Summary
Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.
Abstract
Blocos de construção protecários sob medida são candidatos versáteis para a montagem de estruturas supramoleculares, como células mínimas, veículos de entrega de drogas e andaimes enzimáticos. Devido à sua biocompatibilidade e sintonia no nível genético, as proteínas semelhantes à Elastina (ELP) são blocos de construção ideais para aplicações biotecnológicas e biomédicas. No entanto, a montagem de estruturas supramoleculares baseadas em proteínas com propriedades fisioquímicas distintas e bom potencial de encapsulamento permanece desafiadora.
Aqui fornecemos dois protocolos eficientes para a auto-montagem guiada de ELPs anfífilos em arquiteturas de proteínasupramolecular, tais como coacervates esféricos, fibras e vesículas estáveis. Os protocolos de montagem apresentados geram compartimentos à base de membrana siproteica (PMBCs) baseados em ELPs com propriedades físico-químicas adaptáveis. Os PMBCs demonstram o comportamento de separação de fase e revelam a fusão de membranadependente do método e são capazes de encapsular moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Os PMBCs resultantes têm um alto potencial de aplicação como uma plataforma de formulação e entrega de medicamentos, células artificiais e espaço de reação compartimentado.
Introduction
A montagem de estruturas supramoleculares para aplicações biotecnológicas está se tornando cada vez mais importante1,2,3,4,5. Para a montagem de arquiteturas funcionais como coacervates, vesículas e fibras com propriedades físico-químicas desejadas é importante entender e controlar as propriedades físico-químicas e conformacionais dos componentes. Devido à precisão molecular das moléculas encontradas na natureza, os blocos de construção para estruturas supramoleculares são cada vez mais baseados em lipídios, ácidos nucleicos ou proteínas. Em comparação com polímeros sintéticos, blocos de construção proteináceos permitem um controle preciso sobre estruturas supramoleculares emergentes6 no nível genético. A seqüência de aminoácidos primários (aa) dos blocos individuais de construção de proteínas codifica intrinsecamente as informações para o seu potencial de montagem desde o nível molecular até o nível macroscópico, bem como a forma tridimensional e as propriedades físicas da estrutura supramolecular final7.
Métodos relatados para a montagem de diferentes estruturas supramoleculares geralmente envolvem proteínas anfífilas, como proteínas sensíveis à temperatura semelhantes à elastina (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10e anfífilos de proteína artificial11. Métodos acionados de temperatura levaram à montagem de micelas4,10,12Fibras13Folhas14e vesículas9,15,16. Métodos envolvendo solventes orgânicos têm sido aplicados para a formação de vesículas dinâmicas à base de proteínas8,11,14. Até agora, protocolos aplicados para a formação de vesículas muitas vezes não têm controle de montagem sobre conjuntos de tamanho de micrômetros16,17ou têm rendimento de montagem limitado5. Além disso, algumas vesículas baseadas em ELP relataram ter prejudicado o potencial de encapsulamento12ou estabilidade limitada ao longo do tempo9. Abordando essas desvantagens, os protocolos apresentados permitem a automontagem de estruturas supramoleculares de micromedidor e submicrometro com propriedades fisioquímicas distintas, bom potencial de encapsulamento e estabilidade de longo prazo. Os ELPs anfífilos sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares, abrangendo a faixa desde coacervates esféricos e feixes de fibras torcidas altamente ordenados até vesículas unilamelares, dependendo do protocolo aplicado e das condições ambientais associadas. Grandes compartimentos à base de membrana sicular (PMBC) revelam todos os principais fenótipos, como fusão de membranas e comportamento de separação de fase análogo a lipossomos. Os PMBCs encapsulam eficientemente moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas que podem ser monitoradas usando microscopia de epifluorescência simples. Os domínios repetitivos de ELP utilizados neste estudo são blocos de construção atraentes para arquiteturas supramoleculares baseadas em proteínas18. A unidade de repetição do pentapeptídeo ELP (VPGVG) é conhecida por tolerar diferentes aa além de prolina na quarta posição (valina, V), preservando suas propriedades estruturais e funcionais19. O desenho de ELPs anfífilos contendo domínios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos foi realizado pela inserção de resíduos aa convidados (X) na repetição vpgxg com hidrofobicidade distinta, polaridade e carga20. Domínios anfífilos de ELP quando equipados com fenilalanina hidrofóbica (F) ou isoleucina (I) enquanto o domínio hidrofílico continha ácido glutamico carregado (E) ou arginina (R) como resíduos convidados. Uma lista de construções anfífilas elegíveis e seqüências aa correspondentes podem ser encontradas nas informações e referências suplementares8,21. Todos os blocos de construção onde equipados com pequenos corantes fluorescentes ou proteínas fluorescentes para visualização via microscopia de fluorescência. mEGFP e outras proteínas fluorescentes foram futilizadas n-terminalmente aos domínios hidrofílicos dos anfífilos ELP . Corantes orgânicos foram conjugados através da cepa livre de cobre promovida cicloadição alquina-azida (SPAAC) a um aminoácido não natural introduzido co-tradução (UAA). A incorporação co-translacional do UAApara-azidophenylanina (pAzF)22permite a modificação n-terminal do domínio eLP hidrofílico. Desta forma, o corante fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou qualquer pequena molécula fluorescente com um ciclooctyne tenso pode ser usado como sonda fluorescente. A incorporação bem sucedida do pAzF da UAA e a cicloadição do tintura via SPAAC podem ser facilmente confirmadas via LC-MS/MS devido à ionização eficiente dos peptídeos tripés correspondentes8. Este pequeno corante orgânico foi aplicado para ampliar a escolha do solvente para protocolos de montagem, uma vez que as proteínas fluorescentes são incompatíveis com a maioria dos solventes orgânicos. Os dois protocolos de montagem mais eficientes para estruturas supramoleculares desenvolvidas em nosso laboratório são descritos abaixo. O método de inchaço THF só é compatível com o ELP anfífila modificado de tintura orgânica. Em contraste, o método de extrusão de 1-butanol (BuOH) é compatível com muitas proteínas como sonda fluorescente, por exemplo, mEGFP, uma vez que o método descrito preserva totalmente a fluorescência dessas proteínas de fusão. Além disso, o encapsulamento de pequenas moléculas e comportamento de fusão vesicular funciona melhor empregando o método de extrusão BuOH.
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Protocol
1. Projeto e clonagem de proteínas anfífilas semelhantes à elastina (ELPs)
- Clonar e projetar as construções como descrito em outros lugares8,20. Plasmids estão disponíveis mediante solicitação.
2. Expressão proteica, purificação e preparação
- Expressão de F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry
- Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura da noite para odia 600 de 0,3. Incubar a 37 °C, 200 rpm em meio estéril de 400 mL LB suplementado com antibióticos apropriados em um frasco de 2 L.
- Preparar a solução de estoque iPTG (1 M) para indução da cultura de expressão em água ultrapura.
- Quando o OD600 0.5-0.8 for atingido, adicione o IPTG à cultura de expressão a uma concentração final de 1 mM e reduza a temperatura de incubação para 20 °C. Deixe a expressão a 20 °C por aproximadamente 20 h a 200 rpm.
- Expressão de ELP anfífila contendo UAA pAzF
- Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura e. coli durante a noite contendo os dois plasmídeos pEVOL pAzF e, por exemplo, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a um OD600 de 0,3 (ver informações suplementares para seqüências de aminoácidos). Incubar a 37 °C, 200 rpm em meio estéril de 400 mL LB suplementado com kanamicina e cloro-junfenicol em um frasco de 2 L.
- Prepare a solução de estoque de 100 mM pAzF em água ultrapura. Para 10 mL de solução de estoque pAzF, pesar 206,2 mg pAzF e resuspendê-lo em 8 mL de água ultrapura. Para dissolver o pAzF levante o pH da solução com 3 M NaOH e misture vigorosamente. Quando o pAzF for dissolvido, abaixe cuidadosamente o pH para 10,5 e adicione água ultrapura a um volume final de 10 mL. Use um filtro estéril (0,22 μm) e alíquota a solução em tubos de reação de 2 mL.
- Prepare 1 M solução de estoque IPTG em água ultrapura e 20% de solução de estoque de arabinose em água ultrapura.
- Quando o OD600 0.5-0.8 for atingido, adicione pAzF à cultura de expressão a uma concentração final de 2 mM. Incubar cultura por 10 min, 37 °C, 200 rpm para permitir a absorção de pAzF.
- Induzir a expressão da proteína alvo e expressão da sintetetase tRNA/t-RNA necessária através da adição simultânea de IPTG (1 mM) e arabinose (2%) e reduzir a temperatura de incubação para 20 °C.
- Deixe a expressão a 20 °C por aproximadamente 20 h a 200 rpm. Cultura de expressão de colheita por centrifugação a 4 °C, 4000 x g, 40 min.
- Lse celular e purificação de proteínas
- Resuspender a pelota E. coli no tampão de lysis (10 mL por litro de cultura; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) contendo lysozyme (0,1 mg/mL) e PMSF (0,1 mM). Incubar por 30 min no gelo e congelar e descongelar duas vezes depois submergindo a amostra em nitrogênio líquido.
- Sonice a suspensão (30%, 15 vezes, 30 s: 10 s break) e limpe o lysate via centrifugação (4 °C, 10.000 x g por 40 min).
- Purificar proteínas usando cromatografia de afinidade (por exemplo, em uma coluna de níquel de 1 mL usando um sistema FPLC conectado a um coletor de frações; ver Tabela de Materiais). Eluir a proteína com tampão de elução (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M ureia, 250-500 mM imidazol) e armazenar a 4 °C até posterior processamento.
- Analise a eficiência de purificação via SDS-PAGE.
3. Modificação de tintura de ELPs via SPAAC
- Estimar aproximadamente a concentração da solução ELP. Uma absorçãode 280 para avaliação de concentração não é valiosa, uma vez que a seqüência pAzF-R40F20 não tem aminoácidos absorvendo na faixa UV. Portanto, um anfífilo ELP anteriormente liofilizado e ponderado pode ser usado como referência para comparação de banda sds PAGE. Através da comparação da intesidade de valor cinza somado das bandas sds page de soluções ELP com concentrações conhecidas e sua amostra a concentração aproximada de sua amostra pode ser estimada.
- Adicionar 1 μL de corante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (solução de estoque de 10 mM; concentração final de 20 μM) a 500 μL de solução ELP (~20 μM). Incubar a reação por cerca de 10 h a 15 °C, enquanto treme e protege da luz.
- Para maior uso, diálise a reação para remover o BDP excessivo.
- Equilibre uma membrana de diálise (por exemplo, corte de 12 kDa) em água ultrapura por 10 minutos. Corte a membrana de diálise no tamanho correto a ser colocada sobre a abertura de um tubo de reação contendo a solução ELP clicada. Para fixar a membrana de diálise na abertura, coloque uma tampa de tubo de reação com o núcleo perfurado na abertura, fechando assim o tubo.
- Coloque o tubo de reação de cabeça para baixo no tampão escolhido. Troque o buffer (2-5 L) duas vezes após a diálise por pelo menos 3 h cada vez. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre a membrana de diálise e o tampão para garantir a diálise bem sucedida.
4. Protocolo de inchaço thf
- Diálise solução ELP homogênea contra fosfato ou tampão tris (10 mM) com pH estável 7.5 para remover sais e compostos remanescentes de sua purificação de tag.
- Prepare o liofilizador e esfrie até a temperatura inicial para a secagem congelante.
- Alice a solução de proteína dialisada em tubos de reação de 1,5 mL (50-500 μL por tubo) e congele o choque em nitrogênio líquido. Para evitar a mistura indesejada de diferentes soluções proteicas durante a secagem congelante, tampas com um pequeno orifício podem ser colocadas em cima do tubo de reação para selá-lo parcialmente.
- Retire as amostras de proteína congelada do nitrogênio líquido e coloque-as imediatamente no liofilizador para começar a secar o congelamento. A secagem congelante é concluída quando a amostra está completamente seca (aproximadamente 24-48 h). Posteriormente, ventilar ELPs anfífilas liofilizados ventiladas com N2seco, em seguida, feche imediatamente as tampas do tubo de reação para evitar o contato com a umidade do ar.
- Adicione THF puro às amostras liofilizadas (ELP, 5-10 μM) e coloque a solução em um sônico de banho de água contendo água gelada por 15 minutos para permitir o inchaço do ELP em THF.
- Pré-aqueça um termociclador a 30-60 °C para formação de vesículas ou até 90 °C para formação de fibras e prepare novos tubos de reação contendo água ultrapura ou tampão (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5-13). Coacervates esféricos se reúnem predominantemente a 20 °C dentro de pH 9-13. A formação de vesículas é favorecida a 50-60 °C entre pH 7 e 9. A formação de fibras é predominantemente induzida acima de 60 °C entre pH 5 e 12.
- Após a etapa de sonorização, coloque a solução ELP/THF, bem como a solução de água ultrapura ou tampão preparada no termociclador e aqueça até a temperatura desejada por 5 minutos. Quando a temperatura for atingida, a solução ELP/THF pré-aquecida deve ser cuidadosamente estratificada em cima da solução de água ultrapura ou tampão pré-aquecida. Uma separação clara das duas fases com uma interface distinta deve ser visível.
- Coloque a mistura no termociclador novamente e incubar por 20 min para permitir a formação de vesícula ou fibra na interface. Posteriormente, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente por 10 min antes da análise via microscopia de fluorescência ou diálise.
- Solução de diálise contendo as estruturas supramoleculares contra água ultrapura ou tampão (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).
5. Protocolo de extrusão buoh
- Prepare uma solução ELP de 1-50 μM em água ultrapura ou tampão (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, pode conter até 4 M urea). A concentração da solução anfífila ELP F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry pode ser determinada utilizando-se os coeficientes de extinção molar (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 e F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (ver informações suplementares para sequências aa).
- Adicione 10%-20% (v/v) 1-butanol e misture imediatamente a solução encanando para cima e para baixo ou desenhando-a através de uma seringa várias vezes. Pode ser aplicada uma pipeta comum de 100 μL ou uma seringa Hamilton equipada com uma agulha de 0,25 x 25 mm. A turbidez da solução durante a mistura deve aumentar, indicando a formação de vesículas. 1-octanol 5%-15% (v/v) também pode ser usado para extrusão de vesícula em vez de 1-butanol.
- Para obter uma distribuição de tamanho estreito, extrude vesículas usando uma mini extrusora através de uma membrana com um tamanho de poro de 1 μm à temperatura ambiente. O tamanho da membrana usado para extrusão determina o corte de tamanho superior das vesículas.
- Diálise as vesículas conforme descrito acima (passo 3.3) para remover o residual 1-butanol.
6. Encapsulamento de tintura com o protocolo de extrusão BuOH
- Misture aproximadamente 40 μL solução ELP em 10 mM Tris-HCl, pH 8 com 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL concentração final).
- Adicione 10 μL de BuOH à solução e extruda 5-10 vezes através de uma seringa equipada com uma agulha de 0,25 x 25 mm.
7. Análise de estruturas supramoleculares utilizando microscopia de fluorescência
- Coloque um anel de reforço em uma lâmina de vidro e pressione firmemente o lado adesivo ao vidro.
- Adicione 5 μL da amostra ao interior do anel de reforço e coloque um deslizamento de tampa em cima.
- Sele a amostra com esmalte nas bordas do deslizamento de cobertura para evitar a evaporação da amostra durante a análise.
- Realizar microscopia de fluorescência como descrito anteriormente8.
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Representative Results
Desenvolvimento de protocolos para produção de vesículas
A Figura 1 descreve os dois métodos diferentes de preparação da vesícula. O método de inchaço THF no lado esquerdo é composto de três passos sucessivos e resulta em diferentes conjuntos supramoleculares do ELP, dependendo da temperatura. Na Figura 1A imagens de microscopia de epifluorescência mostram vesículas montadas a partir de BDP-R20F20 e estruturas fibriárias montadas a partir de BDP-R40F20. O método BuOH, ilustrado no lado direito, leva exclusivamente à formação de vesículas ELP, produzindo cerca de duas ordens de magnitude mais vesículas em comparação com o método de inchaço THF. A ilustração esquemática mostra o processo de preparação das vesículas BuOH. Para a preparação de vesículas na Figura 1B BDP-R40F20 foi misturado com 10-15% (v/v) BuOH e vesículas foram preparadas por extrusão da mistura.
Guiando a auto-montagem supramolecular em diferentes estruturas
A Figura 2 mostra uma ilustração esquemática e imagens de epifluorescência de diferentes estruturas supramoleculares montadas a partir de BDP-R40F20 através do protocolo de inchaço THF. Neste caso, foi utilizado o BDP-R40F20 liofilizado para os diferentes protocolos de montagem. O pH do tampão e a temperatura do processo de montagem foram ajustados para formar coacervates, fibrilas ou vesículas. As coacervates retratadas na Figura 2A têm 1-2 μm de diâmetro e foram montadas a partir de BDP-R40F20 a 20 °C e pH 13. O ajuste da temperatura do conjunto para 90 °C resulta na formação de feixes de nanofibra(Figura 2B) em pH 4-13 testados com BDP-R40F20. Vesículas estáveis podem ser montadas a partir do ELP a uma temperatura de 50 °C e pH 7 (Figura 2C). Pequenos erros em uma das etapas cruciais do protocolo de montagem podem levar à formação de agregados retratados na Figura 2D.
Encapsulamento de cargas diferentes
A Figura 3 mostra o encapsulamento de diferentes cargas no lúmen vesículo de vesículas montadas a partir de F20R20-mEGFP através do método de extrusão BuOH. Para o encapsulamento do corante atto rho13 carregado positivamente na Figura 3A,o corante foi misturado com a solução ELP aquosa antes da adição de (15% v/v) BuOH e extrusão da seringa da mistura. As imagens de microscopia confocal mostram as vesículas formadas a partir de F20R20-mEGFP no canal verde, o corante vermelho AttoRho13 no canal vermelho e o canal mesclado resultante mostra o encapsulamento bem sucedido dentro do lúmen da vesícula.
O polissacarídeo Dextran Red 3000 foi encapsulado com sucesso usando o método de extrusão BuOH como descrito acima. Imagens gravadas em canal verde mostram as vesículas formadas a partir de F20R20-mEGFP, enquanto o canal vermelho mostra a carga de polissacarídeo. Imagem verde e vermelha mesclada na Figura 3B confirmam o bem sucedido encapsulamento Dextran Red 3000 no lúmen vesículo.
Compatibilidade do componente de membrana e separação de fase das vesículas BuOH mistas antes/depois da extrusão
A Figura 4 mostra o comportamento de separação e fusão de anfífilos elp ao misturar blocos de construção pmbc único versus populações pmbc montadas. A mistura de blocos de construção anfífilas (F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry) antes da montagem do PMBC leva a moléculas distribuídas de forma homogênea dentro da membrana PMBC montada. A distribuição homogênea dos floróforos e dos anfífilos eLP associados é evidente ao mesclar o canal vermelho e verde das respectivas imagens de fluorescência. Ao misturar as populações de vesículas montadas a partir de F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry, manchas de membrana claramente visíveis de fluorescência vermelha ou verde são evidentes imediatamente após a mistura. Isso indica que ocorrem eventos de fusão pmbc de PMBCs diferentemente rotulados e que essas membranas fundidas e seus constituintes permanecem em fase separada por pelo menos 20 min. Um comportamento de fase semelhante é conhecido a partir de balsas lipídicas, dentro de membranas lipídicas23.
Figura 1: Ilustração do método de inchaço thf e do método de extrusão BuOH para a automontagem guiada de ELPs anfífilos em estruturas supramoleculares, como vesículas ou fibras. Fluxo de trabalho esquemático e imagens representativas de epifluorescência de (A) o método de inchaço THF com BDP-R20F20 e BDP-R40F20 resultando em diferentes estruturas supramoleculares dependendo da temperatura e pH e (B) o método de extrusão BuOH exclusivamente produzindo vesículas de BDP-R40F20 (barra de escala 2 μm). Este número foi modificado a partir de Schreiber et al. 20198. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Aplicando o método de inchaço THF BDP-R40F20 auto-monta-se em diferentes estruturas supramoleculares. As condições ambientais aplicadas durante o protocolo de montagem (por exemplo, temperatura ou pH) determinam a estrutura supramolecular predominante formada. As estruturas supramoleculares representativas nas respectivas condições durante a montagem foram monitoradas por microscopia epifluorescência e variam de (A) coacervates e (B) fibrilas a (C) vesículas estáveis. (D) Falha na montagem de estruturas definidas durante o protocolo de inchaço thf leva à formação de agregados inespecíficos (barra de escala 2 μm). Este número foi modificado a partir de8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diferentes cargas podem ser encapsuladas dentro de vesículas ELP usando o método de extrusão BuOH. (A) mostra imagens confocais representativas de vesículas F20R20-mEGFP com corantes encapsulados com carga positiva AttoRho13 e (B) o encapsulamento do polissacarídeo dextran vermelho (barra de escala 5 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Compatibilidade de componentes de membrana e comportamento de fusão de membranas vesículas montadas a partir de F20R20 via método de extrusão BuOH. (A) A Mistura de solução de proteína f20R20-mEGFP fluorescente e f20R20-mCherry antes da extrusão da seringa leva às membranas PMBC com proteínas anfífilas distribuídas de forma homogênea visíveis em canal verde (imagem esquerda), canal vermelho (imagem média) e canal mesclado (imagem direita). (B) PMBCs montados a partir de f20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry e misturados posteriormente através de chumbo de extrusão de seringa para remendos de anfófilos ELP separados dentro das membranas PMBC. Os anfófilos ELP separados dentro da membrana são visíveis após a fusão pmbc por pelo menos 20 minutos no canal verde (imagem esquerda), canal vermelho (imagem do meio) e o canal mesclado (imagem direita). As barras de escala correspondem a 5 μm. Este número foi modificado a partir de Schreiber et al. 20198. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma falha ao seguir os protocolos descritos para a montagem de estruturas supramoleculares definidas leva principalmente à formação de agregados inespecíficos(Figura 2, IV) ou a anfífilos ELP-anfifilos homogeneamente distribuídos. As etapas críticas do protocolo são discutidas abaixo:
Para o alto rendimento de expressão do ELP anfífilo, uma temperatura relativamente baixa de 20°C é ótima. Para a purificação bem-sucedida da eLP anfífila, foi comprovada a concentração de uéia de 4 M no tampão de lise para melhor solizar o ELP anfífila e aumentar o rendimento da proteína na fração de elução solúvel. Se forem desejadas concentrações mais baixas de uréia no tampão de líse, a purificação da afinidade deve ser testada para os construtos individuais. 2 M ureia funcionou bem para alguns construtos, especialmente para aqueles onde a Sua-tag foi fundida ao domínio hidrofílico e, portanto, ainda capaz de ligar a resina. Uma etapa adicional de purificação após a purificação de Sua-tag via cromatografia de exclusão de tamanho pode aumentar o rendimento da vesícula também.
No caso da aplicação do protocolo de inchaço thf, o ELP anfífila precisa ser rotulado com um corante orgânico fluorescente para visualização. Importante para a rotulagem bdp do ELP anfífila (ver informações suplementares para seqüências de aminoácidos contendo uaa pAzF) via SPAAC é a ausência de qualquer redutor como TCEP, DTT ou β-mercaptoetanol em todos os buffers de purificação. Isto é necessário para evitar a azida bem relatada à redução da amina de pAzF antes da reação do SPAAC24.
A reação exata da estequiometria do díster ao ELP anfífilo (por exemplo, pAzF-R40F20) não é crucial, pois não é necessário rotular cada molécula eLP para visualização de vesícula simples via microscopia epifluorescência. Portanto, a correlação de uma faixa de gel SDS de referência e da amostra liofilizada ponderada correspondente é necessária apenas uma vez para cada construção proteica. No entanto, se for desejado um rendimento de rotulagem próximo de 100% de 100% de difusão de 1:1 para moléculas de ELP. Elps anfífilos muito semelhantes foram analisados em nosso laboratório para serem totalmente rotulados em uma adição equimolar de BDP (dados ainda não publicados).
Para a preparação de vesículas utilizando o método de inchaço thf, as etapas mais críticas são o inchaço do ELP anfífilo liofilizado e a estratificação subseqüente desta solução em cima da fase tampão aquosa. Portanto, o ELP anfífila recém-liofilizado deve ser o mais anidro possível, o que pode ser alcançado pela ventilação do liofilizador com gás nitrogênio seco e fechamento imediato das tampas do tubo de reação. Se disponível, o THF seco selado de septo deve ser usado para aumentar o rendimento da vesícula, mas THF p.a. (>99,5%) sem septo funciona também. O passo de estratificação após o inchaço do ELP anfífilo em THF seco deve ser executado com muito cuidado. A estratificação bem sucedida das duas soluções controladas pela temperatura leva a uma fase claramente visível entre a fase orgânica e aquosa. A etapa inicial de estratificação deve ser conduzida lentamente, embora temperaturas elevadas levem à mistura térmica induzida dessas fases. A turbidez emergente da solução deve-se à dispersão leve de vesículas, fibras ou coacervates formadas. No controle de amostras sem a proteína, não aparece turbidez, embora estruturas de pequeno porte (até 200 nm) sejam relatadas para a interface de água THF25. O passo de estratificação thf é o passo mais crítico e propenso a falhas do protocolo de inchaço. Após a etapa de incubação, as estruturas supramoleculares podem ser dialisadas contra tampão ou água ultrapura. Preferencialmente deve ser utilizada a mesma solução aquosa que foi aplicada para montagem inicial, a fim de manter a osmolaridade e evitar o inchaço ou encolhimento das vesículas montadas. Após a diálise, as vesículas, fibras e coacervates são geralmente estáveis por pelo menos uma semana. Dependendo dos parâmetros ambientais durante a montagem, muitas vezes uma pequena proporção de outras estruturas supramoleculares além da estrutura principal estão presentes se o método de inchaço thf for aplicado8. O método THF descrito aumenta o rendimento do conjunto de vesículas em uma ordem de magnitude, enquanto a extrusão buoh melhora o rendimento em três ordens de magnitude em comparação com o nosso método in vitro publicado anteriormente5.
O método de extrusão buoh é aplicado para obter estruturas vesiculares exclusivamente estáveis com alta reprodutibilidade, contornando fibras e coacervates esféricas. Este método é menos propenso a erros e compatível com proteínas fluorescentes. Portanto, F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry podem ser aplicados, bem como BDP-R40F20 ou BDP-E20F20. O único passo crítico é a rápida mistura da solução proteica aquosa após adição de 10%-20% v/v BuOH. A concentração de F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry deve ser em torno de 1-15 μM. Aplicando vesículas do método de extrusão BuOH pode ser montado em água ultrapura ou tampão contendo até 5 M NaCl ou 4 M ureia e pH variando de 5 a 8. Os PMBCs extrudados em 20% v/v BuOH podem ser armazenados por pelo menos 6 meses a 4°C, preservando sua estrutura vesicular. Para reduzir a distribuição do tamanho da vesícula, eles podem ser extrudidos usando uma mini extrusora através de uma membrana de 0,2-1 μm tamanho poro. Esta extrusão porosa pode ser feita diretamente após a adição de BuOH ao ELP anfífilo ou após a montagem da vesícula. Se os PMBCs estiverem muito concentrados para imagens, as vesículas montadas em BuOH podem ser diluídas através de uma mistura rápida usando tampão aquoso contendo 10%-20% v/v BuOH.
A maior limitação do método de extrusão buoh é que a diálise pmbc contra tampões aquosos muitas vezes resulta em baixo rendimento de vesícula. Além disso, a presença de BuOH residual dentro do espaço da membrana não pode ser excluída, uma vez que os ácidos graxos simples foram capazes de incorporar na membrana PMBC21. Portanto, as membranas PMBC podem ser, em certa medida, compostas de proteínas e alces alcalinos.
O encapsulamento de moléculas de carga quimicamente diversas funciona melhor usando o método de extrusão BuOH. Além disso, o DMSO como solvente para a solução de estoque do tinário a ser capturado aumenta a eficiência do encapsulamento do tine. Para que a carga delicada seja encapsulada, 5%-10% v/v 1-octanol pode ser usado para montagem pmbc e provou ser melhor compatível, quando comparado com BuOH, com enzimas encapsuladas funcionais como DNA-ligase ou TEV protease21,26. No entanto, devido ao comprimento de cadeia mais curto de n-butanol pode ser dialisado contra tampão aquoso em contraste com 1-octanol, que não é capaz de permear a diálise-membrana aplicada. Outra limitação do método é que as temperaturas aplicadas e os valores de pH necessários para controlar a formação supraestrutura desejada podem afetar a atividade enzimática. Em trabalhos futuros, a purificação de afinidade ou purificação de exclusão de tamanho deve ser estabelecida para separar moléculas não encapsuladas versus encapsuladas sem deteriorar a integridade da membrana vesícula.
Em contraste com os métodos de reidratação de filme16,17 os protocolos descritos aqui permitem a montagem de tamanhos de vesículas superiores a 600 nm. Isso permite o monitoramento de eventos de fusão em tempo real através de microscopia de epifluorescência simples e a observação da separação da fase da membrana8. Em comparação com a temperatura desencadeada montagem vesicular de ELP anfífila9 os protocolos descritos aqui produzem PMBC com uma estabilidade de tempo longo de até 6 meses. No entanto, a principal desvantagem é a necessidade de solvente orgânico para a formação da estrutura. Embora o BuOH preserve totalmente a integridade e a função das proteínas fluorescentes27 (dados não mostrados), a atividade das enzimas encapsuladas pode ser restringida por solvente orgânico residual e deve ser testada individualmente. No entanto, reações catalíticas envolvendo DNA-ligase, TEV-protease e lipase foram conduzidas com sucesso dentro do espaço luminal das vesículas, montadas por extrusão de 1 octanol ou BuOH26,21. Além disso, embora a diálise THF após a montagem seja muito pouco problemática e a integridade das vesículas seja preservada, a remoção do BuOH frequentemente resulta em perda de integridade da vesícula devido a razões desconhecidas.
Os protocolos descritos permitem aos pesquisadores montar estruturas supramoleculares de micromedidor e submicrometro com propriedades físico-químicas distintas, boas propriedades de encapsulamento e estabilidade de longo prazo. Estas estruturas supramoleculares podem ser aplicadas para o desenho de células mínimas26 ou pesquisa celular artificial21, encapsulamento enzimático, ou formulação de drogas. Os PMBCs funcionais apresentados são ainda candidatos promissores para a entrega de medicamentos, uma vez que seus blocos de construção não são imunogênicos28, exibem comportamento dinâmico de fusão, e permitem o encapsulamento de carga diversificada.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao BMBF pelo apoio financeiro e ao Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) pelo fornecimento da instalação de pesquisa. Somos gratos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Califórnia, EUA por fornecer o plasmídeo pEVOL-pAzF. Agradecemos à equipe do Centro de Imagens de Vida (LIC) do Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) da Universidade Albert-Ludwigs-Universidade de Freiburg pela ajuda com seus recursos de microscopia confocal, e pelo excelente apoio na gravação de imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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