Summary

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Published: April 08, 2020
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Summary

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Abstract

Los bloques de construcción proteígicos a medida son candidatos versátiles para el montaje de estructuras supramoleculares como células mínimas, vehículos de administración de medicamentos y andamios enzimáticos. Debido a su biocompatibilidad y atún a nivel genético, las proteínas similares a la elastina (ELP) son bloques de construcción ideales para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, el montaje de estructuras supramoleculares basadas en proteínas con propiedades fisioquímicas distintas y un buen potencial de encapsulación sigue siendo un reto.

Aquí proporcionamos dos protocolos eficientes para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en arquitecturas de proteínas supramoleculares como coacervados esféricos, fibras y vesículas estables. Los protocolos de montaje presentados generan compartimentos basados en membranas proteicas (PMBC) basados en ELP con propiedades fisicoquímicas adaptables. Los PBPC demuestran el comportamiento de separación de fases y revelan la fusión de membranadependiente del método y son capaces de encapsular moléculas de carga fluorescente químicamente diversas. Los PMBC resultantes tienen un alto potencial de aplicación como plataforma de formulación y entrega de medicamentos, célula artificial y espacio de reacción compartimentado.

Introduction

El montaje de estructuras supramoleculares para aplicaciones biotecnológicas es cada vez más importante1,2,3,4,5. Para el montaje de arquitecturas funcionales como coacervados, vesículas y fibras con las propiedades fisicoquímicas deseadas es importante comprender y controlar las propiedades fisicoquímicas y conformacionales de los componentes. Debido a la precisión molecular de las moléculas que se encuentran en la naturaleza, los bloques de construcción para las estructuras supramoleculares se basan cada vez más en lípidos, ácidos nucleicos o proteínas. En comparación con los polímeros sintéticos, los bloques de construcción proteíricos permiten un control preciso sobre las estructuras supramoleculares emergentes6 a nivel genético. La secuencia de aminoácidos primarios (aa) de los bloques de construcción de proteínas individuales codifica intrínsecamente la información para su potencial de ensamblaje desde el nivel molecular hasta el nivel macroscópico, así como la forma tridimensional y las propiedades físicas de la estructura supramolecular final7.

Los métodos reportados para el montaje de diferentes estructuras supramoleculares a menudo involucran proteínas anfifílicas como proteínas sensibles a la elastina sensibles a la temperatura (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10y anfifes de proteínas artificiales11. Los métodos activados por temperatura han llevado al montaje de micelas4,10,12Fibras13Hojas14y vesículas9,15,16. Se han aplicado métodos de disolventes orgánicos para la formación de vesículas dinámicas a base de proteínas8,11,14. Hasta ahora, los protocolos aplicados para la formación de vesículas a menudo carecen de control de montaje sobre los conjuntos de tamaño de los micrómetros16,17o tienen un rendimiento de montaje limitado5. Además, algunas vesículas basadas en ELP informaron han deteriorado el potencial de encapsulación12o estabilidad limitada en el tiempo9. Abordando estos inconvenientes, los protocolos presentados permiten el autoensamblaje de estructuras supramoleculares de tamaño de micrómetro y sucrómetro con propiedades fisioquímicas distintas, buen potencial de encapsulación y estabilidad de largo plazo. Los ELP anfifílicos a medida se ensamblan en estructuras supramoleculares, abarcando el rango de coacervados esféricos y paquetes de fibra retorcida altamente ordenados hasta vesículas unilamelares dependiendo del protocolo aplicado y las condiciones ambientales asociadas. Los grandes compartimentos basados en membranas de proteínas vesiculares (PMBC) revelan todos los fenotipos principales, como la fusión por membrana y el comportamiento de separación de fase análogo a los liposomas. Los PMBC encapsulan eficientemente moléculas de carga fluorescente químicamente diversas que se pueden monitorear mediante microscopía de epifluorescencia simple. Los dominios ELP repetitivos utilizados en este estudio son bloques de construcción atractivos para arquitecturas supramoleculares basadas en proteínas18. La unidad de repetición de pentapéptido el ELP (VPGVG) es conocida por tolerar diferentes aa además de prolina en la cuarta posición (valina, V), preservando sus propiedades estructurales y funcionales19. El diseño de ELP anfifílicos que contienen dominios hidrófilos e hidrófobos distintivos se realizó insertando residuos de invitados aa (X) en la repetición VPGXG con hidrofobicidad, polaridad y carga distintas20. Dominios el ELP anfifílicos donde está equipado con fenilalanina hidrófoba (F) o isoleucina (I) mientras que el dominio hidrófilo contenía ácido glutámico cargado (E) o arginina (R) como residuos de invitado. Una lista de construcciones elP anfifílicas elegibles y las correspondientes secuencias aa se puede encontrar en la información suplementaria y referencias8,21. Todos los bloques de construcción están equipados con pequeños tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes para su visualización mediante microscopía de fluorescencia. mEGFP y otras proteínas fluorescentes se fusionaron n terminalmente a los dominios hidrófilos de los anfifílicos ELP. Los colorantes orgánicos se conjugaron a través de una cepa libre de cobre promovida por la cicloadición alquino-azida (SPAAC) a un aminoácido no natural (UAA) introducido co-traduccionalmente. La incorporación co-traduccional de la UAApara-azidofenilalanina (pAzF)22permite la modificación N-terminal del dominio ELP hidrófilo. De esta manera el tinte fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) o cualquier molécula fluorescente pequeña con un ciclooctino tenso se puede utilizar como sonda fluorescente. La incorporación exitosa del uAA pAzF y la cicloadición del tinte a través de SPAAC se puede confirmar fácilmente a través de LC-MS/MS debido a la ionización eficiente de los péptidos trippticos correspondientes8. Este pequeño tinte orgánico se aplicó para ampliar la opción de disolvente para los protocolos de montaje, ya que las proteínas fluorescentes son incompatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos. A continuación se describen los dos protocolos de montaje más eficientes para estructuras supramoleculares desarrolladas en nuestro laboratorio. El método de hinchazón THF sólo es compatible con el ELP anfifílico modificado con tinte orgánico. Por el contrario, el método de extrusión de 1 butanol (BuOH) es compatible con muchas proteínas como sonda fluorescente, por ejemplo, mEGFP, ya que el método descrito preserva completamente la fluorescencia de estas proteínas de fusión. Además, la encapsulación de moléculas pequeñas y el comportamiento de fusión vesicular funcionan mejor empleando el método de extrusión BuOH.

Protocol

1. Diseño y clonación de proteínas anfifílicas similares a la elastina (ELP) Clonar y diseñar las construcciones como se describe en otros lugares8,20. Hay plásmidos disponibles bajo petición. 2. Expresión, purificación y preparación de proteínas Expresión de F20E20-mEGFP y F20E20-mCherry Inocular la cultura de expresión principal de la precultura nocturna a unaDo6 de 0,3. Incub…

Representative Results

Desarrollo de protocolos para la producción de vesículasLa Figura 1 describe los dos métodos diferentes de preparación de vesículas. El método de hinchazón THF en el lado izquierdo se compone de tres pasos sucesivos y da como resultado diferentes conjuntos supramoleculares del ELP dependiendo de la temperatura. En la Figura 1A, las imágenes de microscopía de epifluorescencia muestran vesículas ensamblad…

Discussion

Un fallo al seguir los protocolos descritos para el montaje de estructuras supramoleculares definidas conduce principalmente a la formación de agregados inespecíficos(Figura 2,IV) o a anfifílicos ELP distribuidos homogéneos. Los pasos críticos del protocolo se discuten a continuación:

Para un alto rendimiento de expresión del ELP anfifílico, una temperatura relativamente baja de 20oC es óptima. Para una purificación exitosa basada en la afinidad de la EL…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al BMBF el apoyo financiero y al Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) por proporcionar el centro de investigación. Estamos agradecidos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, EE. UU. por proporcionar el plásmido pEVOL-pAzF. Agradecemos al personal del Centro de Imágenes de Vida (LIC) en el Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) de la Universidad Albert-Ludwigs-Universidad freiburgpor su ayuda con sus recursos de microscopía confocal, y el excelente apoyo en la grabación de imágenes.

Materials

1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

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Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

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