Summary
Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.
Abstract
Op maat gemaakte eiwithoudende bouwstenen zijn veelzijdige kandidaten voor de assemblage van supramoleculaire structuren zoals minimale cellen, drugsafgiftevoertuigen en enzymsteigers. Door hun biocompatibiliteit en tuniekheid op genetisch niveau zijn Elastin-achtige eiwitten (ELP) ideale bouwstenen voor biotechnologische en biomedische toepassingen. Niettemin blijft de assemblage van op eiwitten gebaseerde supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen en een goed inkapselingspotentieel een uitdaging.
Hier bieden we twee efficiënte protocollen voor begeleide zelfassemblage van amfifiele ELPs in supramoleculaire eiwitarchitecturen zoals sferische coacervates, vezels en stabiele blaasjes. De gepresenteerde assemblageprotocollen genereren Protein Membrane-Based Compartments (PMBC's) op basis van ELP's met aanpasbare fysisch-chemische eigenschappen. PMBC's vertonen fasescheidingsgedrag en onthullen methodeafhankelijke membraanfusie en zijn in staat om chemisch diverse fluorescerende ladingmoleculen in te kapselen. De resulterende PMBC's hebben een hoog toepassingspotentieel als een medicijnformulerings- en leveringsplatform, kunstmatige cel en gecompartimenteerde reactieruimte.
Introduction
De assemblage van supramoleculaire structuren voor biotechnologische toepassingen wordt steeds belangrijker1,2,3,4,5. Voor de assemblage van functionele architecturen zoals coacervates, blaasjes en vezels met de gewenste fysisch-chemische eigenschappen is het belangrijk om de fysicochemische en conformatie-eigenschappen van de componenten te begrijpen en te controleren. Door de moleculaire precisie van moleculen in de natuur zijn bouwstenen voor supramoleculaire structuren steeds meer gebaseerd op lipiden, nucleïnezuren of eiwitten. In vergelijking met synthetische polymeren zorgen eiwithoudende bouwstenen voor nauwkeurige controle over opkomende supramoleculaire structuren6 op genetisch niveau. De primaire aminozuur (aa) sequentie van de afzonderlijke eiwitbouwstenen codeert intrinsiek de informatie voor hun assemblagepotentieel van het moleculaire tot het macroscopische niveau, evenals de driedimensionale vorm en fysische eigenschappen van de uiteindelijke supramoleculaire structuur7.
Gemelde methoden voor de assemblage van verschillende supramoleculaire structuren bevatten vaak amfifiele eiwitten zoals temperatuurgevoelige elastine-achtige eiwitten (ELP)5,8,9, recombinant oleosine10en kunstmatige eiwitfifielen11. Temperatuur geactiveerde methoden hebben geleid tot de assemblage van micelles4,10,12Vezels13Bladen14en blaasjes9,15,16. Methoden met organische oplosmiddelen zijn toegepast voor de vorming van dynamische eiwitgebaseerde blaasjes8,11,14. Tot nu toe, toegepaste protocollen voor blaasvorming vaak gebrek aan montage controle over micrometer formaat assemblages16,17of hebben een beperkte montage opbrengst5. Bovendien hebben sommige gemelde elp-gebaseerde blaasjes een verminderde inkapselingspotentieel12of beperkte stabiliteit in de tijd9. Het aanpakken van deze nadelen, de gepresenteerde protocollen in staat stellen de zelfassemblage van micrometer en sub micrometer formaat supramoleculaire structuren met verschillende fysiochemische eigenschappen, goede inkapseling potentieel en lange tijd stabiliteit. Op maat gemaakte amfifiele ELP's assembleren zich in supramoleculaire structuren, verspreid over het bereik van sferische coacervates en zeer geordende gedraaide vezelbundels tot unilamellaire blaasjes, afhankelijk van het toegepaste protocol en de bijbehorende omgevingsomstandigheden. Grote voertuigen op basis van eiwit membraan compartimenten (PMBC) onthullen alle belangrijke fenotypes zoals membraan fusie en fase scheiding gedrag analoog aan liposomen. PMBCs efficiënt inkapselen chemisch diverse fluorescerende lading moleculen die kunnen worden gecontroleerd met behulp van eenvoudige epifluorescentie microscopie. De repetitieve ELP domeinen die in deze studie worden gebruikt zijn aantrekkelijke bouwstenen voor eiwitgebaseerde supramoleculaire architecturen18. Van de ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG) is bekend dat het andere aa tolereert naast proline op de vierde positie (valine, V), met behoud van de structurele en functionele eigenschappen19. Het ontwerp van amfifiele ELPs met kenmerkende hydrofiele en hydrofobe domeinen werd gerealiseerd door het inbrengen van aa gastresiduen (X) in de VPGXG herhaling met duidelijke hydrofobe, polariteit en lading20. Amfifiele ELP-domeinen die zijn uitgerust met hydrofobe fenylalanine (F) of isoleucine (I), terwijl het hydrofiele domein geladen glutaminezuur (E) of arginine (R) als gastresiduen bevatte. Een lijst van in aanmerking komende amfifiele ELP-constructies en overeenkomstige aa-sequenties is te vinden in de aanvullende informatie en referenties8,21. Alle bouwstenen waren voorzien van kleine fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende eiwitten voor visualisatie via fluorescentiemicroscopie. mEGFP en andere fluorescerende eiwitten werden N-terminaal gefuseerd met de hydrofiele domeinen van de ELP-amfifielen. Organische kleurstoffen werden geconjugeerd via kopervrije stam bevorderd alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) tot een co-translationeel geïntroduceerd onnatuurlijk aminozuur (UAA). De co-translationele integratie van de UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22staat de N-terminal modificatie van het hydrofiele ELP-domein toe. Op deze manier de groene fluorescerende kleurstof BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) of een klein fluorescerend molecuul met een gespannen cyclooctyne kan worden gebruikt als fluorescerende sonde. Succesvolle integratie van de UAA pAzF en cycloaddition van de kleurstof via SPAAC kan gemakkelijk worden bevestigd via LC-MS / MS als gevolg van efficiënte ionisatie van de overeenkomstige tryptische peptiden8. Deze kleine organische kleurstof werd toegepast om de oplosmiddelkeuze voor assemblageprotocollen te verbreden, aangezien fluorescerende eiwitten onverenigbaar zijn met de meeste organische oplosmiddelen. De twee meest efficiënte assemblageprotocollen voor supramoleculaire structuren die in ons lab zijn ontwikkeld, worden hieronder beschreven. De THF zwelling methode is alleen compatibel met organische kleurstof gemodificeerde amfifiele ELP. De extrusiemethode 1-butanol (BuOH) is daarentegen compatibel met veel eiwitten als fluorescerende sonde, bijvoorbeeld mEGFP, omdat de beschreven methode de fluorescentie van deze fusie-eiwitten volledig behoudt. Bovendien werkt de inkapseling van kleine moleculen en vesiculatiegedrag het beste door gebruik te maken van de BuOH extrusiemethode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp en klonen van amfifiele elastine-achtige eiwitten (ELP's)
- Kloon en ontwerp de constructies zoals elders beschreven8,20. Plasmids zijn beschikbaar op aanvraag.
2. Eiwitexpressie, zuivering en bereiding
- Expressie van F20E20-mEGFP en F20E20-mCherry
- Inenting belangrijkste expressie cultuur van 's nachts pre-cultuur aan een OD600 van 0,3. Incubeer bij 37 °C, 200 tpm in steriel 400 mL LB medium aangevuld met toegeëigende antibiotica in een kolf van 2 L.
- Bereid IPTG-voorraadoplossing (1 M) voor op inductie van de expressiecultuur in ultrazuiver water.
- Wanneer OD600 0,5–0,8 is bereikt, voegt u IPTG toe aan expressiecultuur tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en verlaagt u de incubatietemperatuur tot 20 °C. Laat expressie bij 20 °C voor ongeveer 20 uur bij 200 rpm.
- Expressie van amfifiele ELP met UAA pAzF
- Inenting belangrijkste expressie cultuur van 's nachts E. coli pre-cultuur met de twee plasmiden pEVOL pAzF en bijvoorbeeld pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his tot een OD600 van 0,3 (zie aanvullende informatie voor aminozuur sequenties). Incubeer bij 37 °C, 200 tpm in steriel 400 mL LB medium aangevuld met kanamycine en chlooramfenicol in een kolf van 2 L.
- Bereid 100 mM pAzF voorraadoplossing in ultrazuiver water. Voor 10 mL pAzF voorraad oplossing, wegen 206.2 mg pAzF en resuspend it in 8 mL van ultrazuiver water. Om de pAzF op te lossen verhoog de pH van de oplossing met 3 M NaOH en meng krachtig. Wanneer pAzF is opgelost, verlaagt u de pH voorzichtig tot 10,5 en voegt u ultrazuiver water toe aan een eindvolume van 10 mL. Gebruik een steriel filter (0,22 μm) en aliquot de oplossing in 2 mL reactiebuizen.
- Bereid 1 M IPTG voorraadoplossing voor in ultrazuiver water en 20% arabinose voorraadoplossing in ultrazuiver water.
- Wanneer OD600 0,5–0,8 wordt bereikt, voegt u pAzF toe aan de expressiecultuur aan een uiteindelijke concentratie van 2 mM. Incubatiecultuur gedurende 10 min, 37 °C, 200 rpm om pAzF-opname mogelijk te maken.
- Expressie van doeleiwit en expressie van het noodzakelijke tRNA/t-RNA synthetase opwekken via gelijktijdige toevoeging van IPTG (1 mM) en arabinose (2%) en de incubatietemperatuur te verlagen tot 20 °C.
- Laat expressie bij 20 °C voor ongeveer 20 uur bij 200 rpm. De uitdrukkingscultuur van de oogst door centrifugering bij 4 °C, 4000 x g, 40 min.
- Cellyse en eiwitzuivering
- Storing de E. coli-pellet opnieuw op in lysisbuffer (10 mL per liter cultuur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) met lysozyme (0,1 mg/mL) en PMSF (0,1 mM). Incubeer gedurende 30 min op ijs en vries en ontdooi daarna tweemaal door het monster onder te dompelen in vloeibare stikstof.
- Sonicate de vering (30%, 15 keer, 30 s: 10 s break) en maak het lysaat vrij via centrifugering (4 °C, 10.000 x g voor 40 min).
- Eiwit zuiveren met behulp van affiniteitschromatografie (bijvoorbeeld op een nikkelkolom van 1 mL met behulp van een FPLC-systeem dat is aangesloten op een fractiecollector; zie Materiaaltafel). Maak het eiwit los met elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250-500 mM imidazool) en bewaar bij 4 °C tot verdere verwerking.
- Analyseer de zuiveringsefficiëntie via SDS-PAGE.
3. Wijziging van elp's via SPAAC
- Een schatting van de concentratie van de ELP-oplossing. Een280 absorptie voor concentratie-evaluatie is niet waardevol, omdat pAzF-R40F20 sequentie ontbreekt aminozuren absorberen in het UV-bereik. Daarom kan een eerder lyofielende en gewogen ELP-amfifiel worden gebruikt als referentie voor sds-paginabandvergelijking. Door vergelijking van de samengevatte grijswaardeintesiteit van SDS PAGE-banden van ELP-oplossingen met bekende concentraties en uw monster kan de ruwe concentratie van uw monster worden geschat.
- Voeg 1 μL fluorescerende kleurstof BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM voorraadoplossing; 20 μM eindconcentratie) toe aan 500 μL ELP-oplossing (~20 μM). Incubeer de reactie ongeveer 10 uur bij 15 °C, tijdens het schudden en beschermd tegen licht.
- Voor verder gebruik, dialyseren de reactie om overmatige BDP te verwijderen.
- Equilibrate een dialysemembraan (b.v. 12 kDa cutoff) in ultrazuiver water gedurende 10 min. Snijd het dialysemembraan in de juiste maat die bovenop de opening van een reactiebuis met de aangeklikte ELP-oplossing moet worden geplaatst. Om het dialysemembraan in de opening te fixeren, plaatst u een reactiebuisdeksel met uitgeslagen kern op de opening, waardoor de buis wordt gesloten.
- Plaats de reactiebuis ondersteboven in de gekozen buffer. Wissel de buffer (2-5 L) twee keer na dialyse gedurende ten minste 3 uur per keer. Verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het dialysemembraan en de buffer om een succesvolle dialyse te garanderen.
4. THF zwelling protocol
- Dialyze homogene ELP-oplossing tegen fosfaat- of trisbuffer (10 mM) met stabiele pH 7,5 om zouten en resterende verbindingen uit zijn tagzuivering te verwijderen.
- Bereid de lyofiever en koel af tot de begintemperatuur voor vriesdrogen.
- Aliquot de gedialyseerde eiwitoplossing in 1,5 mL reactiebuizen (50-500 μL per buis) en schokvries in vloeibare stikstof. Om ongewenste vermenging van verschillende eiwitoplossingen tijdens het vriesdrogen te voorkomen, kunnen doppen met een klein gaatje op de reactiebuis worden geplaatst om het gedeeltelijk te verzegelen.
- Neem de bevroren eiwitmonsters uit de vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in de lyofielemachine om te beginnen met vriesdrogen. Het vriesdrogen is voltooid wanneer het monster volledig droog is (ongeveer 24-48 uur). Vervolgens ventileren lyofiele amfifiele ELPs met droge N2, dan onmiddellijk sluiten de reactie buis deksels om contact met vocht te voorkomen.
- Voeg pure THF toe aan de lyofiele monsters (ELP, 5-10 μM) en plaats de oplossing in een waterbadsonicator met ijswater gedurende 15 min om zwelling van de ELP in THF mogelijk te maken.
- Verwarm een thermocycler voor op 30-60 °C voor blaasvorming of tot 90 °C voor vezelvorming en bereid nieuwe reactiebuizen voor die ultrazuiver water of buffer bevatten (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 5-13). Sferische coacervaten assembleren zich voornamelijk bij 20 °C binnen pH 9-13. De vesitevorming wordt goedgekeurd bij 50-60 °C tussen pH 7 en 9. Vezelvorming wordt predominently geïnduceerd boven 60 °C tussen pH 5 en 12.
- Plaats na de sonicatiestap de ELP/THF-oplossing en de voorbereide ultrazuivere water- of bufferoplossing in de thermocycler en verwarm tot de gewenste temperatuur gedurende 5 min. Wanneer de temperatuur is bereikt, moet de voorverwarmde ELP/THF-oplossing zorgvuldig worden gestratificeerd bovenop het voorverwarmde ultrazuivere water- of bufferoplossing. Een duidelijke scheiding van de twee fasen met een aparte interface moet zichtbaar zijn.
- Plaats het mengsel opnieuw in de thermocycler en incubeer gedurende 20 min om vesicle- of vezelvorming op de interface mogelijk te maken. Laat de monsters daarna 10 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voor analyse via fluorescentiemicroscopie of dialyse.
- Dialyze oplossing met de supramoleculaire structuren tegen ultrazuiver water of buffer (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).
5. BuOH extrusieprotocol
- Bereid een 1-50 μM ELP-oplossing in ultrazuiver water of buffer (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, kan maximaal 4 M urea bevatten). De concentratie van de amfifiele ELP F20R20-mEGFP- en F20R20-mCherry-oplossing kan worden bepaald aan de hand van de molaire uitstervingscoëfficiënten (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 en F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (zie aanvullende informatie voor aas-sequentie).
- Voeg 10%-20% (v/v) 1-butanol toe en meng de oplossing onmiddellijk door meerdere keren op en neer te ponsen of op te stellen door middel van een spuit. Een gewone 100 μL pipet of Hamilton spuit uitgerust met een 0,25 x 25 mm naald kan worden toegepast. De troebelheid van de oplossing tijdens het mengen moet toenemen, wat duidt op blaasvorming. 1-octanol 5%–15% (v/v) kan ook worden gebruikt voor vesicle extrusie in plaats van 1-butanol.
- Om een smalle verdeling van de grootte te bereiken, extrudert u blaasjes met behulp van een mini-extruder door een membraan met een poriegrootte van 1 μm bij kamertemperatuur. De membraangrootte die wordt gebruikt voor extrusie bepaalt de bovenste grootte cutoff van de blaasjes.
- Ga de blaasjes zoals hierboven beschreven (stap 3.3) dialyseren om de resterende 1-butanol te verwijderen.
6. Kleurstof inkapseling met het BuOH extrusieprotocol
- Meng ongeveer 40 μL ELP-oplossing in 10 mM Tris-HCl, pH 8 met 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL eindconcentratie).
- Voeg 10 μL BuOH toe aan de oplossing en extrudeer 5-10 keer door een spuit uitgerust met een naald van 0,25 x 25 mm.
7. Analyse van supramoleculaire structuren met behulp van fluorescentiemicroscopie
- Plaats een wapeningsring op een glazen schuif en druk de kleefzijde stevig op het glas.
- Voeg 5 μL van het monster toe aan de binnenkant van de wapeningsring en plaats er een afdekslip bovenop.
- Sluit het monster af met nagellak aan de randen van de afdekkingsslip om verdamping van het monster tijdens de analyse te voorkomen.
- Uitvoeren van fluorescentiemicroscopie zoals eerder beschreven8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protocolontwikkeling voor de productie van blaasjes
Figuur 1 schetst de twee verschillende methoden voor de bereiding van blaasjes. De THF zwellingsmethode aan de linkerkant bestaat uit drie opeenvolgende stappen en resulteert in verschillende supramoleculaire samenstellingen van de ELP, afhankelijk van de temperatuur. In figuur 1A epifluorescentiemicroscopie beelden tonen blaasjes samengesteld uit BDP-R20F20 en fibrillaire structuren samengesteld uit BDP-R40F20. De BuOH-methode, geïllustreerd aan de rechterkant, leidt uitsluitend tot de vorming van ELP-blaasjes, waardoor ongeveer twee ordes van grootte meer blaasjes opleveren in vergelijking met de THF-zwellingsmethode. De schematische illustratie toont het voorbereidingsproces van BuOH-blaasjes. Voor vesicle voorbereiding in figuur 1B BDP-R40F20 werd gemengd met 10-15% (v/v) BuOH en blaasjes werden bereid via extrusie van het mengsel.
Het begeleiden van supramoleculaire zelfassemblage in verschillende structuren
Figuur 2 toont een schematische illustratie en epifluorescentiebeelden van verschillende supramoleculaire structuren die via het THF-zwellingsprotocol uit BDP-R40F20 zijn samengesteld. In dit geval werd lyophilized BDP-R40F20 gebruikt voor de verschillende assemblageprotocollen. De pH van de buffer en de temperatuur van het assemblageproces werden aangepast om coacervates, fibrils of blaasjes te vormen. De coacervaten afgebeeld in figuur 2A hebben een diameter van 1-2 μm en zijn geassembleerd van BDP-R40F20 bij 20 °C en pH 13. Aanpassing van de montagetemperatuur tot 90 °C resulteert in de vorming van nanovezelbundels (figuur 2B) bij pH 4-13 getest met BDP-R40F20. Stabiele blaasjes kunnen uit de ELP worden gemonteerd bij een temperatuur van 50 °C en pH 7 (figuur 2C). Kleine fouten bij een van de cruciale stappen in het assemblageprotocol kunnen leiden tot de vorming van aggregaten afgebeeld in figuur 2D.
Inkapseling van verschillende ladingen
Figuur 3 toont de inkapseling van verschillende lading in het blaasje van blaasjes die via de BuOH extrusiemethode uit F20R20-mEGFP zijn geassembleerd. Voor de inkapseling van de positief geladen kleurstof Atto Rho13 in figuur 3A,werd de kleurstof gemengd met de waterige ELP-oplossing vóór toevoeging van (15% v/v) BuOH en spuitextrusie van het mengsel. De confocale microscopie beelden tonen de blaasjes gevormd uit F20R20-mEGFP in het groene kanaal, de rode kleurstof AttoRho13 in het rode kanaal en de resulterende samengevoegde kanaal toont de succesvolle inkapseling in het blaasje lumen.
De polysaccharide Dextran Red 3000 werd met succes ingekapseld met behulp van de BuOH extrusie methode zoals hierboven beschreven. Beelden opgenomen in groen kanaal tonen de blaasjes gevormd uit F20R20-mEGFP, terwijl rode kanaal toont de polysaccharide lading. Samengevoegde groene en rode afbeelding in figuur 3B bevestigen de succesvolle Dextran Red 3000 inkapseling in het blaasje lumen.
Compatibiliteit van membraancomponenten en fasescheiding van gemengde BuOH-blaasjes voor/na extrusie
Figuur 4 toont het fasescheiding- en fusiegedrag van ELP-amfifielen bij het mengen van enkele PMBC-bouwstenen versus geassembleerde PMBC-populaties. Het mengen van amfifiele ELP bouwstenen (F20R20-mEGFP en F20R20-mCherry) voorafgaand aan PMBC assemblage leidt tot homogen verdeelde moleculen in het geassembleerde PMBC membraan. De homogene verdeling van de fluorophoren en geassocieerde ELP-amfifielen is duidelijk bij het samenvoegen van het rode en groene kanaal van de respectieve fluorescentiebeelden. Door het mengen van blaasjepopulaties die zijn samengesteld uit f20R20-mEGFP of F20R20-mCherry zijn duidelijk zichtbare membraanvlekken van rode of groene fluorescentie direct na het mengen zichtbaar. Dit geeft aan dat PMBC-fusiegebeurtenissen van verschillend gelabelde PMBC's optreden en dat deze splijtende membranen en hun bestanddelen gedurende ten minste 20 min gescheiden blijven. Een soortgelijke fase gedrag is bekend van lipide vlotten, binnen lipide membranen23.
Figuur 1: Illustratie van de THF-zwellingsmethode en de BuOH-extrusiemethode voor de geleide zelfassemblage van amfifiele ELPs in supramoleculaire structuren zoals blaasjes of vezels. Schematische workflow en representatieve epifluorescentiebeelden van (A) de THF-zwellingsmethode met BDP-R20F20 en BDP-R40F20 resulterend in verschillende supramoleculaire structuren, afhankelijk van temperatuur en pH en (B) de BuOH extrusiemethode die uitsluitend blaasjes van BDP-R40F20 oplevert (schaalbalk 2 μm). Dit cijfer is gewijzigd van Schreiber et al. 20198. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Door toepassing van de THF zwelling methode BDP-R40F20 zelf-assembleert in verschillende supramoleculaire structuren. De omgevingscondities die tijdens het assemblageprotocol worden toegepast (bijvoorbeeld temperatuur of pH) bepalen de overheersende supramoleculaire structuur die wordt gevormd. Representatieve supramoleculaire structuren aan de respectieve omstandigheden tijdens de assemblage werden gecontroleerd via epifluorescentiemicroscopie en variëren van (A) coacervaten en (B) fibrils tot (C) stabiele blaasjes. (D) Falen in de assemblage van gedefinieerde structuren tijdens het THF-zwellingsprotocol leidt tot de vorming van niet-specifieke aggregaten (schaalbalk 2 μm). Dit cijfer is gewijzigd van8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Verschillende ladingen kunnen worden ingekapseld in ELP-blaasjes met behulp van de BuOH-extrusiemethode. (A) toont representatieve confocale beelden van F20R20-mEGFP blaasjes met ingekapselde positief geladen kleurstof AttoRho13 en (B) de inkapseling van de polysaccharide dextran rood (schaal balk 5 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Membraancomponentcompatibiliteit en fusiegedrag van blaasmembranen die via BuOH-extrusiemethode uit F20R20 zijn geassembleerd. (A) Het mengen van fluorescerende F20R20-mEGFP en F20R20-mCherry eiwitoplossing voorafgaand aan spuit-extrusie leidt tot PMBC membranen met homogeen gedistribueerde amfifiele eiwitten zichtbaar in groen kanaal (linker afbeelding), rood kanaal (middelste afbeelding), en samengevoegd kanaal (rechts beeld). (B) PMBC's die zijn samengesteld uit F20R20-mEGFP of F20R20-mCherry en vervolgens gemengd via spuitextrusieleiden tot gescheiden ELP-amfifiele patches in de PMBC-membranen. De gescheiden ELP-amfifielen in het membraan zijn zichtbaar na pmbc-fusie gedurende ten minste 20 minuten in groen kanaal (linkerafbeelding), rood kanaal (middelste afbeelding) en het samengevoegde kanaal (rechterafbeelding). Schaalbalken komen overeen met 5 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Schreiber et al. 20198. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een fout bij het volgen van de beschreven protocollen voor de assemblage van gedefinieerde supramoleculaire structuren leidt voornamelijk tot de vorming van niet-specifieke aggregaten(figuur 2, IV) of tot homogeen verdeelde ELP-amfifielen. Kritieke stappen van het protocol worden hieronder besproken:
Voor een hoge expressieopbrengst van de amfifiele ELP is een relatief lage temperatuur van 20°C optimaal. Voor een succesvolle affiniteitsgebaseerde zuivering van de amfifiele ELP werd bewezen dat een urereomconcentratie van 4 M in de lysisbuffer de amfifiele ELP het best kan opleiden en de eiwitopbrengst in de oplosbare elutiefractie verhoogt. Als lagere urereaconcentraties in de lysebuffer gewenst zijn, moet affiniteitszuivering worden getest op de afzonderlijke constructies. 2 M urea werkte ook voor sommige constructies, vooral voor degenen waar de His-tag werd gesmolten aan het hydrofiele domein en dus nog steeds in staat om de hars te binden. Een extra zuiveringsstap na Zijn-tag zuivering via grootte uitsluiting chromatografie kan verhogen de blaasje opbrengst ook.
In het geval van toepassing van de THF-zwelling protocol, de amfifiele ELP moet worden gelabeld met een fluorescerende organische kleurstof voor visualisatie. Belangrijk voor de BDP-etikettering van de amfifiele ELP (zie aanvullende informatie voor aminozuursequenties met UAA pAzF) via SPAAC is de afwezigheid van reductant zoals TCEP, DTT of β-mercaptoethanol in alle zuiveringsbuffers. Dit is nodig om te voorkomen dat de goed gemelde azide aan amine reductie van pAzF voorafgaand aan de SPAAC reactie24.
De exacte reactie van kleurstof op amfifielelEL (bijvoorbeeld pAzF-R40F20) is niet van cruciaal belang, omdat het niet nodig is om elke ELP-molecuul te etiketteren voor eenvoudige blaasvisualisatie via epifluorescentiemicroscopie. Daarom is de correlatie van een referentie SDS-gelband en het overeenkomstige gewogen gelyofiliseerde monster slechts één keer nodig voor elke eiwitconstructie. Echter, als bijna 100% etikettering opbrengst gewenst is een verhouding van 1:1 equivalenten kleurstof aan ELP moleculen is voldoende. Zeer gelijkaardige amfifiele ELP's werden in ons lab geanalyseerd om volledig te worden gelabeld op een equimolaire toevoeging van BDP (gegevens die nog niet zijn gepubliceerd).
Voor blaasjes voorbereiding met behulp van de THF zwelling methode, de meest kritische stappen zijn de zwelling van lyofiele amfifiele ELP en de daaropvolgende stratificatie van deze oplossing op de top van de waterige bufferfase. Daarom moet de vers lyofiele amfifiele ELP zo watervrij mogelijk zijn, wat kan worden bereikt door ventilatie van de lyofielegas met droog stikstofgas en onmiddellijke sluiting van de reactiebuisdeksels. Indien beschikbaar, moet septum verzegelde droge THF worden gebruikt om de blaasopbrengst te verhogen, maar THF p.a. (>99,5%) zonder septum werkt ook. De stratificatie stap op zwelling van de amfifiele ELP in droge THF moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd. Succesvolle gelaagdheid van de twee temperatuurgecontroleerde oplossingen leidt tot een duidelijk zichtbare fasegrens tussen organische en waterige fase. De eerste stratificatiestap moet langzaam worden uitgevoerd, ook al leiden verhoogde temperaturen tot thermisch geïnduceerde vermenging van deze fasen. Emergent troebelheid van de oplossing is te wijten aan lichte verstrooiing van gevormde blaasjes, vezels of coacervates. In controle monsters ontbreekt het eiwit, geen troebelheid verschijnt hoewel kleine structuren (tot 200 nm) worden gemeld voor de THF water-interface25. De THF stratificatie stap is de meest kritische en falen gevoelige stap van de zwelling protocol. Na de incubatiestap kunnen de supramoleculaire structuren tegen buffer of ultrazuiver water worden gedialyseerd. Bij voorkeur moet dezelfde waterige oplossing worden gebruikt die voor de eerste montage werd toegepast om de osmolariteit te handhaven en zwelling of inkrimping van de geassembleerde blaasjes te voorkomen. Na dialyse zijn de blaasjes, vezels en coacervaten meestal minstens een week stabiel. Afhankelijk van de omgevingsparameters tijdens de montage is vaak een klein deel van andere supramoleculaire structuren naast de hoofdstructuur aanwezig als de THF-zwellingsmethode wordt toegepast8. De beschreven THF-methode verhoogt de opbrengst van de blaasassemblage met één orde van grootte, terwijl de BuOH-extrusie de opbrengst met drie ordes van grootte verbetert in vergelijking met onze eerder gepubliceerde in vitro methode5.
De BuOH extrusiemethode wordt toegepast om uitsluitend stabiele vesiculaire structuren met een hoge reproduceerbaarheid te verkrijgen, vezels en sferische coacervaten te omzeilen. Deze methode is minder foutgevoelig en compatibel met fluorescerende eiwitten. Daarom kan F20R20-mEGFP of F20R20-mCherry worden toegepast, evenals BDP-R40F20 of BDP-E20F20. De enige kritische stap is het snel mengen van de waterige eiwitoplossing na toevoeging van 10%-20% v/v BuOH. De F20R20-mEGFP- of F20R20-mCherry-concentratie moet ongeveer 1-15 μM bedragen. Door het toepassen van BuOH extrusie methode blaasjes kunnen worden gemonteerd in ultrazuiver water of buffer met maximaal 5 M NaCl of 4 M urea en pH variërend van 5 tot 8. Geëxtrudeerde PMBC's in 20% v/v BuOH kunnen gedurende ten minste 6 maanden bij 4°C worden opgeslagen met behoud van hun vesiculaire structuur. Om de verdeling van de grootte van de blaas te verkleinen, kunnen ze worden geëxtrudeerd met behulp van een mini-extruder door een membraan van 0,2-1 μm poriegrootte. Deze porie extrusie kan direct worden gedaan na BuOH toevoeging aan de amfifiele ELP of na blaasje montage. Als PMBC's te geconcentreerd zijn voor beeldvorming, kunnen geassembleerde blaasjes in BuOH worden verdund door snel mengen met behulp van waterige buffer met 10%-20% v/v BuOH.
De belangrijkste beperking van de BuOH extrusie methode is dat PMBC dialyse tegen waterige buffers resulteert vaak in een slechte blaasje opbrengst. Verder kan de aanwezigheid van resterende BuOH in de membraanruimte niet worden uitgesloten, omdat eenvoudige vetzuren in het PMBC-membraan21konden worden opgenomen. Daarom kunnen PMBC membranen tot op zekere hoogte bestaan uit eiwitten en alkanolmoieties.
Inkapseling van chemisch diverse ladingmoleculen werkt het beste met behulp van de BuOH extrusiemethode. Verder, DMSO als oplosmiddel voor de voorraad oplossing van de kleurstof te vangen verhoogt de kleurstof inkapseling efficiëntie. Voor delicate lading die moet worden ingekapseld, kan 5%–10% v/v 1-octanol worden gebruikt voor PMBC-assemblage en is bewezen beter compatibel te zijn, in vergelijking met BuOH, met functionele ingekapselde enzymen zoals DNA-ligase of TEV protease21,26. Echter, als gevolg van de kortere kettinglengte van n-butanol kan het worden dialyzed tegen waterige buffer in tegenstelling tot 1-octanol, die niet in staat is om de toegepaste dialyse-membraan doordringen. Een andere methodebeperking is dat de toegepaste temperaturen en pH-waarden die nodig zijn om de gewenste suprastructuurvorming te controleren, de enzymactiviteit kunnen beïnvloeden. In toekomstige werkzaamheden moet affiniteitszuivering of grootte-uitsluitingszuivering worden opgezet om niet-ingekapselde versus ingekapselde moleculen te scheiden zonder de integriteit van het blaasvlies te verslechteren.
In tegenstelling tot film rehydratie methoden16,17 de hierin beschreven protocollen maken de assemblage van blaasjes maten groter dan 600 nm. Dit maakt het mogelijk om real-time fusiegebeurtenissen te monitoren door middel van eenvoudige epifluorescentiemicroscopie en de observatie van membraanfasescheiding8. Vergeleken met temperatuur geactiveerdvesiculaire assemblage van amfifiele ELP9 de protocollen hier beschreven opbrengst PMBC met een lange tijd stabiliteit van maximaal 6 maanden. Het belangrijkste nadeel is echter de behoefte aan organisch oplosmiddel voor structuurvorming. Hoewel BuOH de integriteit en functie van fluorescerende eiwitten27 volledig behoudt (gegevens die niet worden weergegeven), kan de activiteit van ingekapselde enzymen worden beperkt door restorganisch oplosmiddel en moet deze afzonderlijk worden getest. Echter, katalytische reacties waarbij DNA-ligase, TEV-protease en lipase zijn met succes uitgevoerd binnen de luminale ruimte van de blaasjes, geassembleerd door 1-octanol of BuOH extrusie26,21. Bovendien, hoewel THF dialyse na de montage is zeer probleemloos en blaasje integriteit wordt bewaard, de BuOH verwijdering resulteert vaak in verlies van blaasje integriteit als gevolg van onbekende redenen.
De beschreven protocollen stellen onderzoekers in staat om micrometer- en submicrometergrote supramoleculaire structuren te monteren met verschillende fysisch-chemische eigenschappen, goede inkapselingseigenschappen en lange tijd stabiliteit. Deze supramoleculaire structuren kunnen worden toegepast voor het ontwerp van minimale cellen26 of kunstmatige cel onderzoek21, enzym inkapseling, of drug formulering. De gepresenteerde functionele PMBC's zijn verder veelbelovende kandidaten voor de levering van geneesmiddelen, omdat hun bouwstenen niet immunogeen28zijn, dynamisch fusiegedrag vertonen en diverse ladinginkapseling mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken de BMBF voor financiële steun en het Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) voor het verstrekken van de onderzoeksfaciliteit. We zijn P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californië, VS dankbaar voor het verstrekken van de plasmid pEVOL-pAzF. Wij danken de medewerkers van het Life Imaging Center (LIC) in het Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) van de Albert-Ludwigs-University Freiburg voor hulp met hun confocale microscopie middelen, en de uitstekende ondersteuning bij beeldopname.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
