genişletmek için uygulanmıştır. Laboratuarımızda geliştirilen supramoleküler yapılar için en verimli iki montaj protokolü aşağıda açıklanmıştır. THF şişme yöntemi sadece organik boya modifiye amfilik ELP ile uyumludur. Buna karşılık, 1-butanol (BuOH) ekstrüzyon yöntemi floresan prob gibi birçok protein ile uyumludur, örneğin mEGFP, açıklanan yöntem bu füzyon proteinlerinin floresansını tamamen koruduğundan. Buna ek olarak, küçük moleküllerin kapsülleme ve vesiküler füzyon davranışı En iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi istihdam çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Amfilik elastin benzeri proteinlerin (ELP) tasarımı ve klonlanması
- Klon ve başka bir yerdeaçıklandığıgibi yapıları tasarım 8,20. Plazmidler istek üzerine mevcuttur.
2. Protein ekspresyonu, arınma ve hazırlama
- F20E20-mEGFP ve F20E20-mCherry ekspresyonu
- Ana ifade kültürünü bir gecede ön kültürden 0,3'ün OD600'üne bağla. 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB ortamda 2 L'lik bir şişede uygun antibiyotiklerle desteklenerek 200 rpm.
- IpTG stok çözeltisini (1 M) ultra saf suda ifade kültürünün indüksiyonu için hazırlayın.
- OD600 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne IPTG'yi 1 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün. 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin.
- UAA pAzF içeren amfilik ELP ekspresyonu
- İki plazmid pEVOL pAzF ve örneğin pET28-NMBL-(TAG)R40F20-onun 0.3'ün OD600'ünü içeren gecee ait E. coli ön kültürden ana ifade kültürünü aşılamak (amino asit dizileri için ek bilgilere bakın). 37 °C'de kuluçka, steril 400 mL LB orta kanamisin ve kloramfenikol ile desteklenen 2 L şişede 200 rpm.
- Ultra saf suda 100 mM pAzF stok çözeltisi hazırlayın. 10 mL pAzF stok çözeltisi için 206,2 mg pAzF ağırlığında ve 8 mL ultra saf suda yeniden askıya alın. pAzF'ı eritmek için çözeltinin pH'ını 3 M NaOH ile yükseltin ve şiddetle karıştırın. pAzF çözündüğünde, pH'ı dikkatlice 10,5'e düşürün ve 10 mL'lik son hacmine ultra saf su ekleyin. Steril filtre (0,22 μm) kullanın ve çözeltiyi 2 mL reaksiyon tüpünde aliquot kullanın.
- Ultra saf suda 1 M IPTG stok çözeltisi ve ultra saf suda %20 arabinose stok çözeltisi hazırlayın.
- OD600 0.5-0.8'e ulaşıldığında, ifade kültürüne 2 mM'lik son konsantrasyona pAzF ekleyin. PAzF alımı için izin vermek için 10 dakika, 37 °C, 200 rpm için kuluçka kültürü.
- IpTG (1 mM) ve arabinose 'un eşzamanlı ilavesi ile hedef proteinin ekspresyonu ve gerekli tRNA/t-RNA sentezinin ekspresyonu (%2) kuluçka sıcaklığını 20 °C'ye düşürün.
- 200 rpm'de yaklaşık 20 saat boyunca 20 °C'de ifadeye izin verin. 4 °C, 4000 x g,40 dk.
- Hücre lisisi ve protein arınması
- Lysis tamponundaki E. coli peletini (kültür litresi 10 mL; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M üre, %0,25 Triton X-100) lizozym (0.1 mg/mL) ve PMSF (0.1 mM) içeren yeniden askıya alın. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka ve dondurma ve iki kez daha sonra sıvı azot içinde örnek batırarak çözülme.
- Süspansiyonu sonicate (30%, 15 kez, 30 s: 10 s) ve santrifüj (4 °C, 40.000 x g için 40 dk) ile lysate temizleyin.
- Afinite kromatografisi kullanarak proteini arındırın (örn. bir kesir kolektöre bağlı bir FPLC sistemi kullanarak 1 mL nikel kolonda; bkz. Elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M üre, 250-500 mM imidazol) ile proteini yakınlaştırın ve 4 °C'de ilave edilene kadar saklayın.
- Arınma verimliliğini SDS-PAGE üzerinden analiz edin.
3. SPAAC ile ELP'lerin boya-modifikasyonu
- Kabaca ELP çözeltisinin konsantrasyonu tahmin. PAzF-R40F20 dizisi UV aralığında emici amino asitler eksik olduğundan konsantrasyon değerlendirmesi için280 emilimi değerli değildir. Bu nedenle, daha önce lyophilized ve ağırlıklı ELP amphipileS PAGE bant karşılaştırma için bir referans olarak kullanılabilir. ElP çözeltilerinden sds page bantlarının toplam gri değer intesitesinin bilinen konsantrasyonlarla karşılaştırılması ve numunenizin kaba konsantrasyonu tahmin edilebilir.
- 500 μL ELP çözeltisine (~20 μM) 1 000 adet floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM stok çözeltisi; 20 μM son konsantrasyon) ekleyin. 15 °C'de yaklaşık 10 saat boyunca reaksiyon uyguluyor, titreyerek ve ışıktan korunarak.
- Daha fazla kullanım için aşırı BDP'yi kaldırmak için reaksiyonu diyalize sin.
- Diyaliz membranını (örn. 12 kDa kesme) ultra saf suda 10 dakika boyunca dengeleyin. Açılışta diyaliz membranı düzeltmek için, böylece tüp kapatarak, açılış üzerine delikli çekirdek ile bir reaksiyon tüpü kapağı yerleştirin.
- Reaksiyon tüpünü seçilen arabelleğe ters yerleştirin. Her seferinde en az 3 saat diyalizden sonra tamponu (2-5 L) iki kez değiştirin. Başarılı diyaliz sağlamak için diyaliz membran ve tampon arasında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları çıkarın.
4. THF şişme protokolü
- Fosfat veya tris tampon (10 mM) kararlı pH 7.5 tuzları ve onun etiketi saflaştırma kalan bileşikleri kaldırmak için karşı homojen ELP çözeltisi diyaliz.
- Lyophilizer hazırlayın ve dondurularak kurutma için başlangıç sıcaklığına kadar soğutun.
- Aliquot diyaliz protein çözeltisi 1.5 mL reaksiyon tüpleri (tüp başına 50-500 μL) ve şok dondurma sıvı nitrojen. Donma-kurutma sırasında farklı protein çözeltilerinin istenmeyen şekilde karıştırılmasını önlemek için, reaksiyon tüpünün üzerine küçük bir delik olan kapaklar konulabilir ve kısmen kapatılabilir.
- Dondurulmuş protein örneklerini sıvı nitrojenden alın ve dondurularak kurumaya başlamak için hemen lyophilizer'a yerleştirin. Numune tamamen kuruduğunda (yaklaşık 24-48 saat) dondurularak kurutulma işlemi tamamlanır. Daha sonra, kuru N2ile liyofilize amfilik ELP'leri havalandırın, ardından hava nemi ile temas tan kaçınmak için reaksiyon tüpkapaklarını hemen kapatın.
- Lyophilized örnekleri (ELP, 5-10 μM) saf THF ekleyin ve THF ELP şişmesine izin vermek için 15 dakika boyunca buzlu su içeren bir su banyosu sonicator çözüm yerleştirin.
- Vezikül oluşumu için 30-60 °C'ye kadar veya lif oluşumu için 90 °C'ye kadar bir termocycler önceden ısıtın ve ultra saf su veya tampon içeren yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Küresel koacervatlar pH 9-13 içinde ağırlıklı olarak 20 °C'de toplanır. Vezikül oluşumu pH 7 ve 9 arasında 50-60 °C'de tercih edilir. Lif oluşumu pH 5 ve 12 arasında 60 °C'nin üzerinde ön kaynaklıdır.
- Sonication adım sonra, termocycler hazırlanan ultrasaf su veya tampon çözeltisi yanı sıra ELP / THF çözeltisi yerleştirin ve 5 dakika boyunca istenilen sıcaklığa kadar ısıtın. Sıcaklık elde edildiğinde önceden ısıtılmış ELP/THF çözeltisi önceden ısıtılmış ultra saf su veya tampon çözeltisinin üzerine dikkatlice tabakalaştırılmalıdır. İki aşamanın ayrı bir arabirimi ile net bir ayrımı görünür olmalıdır.
- Karışımı tekrar termocycler'a yerleştirin ve arayüze vezikül veya lif oluşumuna izin vermek için 20 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan mikroskopi veya diyaliz yoluyla analiz önce 10 dakika oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- Ultra saf su veya tampona karşı supramoleküler yapıları içeren diyaliz çözeltisi (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 7-10).
5. BuOH ekstrüzyon protokolü
- Ultra saf su veya tamponda 1-50 μM ELP çözeltisi hazırlayın (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, 4 M üre içerebilir). Amfilik ELP F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry çözeltisinin konsantrasyonu molar yok olma katsayıları (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 ve F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (ek bir dizi için bkz.
- %10-20 (v/v) 1-butanol ekleyin ve hemen yukarı ve aşağı boru lama veya bir şırınga ile birden fazla kez çizerek çözeltikarıştırın. 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış ortak bir 100 μL pipet veya Hamilton şırınga uygulanabilir. Karıştırma sırasında çözeltinin bulanıklığı artmalıdır, vezikül oluşumunu gösteren. 1-oktanol %5-15% (v/v) 1-butanol yerine vezikül ekstrüzyonu için de kullanılabilir.
- Dar bir boyut dağılımı elde etmek için, oda sıcaklığında 1 μm gözenek boyutuna sahip bir membran aracılığıyla mini ekstrüzyon kullanarak vezikülleri ekstrüzyon. Ekstrüzyon için kullanılan membran boyutu veziküllerin üst boy kesme belirler.
- Diyaliz veziküller yukarıda açıklandığı gibi (adım 3.3) kalıntı 1-butanol kaldırmak için.
6. BuOH ekstrüzyon protokolü ile boyama kapsülleme
- 10 mM Tris-HCl'de yaklaşık 40 μL ELP çözeltisi, 1 μL Dextran Texas Red (0.0025 mg/mL son konsantrasyon) ile pH 8'i karıştırın.
- Çözeltiye 10 μL BuOH ekleyin ve 0,25 x 25 mm iğne ile donatılmış bir şırınga ile 5-10 kez dışarı çıkar.
7. Floresan mikroskopi ile supramoleküler yapıların analizi
- Bir cam slayt üzerine bir takviye halkası yerleştirin ve sıkıca cam yapışkan tarafı basın.
- Takviye halkasının içine numunenin 5 μL'sini ekleyin ve üzerine bir kapak fişi yerleştirin.
- Analiz sırasında numunenin buharlaşmasını önlemek için numuneyi kapak kapağındaki kenarlara oje ile kapatın.
- Daha önce açıklandığı gibi floresan mikroskobu yürütmek8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vezikül üretimi için protokol geliştirme
Şekil 1 iki farklı vezikül hazırlama yöntemleri özetliyor. Sol taraftaki THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler montajları ile sonuçlanır. Şekil 1A epifloresan mikroskopi görüntülerinde BDP-R20F20'den birleştirilmiş veziküller ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapılar gösterilmektedir. Sağ tarafta gösterilen BuOH yöntemi, thf şişme yöntemine göre yaklaşık iki büyüklük daha fazla vezikül ler veren, ELP veziküloluşumuna yol açar. Şematik illüstrasyon BuOH veziküllerin hazırlık sürecini göstermektedir. Şekil 1B BDP-R40F20'de vezikül preparatı için %10-15 (v/v) BuOH ile karıştırıldı ve veziküller karışımın ekstrüzyonu ile hazırlandı.
Supramoleküler öz-montajı farklı yapılara yönlendirme
Şekil 2, THF şişme protokolü ile BDP-R40F20'den biraraya getirilen farklı supramoleküler yapıların şematik bir illüstrasyon ve epifloresans görüntülerini göstermektedir. Bu durumda farklı montaj protokolleri için lyophilized BDP-R40F20 kullanılmıştır. Tamponun pH'ı ve montaj işleminin sıcaklığı koaservatlar, fibriller veya veziküller oluşturacak şekilde ayarlandı. Şekil 2A'da gösterilen koaservatlar 1-2 μm çapındadır ve BDP-R40F20'den 20 °C ve pH 13'te monte edilmiştir. Montaj sıcaklığının 90 °C'ye ayarı, BDP-R40F20 ile test edilen pH 4-13'te nanofiber demetlerinin(Şekil 2B)oluşmasına neden olur. Kararlı veziküller ELP'den 50 °C ve pH 7(Şekil 2C)sıcaklıkta monte edilebilir. Montaj protokolündeki önemli adımlardan birinde yapılan küçük hatalar Şekil 2D'degösterilen agregaların oluşmasına yol açabilir.
Farklı kargo kapsülleme
Şekil 3, BuOH ekstrüzyon yöntemi ile F20R20-mEGFP'den monte edilen veziküllerin veziküllü lülesine farklı kargonun kapsülasyonunu göstermektedir. Şekil 3A'dapozitif yüklü boya Atto Rho13'ün kapsülletasyonu için boya, karışıma (%15 v/v) BuOH ve şırınga eklenmeden önce sulu ELP çözeltisi ile karıştırıldı. Konfokal mikroskopi görüntüleri yeşil kanalda F20R20-mEGFP'den oluşan vezikülleri, kırmızı kanaldaki kırmızı boya AttoRho13'ü ve ortaya çıkan birleştirilmiş kanalda vezikül lümeni içinde başarılı kapsülleme gösterir.
Polisakkarit Dextran Red 3000 yukarıda açıklandığı gibi BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak başarılı bir şekilde kapsüllendi. Yeşil kanalda kaydedilen görüntüler F20R20-mEGFP'den oluşan vezikülleri gösterirken, kırmızı kanal polisakkarit yükünü gösterir. Şekil 3B'de birleştirilmiş yeşil ve kırmızı görüntü, vezikül lülesine yapılan başarılı Dextran Red 3000 kapsüllemesi doğrular.
Membran komponent uyumluluğu ve ekstrüzyon öncesi/sonrası karışık BuOH veziküllerin faz ayrıştırMa
Şekil 4, tek pmbc yapı taşlarının monte edilmiş PMBC popülasyonları ile karıştırılması üzerine ELP amhipilelerinin faz ayrıştırma ve füzyon davranışını göstermektedir. PMBC montajı ndan önce amfilik ELP yapı taşlarını (F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry) karıştırmak, monte edilmiş PMBC membranı içinde homojen olarak dağılmış moleküllere yol açar. Florofororların ve ilişkili ELP amhiphilelerinin homojen dağılımı, ilgili floresan görüntülerinin kırmızı ve yeşil kanalını birleştirerek belirgindir. F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry'den toplanan vezikül popülasyonlarının karıştırılmasıyla kırmızı veya yeşil floresan yamaları karıştırmadan hemen sonra belirgindir. Bu, farklı etiketli PMBC füzyon olaylarının meydana geldiğini ve bu eritme membranlarının ve bileşenlerinin fazı en az 20 dakika boyunca ayrı kaldığını gösterir. Benzer bir faz davranışı lipid sallar bilinmektedir, lipid membranlar içinde23.
Şekil 1: THF şişme yönteminin ve vezikül ler veya lifler gibi supramoleküler yapılara amfifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için BuOH ekstrüzyon yönteminin çizimi. (A) ThF şişme yöntemi ile BDP-R20F20 ve BDP-R40F20'nin şematik iş akışı ve temsili epifloresans görüntüleri, sıcaklık ve pH'ya bağlı olarak farklı supramoleküler yapılarla sonuçlanır ve (B) BuOH ekstrüzyon yöntemi sadece BDP-R40F20'den (ölçek çubuğu 2 μm) vezikül ler verir. Bu rakam Schreiber ve ark. 20198'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: THF şişme yöntemi BDP-R40F20 uygulanarak farklı supramoleküler yapılara kendi kendine monte edilir. Montaj protokolü sırasında uygulanan çevre koşulları (örn. sıcaklık veya pH) oluşan baskın supramoleküler yapıyı belirler. Montaj sırasında ilgili koşullarda temsili supramoleküler yapılar epifloresan mikroskobu ile izlendi ve (A) koaservatlar ve (B) fibrillerden (C) stabil veziküllere kadar değişmekteydi. (D) THF şişme protokolü sırasında tanımlanan yapıların biraraya gelirken meydana gelen başarısızlık, spesifik olmayan agregaların oluşmasına yol açar (ölçek çubuğu 2 μm). Bu rakam8'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak ELP vezikülleri içinde farklı kargolar kapsüllenebilir. (A) kapsüllü pozitif yüklü boya AttoRho13 ve (B)polisakkarit dextran kırmızı kapsülleme (ölçek çubuğu 5 μm) ile F20R20-mEGFP veziküllerin temsili konfokal görüntüleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: BuOH ekstrüzyon yöntemi ile F20R20'den monte edilen vezikül membranlarının membran komponent uyumluluğu ve füzyon davranışı. (A) F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry protein solüsyonunun şırınga ekstrüzyondan önce karıştırılması, yeşil kanalda (sol görüntü), kırmızı kanal (orta görüntü) ve birleştirilmiş kanalda (sağ görüntü) homojen olarak dağılmış amfilik proteinlerile PMBC membranlarına yol açar. (B) PMBC'ler F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry'den monte edilir ve daha sonra şırınga ekstrüzyonu ile karıştırılarak PMBC membranları içinde ayrılmış ELP amphiphile yamalara yol açar. Membran içinde ayrılmış ELP amphiphiles yeşil kanal (sol görüntü), kırmızı kanal (orta görüntü) ve birleştirilmiş kanal (sağ görüntü) en az 20 dakika PMBC füzyon sonra görülebilir. Ölçek çubukları 5 μm'ye karşılık gelir. Bu rakam Schreiber ve ark. 20198'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:
Amfilik ELP'nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C'lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP'nin başarılı afinite dayalı saflaşması için lysis tamponundaki 4 M'lik üre konsantrasyonunun amfifilik ELP'yi en iyi şekilde çözündeğin ve çözünür elüsyon fraksiyonundaki protein verimini artırıldığı kanıtlanmıştır. Lysis tamponunda daha düşük üre konsantrasyonları isteniyorsa, bireysel yapılar için yakınlık arınması test edilmelidir. 2 M üre bazı yapılar için de çalıştı, özellikle his-tag hidrofilik etki alanına erimiş ve bu nedenle hala rezorin bağlamak mümkün olanlar için. Boyut dışlama kromatografisi ile His-tag arınma sonra ek bir arıtma adımı da vezikül verimi artırabilir.
THF-şişme protokolünün uygulanması durumunda, amfifilik ELP'nin görselleştirme için floresan organik boya ile etiketlenmesi gerekir. Önemli olan, AMPifilik ELP'nin BDP etiketinde (UAA pAzF içeren amino asit dizileri için ek bilgilere bakınız) SPAAC aracılığıyla Tüm saflaştırma tamponlarında TCEP, DTT veya β-mercaptoethanol gibi herhangi bir redüktürün bulunmamasıdır. Bu SPAAC reaksiyonu 24önce pAzF amin azaltma iyi rapor azide önlemek için gereklidir.
Epifloresan skokoperlik mikroskopi ile basit vezikül görüntüleme için her BIR ELP molekülünün etiketlenmesi gerekli olmadığından boyanın ampifilik ELP'ye (örn. pAzF-R40F20) tam reaksiyonu çok önemli değildir. Bu nedenle, bir referans SDS jel bandı ve karşılık gelen ağırlıklı lyophilized örnek korelasyon sadece bir kez her protein yapısı için gereklidir. Ancak % 100'e yakın etiketleme verimi isteniyorsa ELP moleküllerine 1:1 eşdeğerboya oranı yeterlidir. Çok benzer amfifilik ELP'ler laboratuarımızda bdp'nin equimolar ilavesinde tam olarak etiketlenmesi için analiz edildi (veriler henüz yayınlanmadı).
THF şişme yöntemini kullanarak vezikül hazırlığı için en kritik adımlar liyofilize ampifilik ELP'nin şişmesi ve bu çözeltinin sulu tampon fazın üzerine daha sonra tabakalaşmasıdır. Bu nedenle, taze lyophilized amfifilik ELP mümkün olduğunca susuz olmalıdır, kuru azot gazı ile liyofilizatör havalandırma ve reaksiyon tüp kapakları hemen kapatılması ile elde edilebilir. Varsa, septum mühürlü kuru THF vezikül verimini artırmak için kullanılmalıdır, ancak THF p.a. (>99.5%) septum olmadan da çalışır. Kuru THF ampifofilik ELP şişme üzerine tabakalaşma adım çok dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Sıcaklık kontrollü iki çözeltinin başarılı tabakalaşması, organik ve sulu faz arasında açıkça görülebilen bir faz sınırına yol açar. Yüksek sıcaklıklar bu evrelerin Termal kaynaklı karışmasına yol açsa da ilk tabakalaşma adımı yavaş yavaş yapılmalıdır. Çözeltinin acil bulanıklığı, oluşan veziküllerin, liflerin veya koaservatların ışık saçılımından kaynaklanmaktadır. Proteinden yoksun kontrol örneklerinde, THF su arabirimi25için küçük boyutlu yapılar (200 nm'ye kadar) rapor edilse de bulanıklık görünmez. THF tabakalaşma adımı şişme protokolünün en kritik ve başarısızlığa yatkın adımıdır. Kuluçka adımından sonra supramoleküler yapılar tampon veya ultra saf suya karşı diyalize salınabilir. Tercihen aynı sulu çözelti ozmularite korumak ve monte veziküllerin şişmesini veya küçülmesini önlemek için ilk montaj için uygulanan kullanılmalıdır. Diyaliz den sonra veziküller, lifler ve koaservatlar genellikle en az bir hafta stabildir. MONTAJ sırasında çevresel parametrelere bağlı olarak genellikle ana yapının yanı sıra diğer supramoleküler yapıların küçük bir kısmı THF şişme yöntemiuygulandığında8 . Açıklanan THF yöntemi vezikül montaj verimini bir büyüklük sırasına göre artırırken, BuOH ekstrüzyonu daha önce yayınlanmış in vitro yöntemimize göre verimi üç sıra kadir artırMaktadır5.
BuOH ekstrüzyon yöntemi, yüksek tekrarlanabilirlik, lifler ve küresel koaservatlar atlatmak ile sadece istikrarlı vezniküler yapılar elde etmek için uygulanır. Bu yöntem daha az hata yatkındır ve floresan proteinler ile uyumludur. Bu nedenle F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry yanı sıra BDP-R40F20 veya BDP-E20F20 uygulanabilir. Tek kritik adım% 10-20 v / v BuOH eklenmesinden sonra sulu protein çözeltisi hızlı karıştırma olduğunu. F20R20-mEGFP veya F20R20-mKiraz konsantrasyonu 1-15 μM civarında olmalıdır. BuOH ekstrüzyon yöntemi uygulanarak veziküller 5 M NaCl veya 4 M üre ve pH içeren ultra saf su veya tampon da monte edilebilir 5 ila 8 arasında değişen. %20 v/v BuOH'taki ekstrüde PMBC'ler 4°C'de en az 6 ay saklanabilir ve vesiküler yapılarını koruyabilirler. Vezikül boyutu dağılımını daraltmak için, 0,2-1 m gözenek boyutunda bir membran dan mini ekstruder kullanılarak ekstrüzyon edilebilir. Bu gözenek ekstrüzyonu ampifilik ELP'ye BuOH ilavesi sonrası veya vezikül montajından sonra doğrudan yapılabilir. PMBC'ler görüntüleme için fazla yoğunlaşmışsa, BuOH'da monte edilmiş veziküller %10-%20 v/v BuOH içeren sulu tampon kullanılarak hızlı karıştırma yoluyla seyreltilebilir.
BuOH ekstrüzyon yönteminin en önemli sınırlaması, sulu tamponlar karşı PMBC diyaliz genellikle kötü vezikül verimi ile sonuçlanır. Ayrıca, basit yağ asitleri PMBC membran21içine dahil başardık beri membran alanı içinde artık BuOH varlığı dışlanamaz. Bu nedenle, PMBC membranlar bir ölçüde protein ve alkanol moieties oluşan olabilir.
Kimyasal olarak çeşitli kargo moleküllerinin kapsülletme en iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak çalışır. Ayrıca, boyanın stok çözeltisi için çözücü olarak DMSO'nun yakalanması boya kapsülleme verimliliğini artırır. Hassas kargo kapsüllenmiş olması için, 5% -10% v/v 1-okanol PMBC montaj için kullanılabilir ve daha uyumlu olduğu kanıtlanmıştır, BuOH ile karşılaştırıldığında, DNA-ligaz veya TEV proteaz21gibi fonksiyonel kapsüllü enzimler ile,26. Ancak, n-butanol kısa zincir uzunluğu nedeniyle uygulanan diyaliz membran nüfuz etmek mümkün değildir 1-oktanol aksine sulu tampon karşı diyalize olabilir. Bir diğer yöntem sınırlaması da istenilen suprastructure oluşumunu kontrol etmek için gereken uygulanan sıcaklıkların ve pH değerlerinin enzim aktivitesini etkileyebilmesidir. Gelecekteki çalışmalarda, vezikül membran bütünlüğünü bozmadan kapsüllenmeyen ve kapsüllü molekülleri ayırmak için yakınlık saflaştırma veya boyut dışlama saflaştırması kurulmalıdır.
Film rehidrasyon yöntemleri nin aksine16,17 Burada açıklanan protokoller veziküllerin 600 nm'den büyük boyutlarda montajını sağlar. Bu basit epifloresan mikroskopi ve membran faz ayırma gözlem ihradı ile gerçek zamanlı füzyon olaylarının izlenmesine olanak sağlar8. Ampifilik ELP9'un sıcaklık tetikli veziküler montajı ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan protokoller PMBC'yi 6 aya kadar uzun bir süre stabilitesi ile verir. Ancak, ana dezavantajı yapı oluşumu için organik çözücü ihtiyacıdır. BuOH floresanproteinlerin 27'nin bütünlüğünü ve işlevini tam olarak korusa da (veriler gösterilmez), kapsüllü enzimlerin aktivitesi artık organik çözücü ile sınırlandırılabilir ve ayrı ayrı test edilmelidir. Ancak, DNA-ligaz içeren katalitik reaksiyonlar- TEV-proteaz ve lipaz başarıyla veziküllerin luminal boşluk içinde yapılmıştır, tarafından monte 1-okanol veya BuOH ekstrüzyon26,21. Ayrıca, montaj sonrası THF diyalizi çok sorunsuz ve vezikül bütünlüğü korunmuş olsa da, BuOH kaldırma sık sık bilinmeyen nedenlerle vezikül bütünlüğünün kaybına neden olur.
Açıklanan protokoller, araştırmacıların farklı fizikokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme özelliklerine ve uzun süre stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıları biraraya getirmelerine olanak tanır. Bu supramoleküler yapılar minimal hücrelerin tasarımı için uygulanabilir26 veya yapay hücre araştırma21, enzim kapsülleme, veya ilaç formülasyonu. Sunulan fonksiyonel PMCs ilaç teslimatı için daha umut verici adaylar, onların yapı taşları immünojenik olmadığından28, dinamik füzyon davranışı sergi, ve çeşitli kargo kapsülleme için izin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Yazarlar mali destek için BMBF ve Biyolojik Sistemler Analizi Merkezi (ZBSA) araştırma tesisi sağlamak için teşekkür ederiz. Biz Plazmid pEVOL-pAzF sağlamak için P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, ABD müteşekkiriz. Albert-Ludwigs-University Freiburg Biyolojik Sistem Analizi Merkezi'ndeki (ZBSA) Yaşam Görüntüleme Merkezi (LIC) personeline konfokal mikroskopi kaynakları ve görüntü kaydındaki mükemmel destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
