Summary
À l’interface des solvants organiques et aqueux, les protéines amphiphiliques sur mesure de type élastine s’assemblent en structures supramoléculaires complexes telles que les vésicules, les fibres et les coacervates déclenchés par des paramètres environnementaux. Les protocoles d’assemblage décrits donnent des compartiments à base de membrane protéique (PMBCs) avec des propriétés de thon, permettant l’encapsulation de diverses cargaisons.
Abstract
Les blocs de construction protéinés sur mesure sont des candidats polyvalents pour l’assemblage de structures supramoléculaires telles que des cellules minimales, des véhicules de livraison de médicaments et des échafaudages enzymatiques. En raison de leur biocompatibilité et de leur thonibilité sur le plan génétique, les protéines elastin (PEL) sont des éléments constitutifs idéaux pour les applications biotechnologiques et biomédicales. Néanmoins, l’assemblage de structures supramoléculaires basées sur des protéines avec des propriétés physiochimiques distinctes et un bon potentiel d’encapsulation demeure difficile.
Ici, nous fournissons deux protocoles efficaces pour l’auto-assemblage guidé des PEL amphiphiles dans des architectures de protéines supramoléculaires telles que les coacervates sphériques, les fibres et les vésicules stables. Les protocoles d’assemblage présentés génèrent des compartiments à base de membrane protéique (PMBC) basés sur les PEL ayant des propriétés physicochimiques adaptables. Les PMBC démontrent le comportement de séparation de phase et révèlent la fusion de membrane dépendante de la méthode et sont capables d’encapsuler des molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses. Les PMBC qui en résultent ont un potentiel d’application élevé en tant que plate-forme de formulation et d’administration de médicaments, de cellules artificielles et d’espace de réaction compartimenté.
Introduction
L’assemblage de structures supramoléculaires pour les applications biotechnologiques devient de plus en plus important1,2,3,4,5. Pour l’assemblage d’architectures fonctionnelles telles que les coacervates, les vésicules et les fibres avec les propriétés physicochimiques souhaitées, il est important de comprendre et de contrôler les propriétés physicochimiques et conformationnelles des composants. En raison de la précision moléculaire des molécules présentes dans la nature, les blocs de construction des structures supramoléculaires sont de plus en plus basés sur les lipides, les acides nucléiques ou les protéines. Comparés aux polymères synthétiques, les blocs de construction protéinés permettent un contrôle précis sur les structures supramoléculairesémergentes 6 sur le plan génétique. La séquence primaire d’acide aminé (aa) des blocs de construction de protéines individuelles code intrinsèquement l’information pour leur potentiel d’assemblage du niveau moléculaire jusqu’au niveau macroscopique ainsi que la forme tridimensionnelle et les propriétés physiques de la structure supramoléculaire finale7.
Les méthodes signalées pour l’assemblage de différentes structures supramoléculaires impliquent souvent des protéines amphiphiles telles que des protéines sensibles à l’élastine sensible à la température (PEL)5,8,9, oléosine recombinante10et des amphiphiles protéinés artificiels11. Les méthodes déclenchées par la température ont conduit à l’assemblage de micelles4,10,12Fibres13Feuilles14et les vésicules9,15,16. Des méthodes impliquant des solvants organiques ont été appliquées pour la formation de vésicules dynamiques à base de protéines8,11,14. Jusqu’à présent, les protocoles appliqués pour la formation de vésicules manquent souvent de contrôle d’assemblage sur les assemblages de taille de micromètres16,17ou ont un rendement d’assemblage limité5. En outre, certains vésicules à base de PEL signalés ont un potentiel d’encapsulation altéré12ou une stabilité limitée au fil du temps9. En s’attaquant à ces inconvénients, les protocoles présentés permettent l’auto-assemblage de structures supramoléculaires de micromètre et de micromètres de taille avec des propriétés physiochimiques distinctes, un bon potentiel d’encapsulation et une stabilité de longue date. Les PEL amphiphiles sur mesure s’assemblent en structures supramoléculaires, allant des coacervates sphériques et des faisceaux de fibres torsadées très ordonnés aux vésicules nonilamellar selon le protocole appliqué et les conditions environnementales associées. Les grands compartiments à base de membrane protéique vésiculaire (PMBC) révèlent tous les phénotypes principaux tels que la fusion de membrane et le comportement de séparation de phase analogue aux liposomes. Les PMBC encapsulent efficacement les molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses qui peuvent être surveillées à l’aide d’une simple microscopie épifluorescence. Les domaines répétitifs du PEL utilisés dans cette étude sont des éléments constitutifs attrayants pour les architectures supramoléculaires à base de protéines18. L’unité de répétition de pentapeptide ELP (VPGVG) est connue pour tolérer différentes aa en plus de proline à la quatrième position (valine, V), tout en préservant ses propriétés structurelles et fonctionnelles19. La conception de PEL amphiphiles contenant des domaines hydrophiles et hydrophobes distinctifs a été réalisée en insérant des résidus d’invités aa (X) dans la répétition VPGXG avec hydrophobicité distincte, polarité, et charge20. Domaines amphiphiliques DE PEL où équipés de phénylalanine hydrophobe (F) ou d’isoleucine (I) tandis que le domaine hydrophile contenait de l’acide glutamique chargé (E) ou de l’arginine (R) comme résidus d’invités. Une liste des constructions de PEL amphiphiles admissibles et des séquences aa correspondantes se trouve dans les informations et références supplémentaires8,21. Tous les blocs de construction lorsqu’ils sont équipés de petites colorants fluorescentes ou de protéines fluorescentes pour la visualisation par microscopie à fluorescence. MEGFP et d’autres protéines fluorescentes ont été fusionnées en A-terminalement dans les domaines hydrophiles des amphiphiles du PEL. Les colorants organiques ont été conjugués par l’intermédiaire d’une souche sans cuivre promue cycloaddition alkyne-azide (SPAAC) à un acide aminé non naturel co-translationnellement introduit (UAA). L’incorporation co-translationnelle de l’UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22permet la modification N-terminale du domaine hydrophile PEL. De cette façon, le colorant fluorescent vert BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou toute petite molécule fluorescente avec un cyclooctyne tendu peut être utilisé comme sonde fluorescente. L’incorporation réussie de l’UAA pAzF et la cycloaddition du colorant via SPAAC peut être facilement confirmée par l’intermédiaire de LC-MS/MS en raison de l’ionisation efficace des peptides tryptiques correspondants8. Ce petit colorant organique a été appliqué pour élargir le choix de solvant pour les protocoles d’assemblage, puisque les protéines fluorescentes sont incompatibles avec la plupart des solvants organiques. Les deux protocoles d’assemblage les plus efficaces pour les structures supramoléculaires développées dans notre laboratoire sont décrits ci-dessous. La méthode de gonflement THF est seulement compatible avec le PEL amphiphilique modifié de colorant organique. En revanche, la méthode d’extrusion de 1 butanol (BuOH) est compatible avec de nombreuses protéines comme sonde fluorescente, par exemple mEGFP, puisque la méthode décrite préserve entièrement la fluorescence de ces protéines de fusion. En outre, l’encapsulation de petites molécules et le comportement de fusion vésiculaire fonctionne mieux en employant la méthode d’extrusion BuOH.
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Protocol
1. Conception et clonage de protéines amphiphiles ressemblant à de l’élastine (PEL)
- Clone et concevoir les constructions comme décrit ailleurs8,20. Les plasmides sont disponibles sur demande.
2. Expression, purification et préparation des protéines
- Expression de F20E20-mEGFP et F20E20-mCherry
- Inoculer la culture d’expression principale de la pré-culture du jour au lendemain à un OD600 de 0,3. Incuber à 37 oC, 200 tr/min en milieu stérile de 400 ml lB complété par des antibiotiques appropriés dans un flacon de 2 L.
- Préparer la solution de stock IPTG (1 M) pour l’induction de la culture d’expression dans l’eau ultrapure.
- Lorsque l’OD600 0.5-0.8 est atteint, ajoutez IPTG à la culture d’expression à une concentration finale de 1 mM et réduisez la température d’incubation à 20 oC. Autoriser l’expression à 20 oC pendant environ 20 h à 200 tr/min.
- Expression d’ELP amphiphile contenant UAA pAzF
- Inoculer la culture principale de l’expression de la pré-culture E. coli contenant les deux plasmides pEVOL pAzF et par exemple pET28-NMBL-(TAG)R40F20-son à un OD600 de 0,3 (voir les informations supplémentaires pour les séquences d’acides aminés). Incuber à 37 oC, 200 tr/min en milieu stérile de 400 ml lB complété par de la kanamycine et du chloramphenicol dans un flacon de 2 L.
- Préparer une solution de stock pAzF de 100 mM dans l’eau ultrapure. Pour 10 ml de solution de stock pAzF, peser 206,2 mg pAzF et le ressaisciser dans 8 ml d’eau ultrapure. Pour dissoudre le pAzF soulever le pH de la solution avec 3 M NaOH et mélanger vigoureusement. Lorsque le pAzF est dissous, abaissez soigneusement le pH à 10,5 et ajoutez de l’eau ultrapure à un volume final de 10 ml. Utilisez un filtre stérile (0,22 m) et alaïz la solution dans des tubes de réaction de 2 ml.
- Préparer 1 M de solution de stock IPTG dans l’eau ultrapure et 20% solution de stock arabinose dans l’eau ultrapure.
- Lorsque l’OD600 0.5-0.8 est atteint, ajouter pAzF à la culture d’expression à une concentration finale de 2 mM. Incuber la culture pour 10 min, 37 oC, 200 tr/min pour permettre l’absorption de pAzF.
- Induire l’expression de la protéine cible et l’expression de la synthéase t-RNA/t-RNA nécessaire par l’ajout simultané d’IPTG (1 mM) et d’arabinose (2 %) et réduire la température d’incubation à 20 oC.
- Autoriser l’expression à 20 oC pendant environ 20 h à 200 tr/min. Récoltez la culture d’expression par centrifugation à 4 oC, 4000 x g,40 min.
- lyse cellulaire et purification des protéines
- Resuspendez le granule E. coli en tampon de lyse (10 ml par litre de culture; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) contenant du lysozyme (0,1 mg/mL) et pmSF (0,1 mM). Incuber pendant 30 minutes sur la glace et congeler et décongeler deux fois par la suite en submergeant l’échantillon d’azote liquide.
- Sonicate la suspension (30%, 15 fois, 30 s: 10 s pause) et effacer le lysate par centrifugation (4 oC, 10.000 x g pour 40 min).
- Purifier les protéines à l’aide d’une chromatographie d’affinité (p. ex. sur une colonne de nickel de 1 ml à l’aide d’un système FPLC relié à un collecteur fractionnaire; voir Tableau des matériaux). Elute la protéine avec tampon d’elution (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250-500 m imidazole) et stocker à 4 oC jusqu’à traitement ultérieur.
- Analyser l’efficacité de purification via SDS-PAGE.
3. Modification de la teinture des PEL via SPAAC
- Estimer grossièrement la concentration de la solution PEL. Une absorptionde 280 pour l’évaluation de concentration n’est pas valable puisque la séquence pAzF-R40F20 manque d’acides aminés absorbant dans la gamme UV. Par conséquent, un amphiphile ELP précédemment lyophilisé et pondéré peut être utilisé comme référence pour la comparaison de bande de SDS PAGE. En comparant l’intesité de valeur grise résumée des bandes SDS PAGE des solutions ELP avec des concentrations connues et votre échantillon, la concentration approximative de votre échantillon peut être estimée.
- Ajoutez 1 L de colorant fluorescent BDP-FL-PEG4-DBCO (solution de stock de 10 mM; concentration finale de 20 M) à 500 L de solution ELP (20 m de M). Incuber la réaction pendant environ 10 h à 15 oC, tout en secouant et protégé de la lumière.
- Pour une utilisation ultérieure, dialysez la réaction pour enlever le BDP excessif.
- Équilibrer une membrane de dialyse (p. ex. 12 kDa coupure) dans l’eau ultrapure pendant 10 min. Couper la membrane de dialyse dans la bonne taille à placer sur le dessus d’un tube de réaction contenant la solution DE PEL cliquetée. Pour fixer la membrane de dialyse dans l’ouverture, placez un couvercle de tube de réaction avec le noyau perforé sur l’ouverture, fermant ainsi le tube.
- Placez le tube de réaction à l’envers dans le tampon choisi. Échangez le tampon (2 à 5 L) deux fois après la dialyse pendant au moins 3 h à chaque fois. Enlever les bulles d’air emprisonnées entre la membrane de dialyse et le tampon pour assurer une dialyse réussie.
4. Protocole d’enflure THF
- Dialysez la solution homogène de PEL contre le tampon de phosphate ou de tris (10 mM) avec le pH 7.5 stable pour enlever les sels et les composés restants de sa purification de l’étiquette.
- Préparer le lyophilizer et refroidir à la température de démarrage pour le gel-séchage.
- Aliquot la solution de protéines dialysées dans des tubes de réaction de 1,5 mL (50 à 500 ll par tube) et gel de choc dans l’azote liquide. Pour éviter le mélange indésirable de différentes solutions protéiques pendant le séchage du gel, les bouchons avec un petit trou peuvent être mis sur le dessus du tube de réaction pour le sceller partiellement.
- Sortez les échantillons de protéines congelés de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans le lyophilizer pour commencer le lyophiling. Le séchage du gel est terminé lorsque l’échantillon est complètement sec (environ 24 à 48 h). Par la suite, ventilez les PEL amphiphiles lyophilisés avec N2sec, puis fermez immédiatement les couvercles de tube de réaction pour éviter le contact avec l’humidité de l’air.
- Ajoutez du THF pur aux échantillons lyophilisés (PEL, 5 à 10 M) et placez la solution dans un sonicateur de bain d’eau contenant de l’eau glacée pendant 15 min pour permettre un gonflement du PEL dans le THF.
- Préchauffer un thermocycleur à 30 à 60 oC pour la formation de vésicules ou jusqu’à 90 oC pour la formation de fibres et préparer de nouveaux tubes de réaction contenant de l’eau ultrapure ou un tampon (50 m NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5-13). Les coacervates sphériques s’assemblent principalement à 20 oC dans le pH 9-13. La formation de Vésicule est favorisée à 50-60 oC entre pH 7 et 9. La formation de fibres est induite avant-plan au-dessus de 60 oC entre le pH 5 et 12.
- Après l’étape de sonication, placez la solution ELP/THF ainsi que l’eau ultrapure préparée ou la solution tampon dans le thermocycler et chauffez jusqu’à la température désirée pendant 5 min. Lorsque la température est atteinte, la solution ELP/THF préchauffée doit être soigneusement stratifiée au-dessus de l’eau ultrapurée préchauffée ou de la solution tampon. Une séparation claire des deux phases avec une interface distincte doit être visible.
- Remettre le mélange dans le thermocycler et incuber pendant 20 minutes pour permettre la formation de vésicule ou de fibres à l’interface. Ensuite, laissez les échantillons refroidir à température ambiante pendant 10 min avant d’être analysés par microscopie ou dialyse de fluorescence.
- Solution de dialyse contenant les structures supramoléculaires contre l’eau ou la mémoire tampon ultrapure (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).
5. Protocole d’extrusion BuOH
- Préparer une solution ELP de 1 à 50 M dans de l’eau ou un tampon ultrapure (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, peut contenir jusqu’à 4 M d’urée). La concentration de la solution amphiphile ELP F20R20-mEGFP et F20R20-mCherry peut être déterminée à l’aide des coefficients d’extinction molaires (F20R20-mEGFP A28 22015 M-1 cm-1 et F20R20-mCherry A280 -34380 M-1 cm-1) (voir les informations supplémentaires pour les séquences aa).
- Ajoutez 10 % à 20 % (v/v) 1-butanol et mélangez immédiatement la solution en le faisant monter et descendre ou en la tirant à travers une seringue plusieurs fois. Une pipette commune de 100 L ou une seringue Hamilton équipée d’une aiguille de 0,25 x 25 mm peut être appliquée. La turbidité de la solution pendant le mélange devrait augmenter, indiquant la formation de vésicule. 1-octanol 5%-15% (v/v) peut également être utilisé pour l’extrusion de vesicle au lieu de 1-butanol.
- Afin d’obtenir une distribution de taille étroite, extrude vésicules à l’aide d’un mini extrudeur à travers une membrane avec une taille de pore de 1 m à température ambiante. La taille de la membrane utilisée pour l’extrusion détermine le seuil de taille supérieure des vésicules.
- Dialysez les vésicules décrites ci-dessus (étape 3.3) pour enlever le 1-butanol résiduel.
6. Encapsulation de teinture avec le protocole d’extrusion de BuOH
- Mélanger environ 40 ml de solution ELP en 10 mM Tris-HCl, pH 8 avec 1 L Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL de concentration finale).
- Ajoutez 10 L de BuOH à la solution et extrude 5 à 10 fois à travers une seringue équipée d’une aiguille de 0,25 x 25 mm.
7. Analyse des structures supramoléculaires à l’aide de la microscopie à fluorescence
- Placez un anneau de renfort sur une glissière en verre et appuyez fermement sur le côté adhésif au verre.
- Ajouter 5 L de l’échantillon à l’intérieur de l’anneau de renfort et placer une feuille de couverture sur le dessus.
- Sceller l’échantillon avec du vernis à ongles sur les bords du couvercle pour éviter l’évaporation de l’échantillon pendant l’analyse.
- Effectuez la microscopie de fluorescence comme décrit précédemment8.
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Representative Results
Développement de protocole pour la production de vésicules
La figure 1 décrit les deux méthodes de préparation des vésicules différentes. La méthode de gonflement THF sur le côté gauche est composée de trois étapes successives et se traduit par différents assemblages supramoléculaires du PEL en fonction de la température. Dans la figure 1A, les images de microscopie à épifluorescence montrent des vésicules assemblées à partir de structures BDP-R20F20 et fibrillaires assemblées à partir de BDP-R40F20. La méthode BuOH, illustrée sur le côté droit conduit exclusivement à la formation de vésicules ELP, donnant environ deux ordres de grandeur plus de vésicules par rapport à la méthode de gonflement THF. L’illustration schématique montre le processus de préparation des vésicules BuOH. Pour la préparation des vésicules dans la figure 1B BDP-R40F20 a été mélangé avec 10-15% (v/v) BuOH et vesicles ont été préparés par extrusion du mélange.
Guider l’auto-assemblage supramoléculaire dans différentes structures
La figure 2 montre une illustration schématique et des images d’épifluorescence de différentes structures supramoléculaires assemblées à partir de BDP-R40F20 via le protocole de gonflement de THF. Dans ce cas, le BDP-R40F20 lyophilisé a été utilisé pour les différents protocoles d’assemblage. Le pH du tampon et la température du processus d’assemblage ont été ajustés pour former des coacervates, des fibrilles ou des vésicules. Les coacervates représentés dans la figure 2A ont un diamètre de 1 à 2 m et ont été assemblés à partir de BDP-R40F20 à 20 oC et pH 13. L’ajustement de la température de l’assemblage à 90 oC entraîne la formation de faisceaux de nanofibres(figure 2B) au pH 4-13 testés avec BDP-R40F20. Des vésicules stables pourraient être assemblées à partir du PEL à une température de 50 oC et de pH 7(figure 2C). De petites erreurs à l’une des étapes cruciales du protocole d’assemblage peuvent conduire à la formation d’agrégats représentés dans la figure 2D.
Encapsulation de différentes cargaisons
La figure 3 montre l’encapsulation de différentes cargaisons dans le lumen vésicule des vésicules assemblées à partir de F20R20-mEGFP via la méthode d’extrusion BuOH. Pour l’encapsulation du colorant positivement chargé Atto Rho13 dans la figure 3A, le colorant a été mélangé avec la solution aqueuse PEL avant l’ajout de (15% v/v) BuOH et l’extrusion de seringue du mélange. Les images de microscopie confocal montrent les vésicules formées à partir de F20R20-mEGFP dans le canal vert, le colorant rouge AttoRho13 dans le canal rouge et le canal fusionné résultant montre l’encapsulation réussie à l’intérieur du lumen vésicule.
Le polysaccharide Dextran Red 3000 a été avec succès encapsulé en utilisant la méthode d’extrusion BuOH comme décrit ci-dessus. Les images enregistrées dans le canal vert représentent les vésicules formées à partir de F20R20-mEGFP tandis que le canal rouge montre la cargaison de polysaccharide. L’image verte et rouge fusionnée dans la figure 3B confirme l’encapsulation réussie de Dextran Red 3000 dans le lumen vésicle.
Compatibilité des composants de membrane et séparation de phase des vésicules mélangées de BuOH avant/après l’extrusion
La figure 4 montre le comportement de séparation et de fusion de phase des amphiphiles du PEL lors du mélange des blocs de construction pmBC uniques par rapport aux populations assemblées de PMBC. Le mélange des blocs de construction amphiphiles du PEL (F20R20-mEGFP et F20R20-mCherry) avant l’assemblage du PMBC conduit à des molécules réparties de façon homogène dans la membrane assemblée de PMBC. La répartition homogène des fluorophores et des amphiphiles ELP associés est évidente lors de la fusion du canal rouge et vert des images de fluorescence respectives. En mélangeant des populations de vésicules assemblées à partir de F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry taches membrane clairement visibles de fluorescence rouge ou verte sont évidents immédiatement après le mélange. Ceci indique que les événements de fusion de PMBC de PMBCs différemment étiquetés se produisent et que ces membranes de fusion et leurs constituants restent séparés en phase pendant au moins 20 min. Un comportement de phase similaire est connu des radeaux lipidiques, dans les membranes lipidiques23.
Figure 1 : Illustration de la méthode de gonflement de THF et de la méthode d’extrusion de BuOH pour l’auto-assemblage guidé des PEL amphiphiles dans des structures supramoléculaires telles que des vésicules ou des fibres. Flux de travail schématique et images d’épifluorescence représentatives de (A) la méthode de gonflement THF avec BDP-R20F20 et BDP-R40F20 résultant en différentes structures supramoléculaires en fonction de la température et le pH et (B) la méthode d’extrusion BuOH donnant exclusivement des vésicules de BDP-R40F20 (barre d’échelle 2 m). Ce chiffre a été modifié à partir de Schreiber et al. 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : En appliquant la méthode de gonflement de THF, BDP-R40F20 s’assemble dans différentes structures supramoléculaires. Les conditions environnementales appliquées pendant le protocole d’assemblage (p. ex. température ou pH) déterminent la structure supramoléculaire prédominante formée. Les structures supramoléculaires représentatives aux conditions respectives pendant l’assemblage ont été surveillées par microscopie d’épifluorescence et vont des coacervates (A) et (B) fibrilles à (C) vésicules stables. (D) L’échec dans l’assemblage de structures définies pendant le protocole de gonflement de THF conduit à la formation d’agrégats non spécifiques (barre d’échelle 2 'm). Ce chiffre a été modifié à partir de8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Différentes cargaisons peuvent être encapsulées dans les vésicules DU PEL à l’aide de la méthode d’extrusion BuOH. (A) montre des images confocales représentatives de vesicles F20R20-mEGFP avec un colorant attoRho13 chargé positivement encapsulé et (B) l’encapsulation du polysaccharide dextran rouge (barre d’échelle de 5 m). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Compatibilité des composants de membrane et comportement de fusion des membranes vésiculées assemblées à partir de F20R20 via la méthode d’extrusion de BuOH. (A) Le mélange de la solution fluorescente F20R20-mEGFP et F20R20-mCherry avant la seringue-extrusion conduit à des membranes PMBC avec des protéines amphiphiliques distribuées de façon homogène visibles dans le canal vert (image gauche), le canal rouge (image moyenne) et le canal fusionné (image droite). (B) LES PMBC assemblés à partir de F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry et mélangés par la suite par extrusion de seringue conduisent à des taches d’amphiphile ELP séparées dans les membranes pmBC. Les amphiphiles ELP séparés dans la membrane sont visibles après la fusion de PMBC pendant au moins 20 min dans le canal vert (image de gauche), le canal rouge (image moyenne), et le canal fusionné (image droite). Les barres d’échelle correspondent à 5 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Schreiber et al. 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un défaut tout en suivant les protocoles décrits pour l’assemblage de structures supramoléculaires définies conduit principalement à la formation d’agrégats non spécifiques(figure 2,IV) ou à distribués uniformément ELP-amphiphiles. Les étapes critiques du protocole sont discutées ci-dessous :
Pour un rendement à haute expression du PEL amphiphile, une température relativement basse de 20 oC est optimale. Pour la purification basée sur l’affinité réussie du PEL amphiphile, une concentration d’urée de 4 M dans le tampon de lyse s’est avérée pour mieux solubiliser le PEL amphiphile et augmenter le rendement de protéine dans la fraction soluble d’elution. Si des concentrations plus faibles d’urée dans le tampon de lyse sont souhaitées, la purification d’affinité doit être testée pour les constructions individuelles. 2 M urée a également fonctionné pour certaines constructions, en particulier pour ceux où l’his-tag a été fusionné au domaine hydrophile et donc encore capable de lier la résine. Une étape supplémentaire de purification après la purification de son étiquette par l’exclusion de taille chromatographie peut augmenter le rendement de vesicle aussi bien.
En cas d’application du protocole de tHF-gonflement, le PEL amphiphile doit être étiqueté avec un colorant organique fluorescent pour la visualisation. Il est important de noter que pour l’étiquetage BDP du PEL amphiphile (voir les informations supplémentaires pour les séquences d’acides aminés contenant UAA pAzF) via SPAAC est l’absence de tout réducteur tel que TCEP, TNT ou mercaptoethanol dans tous les tampons de purification. Ceci est nécessaire pour éviter l’azide bien rapporté à la réduction de la amine de pAzF avant la réaction SPAAC24.
La stoichiométrie de réaction exacte de la teinture au PEL amphiphile (pAzF-R40F20) n’est pas cruciale puisqu’il n’est pas nécessaire d’étiqueter chaque molécule de PEL pour une visualisation simple de vesicle par microscopie épifluorescence. Par conséquent, la corrélation d’une bande de gel SDS de référence et de l’échantillon lyophilisé pondéré correspondant n’est nécessaire qu’une seule fois pour chaque construction de protéines. Toutefois, si près de 100% le rendement d’étiquetage est souhaité un rapport de 1:1 équivalents colorant aux molécules de PEL est suffisant. Des PEL amphiphiles très similaires ont été analysés dans notre laboratoire pour être entièrement étiquetés à un ajout équmlaire de BDP (données non encore publiées).
Pour la préparation de vésicule utilisant la méthode de gonflement de THF, les étapes les plus critiques sont le gonflement du PEL amphiphilique lyophilisé et la stratification suivante de cette solution au-dessus de la phase tampon aqueuse. Par conséquent, le PEL amphiphile fraîchement lyophilisé devrait être aussi anhydre que possible, qui peut être réalisé par la ventilation du lyophilizer avec le gaz azoté sec et la fermeture immédiate des couvercles de tube de réaction. S’il est disponible, le THF sec scellé septum devrait être utilisé pour augmenter le rendement vésiculeux, mais THF p.a. (-gt;99.5%) sans septum fonctionne aussi bien. L’étape de stratification lors de l’enflure du PEL amphiphile dans le THF sec doit être exécutée très soigneusement. La stratification réussie des deux solutions à température contrôlée conduit à une limite de phase clairement visible entre la phase organique et la phase aqueuse. L’étape initiale de stratification doit être menée lentement, même si des températures élevées conduisent à un mélange thermique induit de ces phases. La turbidité émergente de la solution est due à la diffusion de lumière des vésicules formées, des fibres ou des coacervates. Dans les échantillons témoins dépourvus de la protéine, aucune turbidité n’apparaît bien que de petites structures de taille (jusqu’à 200 nm) sont signalées pour l’interface de l’eau THF25. L’étape de stratification THF est l’étape la plus critique et sujette à l’échec du protocole d’enflure. Après l’étape d’incubation, les structures supramoléculaires peuvent être dialysées contre de l’eau tampon ou ultrapure. De préférence, la même solution aqueuse devrait être utilisée qui a été appliquée pour l’assemblage initial afin de maintenir l’osmolarité et de prévenir l’enflure ou le rétrécissement des vésicules assemblées. Après la dialyse, les vésicules, les fibres et les coacervates sont généralement stables pendant au moins une semaine. Selon les paramètres environnementaux pendant l’assemblage souvent une petite proportion d’autres structures supramoléculaires en dehors de la structure principale sont présents si la méthode de gonflement THF est appliquée8. La méthode THF décrite augmente le rendement d’assemblage de vesicle d’un ordre de grandeur tandis que l’extrusion de BuOH améliore le rendement de trois ordres de grandeur par rapport à notre méthode in vitro précédemment publiée5.
La méthode d’extrusion BuOH est appliquée pour obtenir des structures vésiculaires exclusivement stables avec une reproductibilité élevée, contournant les fibres et les coacervates sphériques. Cette méthode est moins sujette aux erreurs et compatible avec les protéines fluorescentes. Par conséquent, F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry peut être appliqué ainsi que BDP-R40F20 ou BDP-E20F20. La seule étape critique est le mélange rapide de la solution de protéines aqueous après ajout de 10%-20% v/v BuOH. La concentration F20R20-mEGFP ou F20R20-mCherry devrait être d’environ 1 à 15 m. En appliquant la méthode d’extrusion BuOH, les vésicules peuvent être assemblées dans de l’eau ultrapure ou un tampon contenant jusqu’à 5 M NaCl ou 4 M urea et pH allant de 5 à 8. Les PMBC extrudés dans 20 % v/v BuOH peuvent être stockés pendant au moins 6 mois à 4 oC tout en préservant leur structure vésiculaire. Pour réduire la répartition de la taille des vésicules, ils peuvent être extrudés à l’aide d’un mini extrudeur à travers une membrane de 0,2-1 m de taille de pores. Cette extrusion de pore peut être faite directement après l’addition buOH au PEL amphiphile ou après l’assemblage de vesicle. Si les PMBC sont trop concentrés pour l’imagerie, les vésicules assemblées à BuOH peuvent être diluées par un mélange rapide à l’aide d’un tampon aqueux contenant 10 % à 20 % v/v BuOH.
La principale limitation de la méthode d’extrusion de BuOH est que la dialyse de PMBC contre les tampons aqueux entraîne souvent un rendement vésicule pauvre. En outre, la présence de BuOH résiduel dans l’espace membranaire ne peut être exclue puisque les acides gras simples ont pu s’intégrer dans la membrane PMBC21. Par conséquent, les membranes PMBC pourraient être dans une certaine mesure être composées de protéines et d’alkanol moieties.
L’encapsulation de molécules de cargaison chimiquement diverses fonctionne mieux en utilisant la méthode d’extrusion BuOH. En outre, DMSO comme solvant pour la solution de stock du colorant à capturer augmente l’efficacité d’encapsulation de teinture. Pour que la cargaison délicate soit encapsulée, 5 % à 10 % v/v 1-octanol peut être utilisé pour l’assemblage de PMBC et s’est avéré mieux compatible, par rapport à BuOH, avec des enzymes fonctionnelles encapsulées telles que l’ADN-ligase ou la protéase TEV21,26. Cependant, en raison de la longueur plus courte de la chaîne de n-butanol, il peut être dialysé contre le tampon aqueux contrairement à 1-octanol, qui n’est pas en mesure d’imprégner la dialyse appliquée-membrane. Une autre limitation de méthode est que les températures appliquées et les valeurs de pH nécessaires pour contrôler la formation de suprastructure souhaitée peuvent affecter l’activité des enzymes. Dans les travaux futurs, la purification d’affinité ou la purification d’exclusion de taille devraient être établies pour séparer les molécules non encapsulées par rapport aux molécules encapsulées sans détérioration de l’intégrité de la membrane vésicule.
Contrairement aux méthodes de réhydratation de film16,17 les protocoles décrits ici permettent l’assemblage de tailles de vésicules supérieures à 600 nm. Cela permet de surveiller les événements de fusion en temps réel par la microscopie à épifluorescence simple et l’observation de la séparation de phase de membrane8. Par rapport à l’assemblage vésiculaire déclenché par la température du PELamphiphile 9 les protocoles décrits ici donnent PMBC avec une stabilité de temps long jusqu’à 6 mois. Cependant, le principal inconvénient est la nécessité d’un solvant organique pour la formation de la structure. Même si BuOH préserve pleinement l’intégrité et la fonction des protéines fluorescentes27 (données non montrées), l’activité des enzymes encapsulées peut être limitée par un solvant organique résiduel et doit être testée individuellement. Cependant, des réactions catalytiques impliquant l’ADN-ligase, TEV-protéase et lipase ont été menées avec succès dans l’espace luminal des vésicules, assemblés par 1-octanol ou BuOH extrusion26,21. En outre, même si la dialyse THF après l’assemblage est très peu problématique et l’intégrité vésicule est préservée, l’enlèvement BuOH entraîne fréquemment une perte d’intégrité vésicule due à des raisons inconnues.
Les protocoles décrits permettent aux chercheurs d’assembler des structures supramoléculaires de micromètre et de micromètres de taille avec des propriétés physicochimiques distinctes, de bonnes propriétés d’encapsulation et une stabilité à long terme. Ces structures supramoléculaires peuvent être appliquées pour la conception de cellules minimales26 ou de recherche cellulaire artificielle21, l’encapsulation d’enzymes, ou la formulation de drogue. Les PMBC fonctionnels présentés sont d’autres candidats prometteurs pour la livraison de médicaments, puisque leurs blocs de construction ne sont pas immunogènes28, présentent un comportement dynamique de fusion, et permettent une encapsulation de cargaison diverse.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le BMBF pour son soutien financier et le Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) d’avoir fourni le centre de recherche. Nous sommes reconnaissants à P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californie, Etats-Unis pour fournir le plasmide pEVOL-pAzF. Nous remercions le personnel du Life Imaging Center (LIC) du Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) de l’Albert-Ludwigs-University Freiburg pour l’aider avec leurs ressources de microscopie confocale, et l’excellent soutien dans l’enregistrement d’images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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