Summary
An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.
Abstract
Maßgeschneiderte proteinhaltige Bausteine sind vielseitige Kandidaten für die Montage supramolekularer Strukturen wie Minimalzellen, Wirkstoffabgabefahrzeuge und Enzymgerüste. Aufgrund ihrer Biokompatibilität und Tunabilität auf genetischer Ebene sind Elastin-ähnliche Proteine (ELP) ideale Bausteine für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen. Dennoch bleibt die Montage von proteinbasierten supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften und gutem Verkapselungspotenzial eine Herausforderung.
Hier bieten wir zwei effiziente Protokolle für die geführte Selbstmontage von amphiphilen ELPs in supramolekulare Proteinarchitekturen wie sphärische Coacervate, Fasern und stabile Vesikel. Die vorgestellten Montageprotokolle erzeugen Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) auf Basis von ELPs mit anpassungsfähigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. PMBCs zeigen Phasentrennungsverhalten und zeigen eine methodenabhängige Membranfusion auf und sind in der Lage, chemisch unterschiedliche fluoreszierende Ladungsmoleküle zu verkapseln. Die resultierenden PMBCs haben ein hohes Anwendungspotenzial als Wirkstoffformulierungs- und Abgabeplattform, künstliche Zelle und abgeschotteten Reaktionsraum.
Introduction
Die Montage supramolekularer Strukturen für biotechnologische Anwendungen wird immer wichtiger1,2,3,4,5. Für die Montage von funktionalen Architekturen wie Koacervate, Vesikel und Fasern mit den gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften ist es wichtig, die physikalisch-chemischen und konformen Eigenschaften der Komponenten zu verstehen und zu kontrollieren. Aufgrund der molekularen Präzision von Molekülen in der Natur basieren Bausteine für supramolekulare Strukturen zunehmend auf Lipiden, Nukleinsäuren oder Proteinen. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren ermöglichen proteinhaltige Bausteine eine präzise Kontrolle der entstehenden supramolekularen Strukturen6 auf genetischer Ebene. Die primäre Aminosäure(aa) Sequenz der einzelnen Proteinbausteine kodiert die Informationen für ihr Montagepotential von der molekularen bis zur makroskopischen Ebene sowie die dreidimensionale Form und physikalische Eigenschaften der endgültigen supramolekularen Struktur7.
Gemeldete Methoden zur Montage verschiedener supramolekularer Strukturen beinhalten oft amphiphile Proteine wie temperaturempfindliche Elastin-ähnliche Proteine (ELP)5,8,9, rekombinantes Oleosin10und künstliche Protein-Amphiphilen11. Temperaturausgelöste Methoden haben zur Montage von Mizellen geführt4,10,12Fasern13Blätter14und Vesikel9,15,16. Für die Bildung dynamischer proteinbasierter Vesikel wurden Methoden mit organischen Lösungsmitteln angewendet.8,11,14. Bisher fehlt es bei den angewandten Protokollen für die Vesikelbildung oft an Montagekontrolle über mikrometergroße Baugruppen.16,17oder haben eine begrenzte Montageausbeute5. Darüber hinaus haben einige berichtete ELP-basierte Vesikel ein beeinträchtigtes12oder begrenzte Stabilität im Laufe der Zeit9. Um diese Nachteile zu beheben, ermöglichen die vorgestellten Protokolle die Selbstmontage von mikrometer- und submikrometergroßen supramolekularen Strukturen mit ausgeprägten physiochemischen Eigenschaften, gutem Verkapselungspotenzial und Langzeitstabilität. Maßgeschneiderte amphiphile ELPs fügen sich zu supramolekularen Strukturen zusammen und reichen von kugelförmigen Coacervaten und hochgeordneten verdrehten Faserbündeln bis hin zu unilamelladervetriären Vesikeln, abhängig vom angewandten Protokoll und den damit verbundenen Umgebungsbedingungen. Große vesikuläre ProteinMembran-basierte Fächer (PMBC) zeigen alle Hauptphänotypen wie Membranfusion und Phasentrennungsverhalten analog zu Liposomen. PMBCs kapseln effizient chemisch vielfältige fluoreszierende Ladungsmoleküle, die mit einfacher Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können. Die in dieser Studie verwendeten sich wiederholenden ELP-Domänen sind attraktive Bausteine für proteinbasierte supramolekulare Architekturen18. Die ELP-Pentapeptid-Wiederholungseinheit (VPGVG) ist dafür bekannt, neben Prolin an der vierten Position (Valin, V) unterschiedliche Aa zu tolerieren und dabei ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften zu erhalten.19. Das Design von amphiphilen ELPs, die ausgeprägte hydrophile und hydrophobe Domänen enthalten, wurde durch einfügen von Aa-Gastrückständen (X) in die VPGXG-Wiederholung mit ausgeprägter Hydrophobie, Polarität und Ladung realisiert.20. Amphiphile ELP-Domänen, die mit hydrophoberphenylalanin (F) oder Isoleucin (I) ausgestattet sind, während die hydrophile Domäne geladene Glutaminsäure (E) oder Arginin (R) als Gästerückstände enthielt. Eine Liste der förderfähigen amphiphilen ELP-Konstrukte und entsprechenden Aa-Sequenzen finden Sie in den ergänzenden Informationen und Referenzen8,21. Alle Bausteine sind entweder mit kleinen Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen zur Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet. mEGFP und andere fluoreszierende Proteine wurden n-terminal mit den hydrophilen Domänen der ELP-Amphiphilen verschmolzen. Organische Farbstoffe wurden über kupferfreie Stämme konjugiert, die Alkyn-Azid-Cycloaddition (SPAAC) zu einer ko-translational eingeführten unnatürlichen Aminosäure (UAA) förderten. Die ko-translationale Einbeziehung der UAApara-Azidophenylalanin (pAzF)22ermöglicht die N-Terminal-Modifikation der hydrophilen ELP-Domäne. Auf diese Weise wird der grüne Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) oder jedes kleine fluoreszierende Molekül mit einem gespannten Zyklopädat kann als Fluoreszenzsonde verwendet werden. Erfolgreiche Einarbeitung des UAA pAzF und Cycloaddition des Farbstoffs über SPAAC kann durch effiziente Ionisierung der entsprechenden tryptischen Peptide einfach über LC-MS/MS bestätigt werden8. Dieser kleine organische Farbstoff wurde angewendet, um die Lösungsmittelauswahl für Montageprotokolle zu erweitern, da fluoreszierende Proteine mit den meisten organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Die beiden effizientesten Montageprotokolle für supramolekulare Strukturen, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden im Folgenden beschrieben. Die THF-Schwellungsmethode ist nur mit organischem Farbstoff modifiziertem amphiphilem ELP kompatibel. Im Gegensatz dazu ist die 1-Butanol-Extrusionsmethode (BuOH) mit vielen Proteinen wie fluoreszierender Sonde, z.B. mEGFP, kompatibel, da die beschriebene Methode die Fluoreszenz dieser Fusionsproteine vollständig bewahrt. Darüber hinaus funktioniert die Verkapselung kleiner Moleküle und das vesikuläre Fusionsverhalten am besten mit der BuOH-Extrusionsmethode.
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Protocol
1. Design und Klonen von amphiphilen Elastin-ähnlichen Proteinen (ELPs)
- Klonen und Entwerfen der Konstrukte wie an anderer Stelle beschrieben8,20. Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.
2. Proteinexpression, Reinigung und Zubereitung
- Ausdruck von F20E20-mEGFP und F20E20-mCherry
- Impfen Sie die Hauptausdruckskultur von der Übernacht-Vorkultur bis zu einem OD600 von 0,3. Bei 37 °C, 200 U/min in sterilem 400 ml LB Medium mit angeeigneten Antibiotika in einem 2-L-Kolben auftauchen.
- Bereiten Sie die IPTG-Lagerlösung (1 M) zur Induktion der Expressionskultur in Reinstwasser vor.
- Wenn OD600 0.5–0.8 erreicht ist, fügen Sie IPTG zur Ausdruckskultur zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu und reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 20 °C. Expression bei 20 °C für ca. 20 h bei 200 Umdrehungen pro Minute zulassen.
- Expression von amphiphilen ELP mit UAA pAzF
- Impfen Sie die Hauptexpressionskultur von der E. coli-Präkultur über Nacht, die die beiden Plasmide pEVOL pAzF und z.B. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his enthält, bis zu einem OD600 von 0,3 (siehe Ergänzende Informationen zu Aminosäuresequenzen). Bei 37 °C, 200 U/min in sterilem 400 ml LB Medium, ergänzt mit Kanamycin und Chloramphenicol in einem 2-L-Kolben, inkubieren.
- Bereiten Sie 100 mM pAzF Lagerlösung in Reinstwasser vor. Für 10 ml pAzF-Stammlösung 206,2 mg pAzF wiegen und in 8 ml Reinstwasser wieder aufhängen. Um den pAzF aufzulösen, erhöhen Sie den pH-Wert der Lösung mit 3 M NaOH und mischen Sie kräftig. Wenn pAzF aufgelöst wird, senken Sie den pH-Wert vorsichtig auf 10,5 und fügen Sie Reinstwasser auf ein Endvolumen von 10 ml hinzu. Verwenden Sie einen sterilen Filter (0,22 m) und aliquotieren Sie die Lösung in 2 ml Reaktionsröhren.
- Bereiten Sie 1 M IPTG-Lagerlösung in Reinstwasser und 20% Arabinose-Stammlösung in Reinstwasser vor.
- Wenn OD600 0.5–0.8 erreicht ist, fügen Sie der Ausdruckskultur pAzF zu einer endgültigen Konzentration von 2 mM hinzu. Inkubationskultur für 10 min, 37 °C, 200 Rpm, um die Aufnahme von pAzF zu ermöglichen.
- Induzieren der Expression von Zielprotein und Expression der notwendigen tRNA/t-RNA-Synthetase durch gleichzeitige Zugabe von IPTG (1 mM) und Arabinose (2%) und reduzieren die Inkubationstemperatur auf 20 °C.
- Expression bei 20 °C für ca. 20 h bei 200 Umdrehungen pro Minute zulassen. Ernteausdruckskultur durch Zentrifugation bei 4 °C, 4000 x g, 40 min.
- Zelllyse und Proteinreinigung
- Das E. coli Pellet im Lysepuffer (10 ml pro Liter Kultur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M Harnstoff, 0,25% Triton X-100) mit Lysozym (0,1 mg/ml) und PMSF (0,1 mM) wieder aufsetzen. 30 min auf Eis brüten und frieren und danach zweimal auftauen, indem sie die Probe in flüssigen Stickstoff tauchen.
- Beschallen Sie die Suspension (30%, 15 mal, 30 s: 10 s Bruch) und löschen Sie das Lysat über Zentrifugation (4 °C, 10.000 x g für 40 min).
- Proteinmittel mit Affinitätschromatographie (z. B. auf einer 1 ml Nickelsäule mit einem FPLC-System, das mit einem Fraktionskollektor verbunden ist; siehe Tabelle der Materialien). Das Protein mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M Harnstoff, 250–500 mM Imidazol) aufbewahren und bis zur WeiterenVerarbeitung bei 4 °C lagern.
- Analysieren Sie die Reinigungseffizienz über SDS-PAGE.
3. Farbmodifikation von ELPs über SPAAC
- Grob schätzen Die Konzentration der ELP-Lösung. Eine280-Absorption zur Konzentrationsbewertung ist nicht wertvoll, da die pAzF-R40F20-Sequenz keine Aminosäuren enthält, die im UV-Bereich absorbieren. Daher kann ein zuvor lyophilisiertes und gewichtetes ELP-Amphiphil als Referenz für den SDS PAGE-Bandvergleich verwendet werden. Durch den Vergleich der summierten Grauwert-Intesität von SDS PAGE-Bändern aus ELP-Lösungen mit bekannten Konzentrationen und Ihrer Probe kann die raue Konzentration Ihrer Probe geschätzt werden.
- Fügen Sie 1 l Fluoreszenzfarbstoff BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM Stofflösung; 20 M Endkonzentration) bis zu 500 l ELP-Lösung (ca. 20 m) hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion für ca. 10 h bei 15 °C, während schüttelnd und vor Licht geschützt.
- Für die weitere Verwendung, Dialyse die Reaktion, um übermäßige BDP zu entfernen.
- Equilibrate eine Dialysemembran (z.B. 12 kDa Cutoff) in Reinstwasser für 10 min. Schneiden Sie die Dialysemembran in die richtige Größe, um auf die Öffnung eines Reaktionsrohrs mit der angeklickten ELP-Lösung gelegt zu werden. Um die Dialysemembran in der Öffnung zu fixieren, legen Sie einen Reaktionsrohrdeckel mit ausgestanztem Kern auf die Öffnung und schließen Sie so das Rohr.
- Legen Sie das Reaktionsrohr kopfüber in den gewählten Puffer. Tauschen Sie den Puffer (2–5 L) zweimal nach der Dialyse für mindestens 3 h jedes Mal. Entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen der Dialysemembran und dem Puffer gefangen sind, um eine erfolgreiche Dialyse zu gewährleisten.
4. THF-Schwellungsprotokoll
- Dialyse homogene ELP-Lösung gegen Phosphat- oder Trispuffer (10 mM) mit stabilem pH 7,5, um Salze und Restverbindungen aus der Markierungsreinigung zu entfernen.
- Bereiten Sie den Lyophilisator vor und kühlen Sie ihn auf Starttemperatur ab, um die Trocknung zu frieren.
- Aliquot die dialysierte Proteinlösung in 1,5 ml Reaktionsröhrchen (50–500 l pro Röhre) und Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff. Um unerwünschtes Mischen verschiedener Proteinlösungen während der Gefriertrocknung zu vermeiden, können Kappen mit einem kleinen Loch auf das Reaktionsrohr gelegt werden, um es teilweise zu versiegeln.
- Nehmen Sie die gefrorenen Proteinproben aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in den Lyophilisator, um mit der Gefriertrocknung zu beginnen. Die Gefriertrocknung ist beendet, wenn die Probe vollständig trocken ist (ca. 24–48 h). Anschließend lyophilisierte amphiphilisierte ELPs mit trockenem N2belüften und dann sofort die Reaktionsrohrdeckel schließen, um den Kontakt mit Luftfeuchte zu vermeiden.
- Fügen Sie den lyophilisierten Proben (ELP, 5–10 m) reines THF hinzu und legen Sie die Lösung 15 min in einen Wasserbadbeschalltoner, der Eiswasser enthält, um eine Schwellung des ELP in THF zu ermöglichen.
- Thermocycler zur Vesikelbildung auf 30–60 °C oder bis 90 °C zur Faserbildung vorheizen und neue Reaktionsrohre mit Reinstwasser oder Puffer vorbereiten (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Sphärische Coacervate setzen sich überwiegend bei 20 °C innerhalb von pH 9–13 zusammen. Die Vesikelbildung wird bei 50–60 °C zwischen pH 7 und 9 bevorzugt. Die Faserbildung wird überwiegend über 60 °C zwischen pH 5 und 12 induziert.
- Legen Sie nach dem Beschallungsschritt die ELP/THF-Lösung sowie die vorbereitete Reinstwasser- oder Pufferlösung in den Thermocycler und erhitzen Sie sich 5 min auf die gewünschte Temperatur. Wenn die Temperatur erreicht ist, sollte die vorgewärmte ELP/THF-Lösung sorgfältig auf dem vorgewärmten Reinstwasser oder der Pufferlösung geschichtet werden. Eine klare Trennung der beiden Phasen mit einer deutlichen Schnittstelle sollte sichtbar sein.
- Legen Sie die Mischung wieder in den Thermocycler und inkubieren Sie für 20 min, um eine Vesikel- oder Faserbildung an der Schnittstelle zu ermöglichen. Anschließend lassen Sie die Proben vor der Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Dialyse auf Raumtemperatur abkühlen.
- Dialyselösung mit den supramolekularen Strukturen gegen Reinstwasser oder Puffer (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7–10).
5. BuOH Extrusionsprotokoll
- Bereiten Sie eine ELP-Lösung von 1–50 M in Reinstwasser oder Puffer (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, kann bis zu 4 M Harnstoff enthalten) vor. Die Konzentration der amphiphilen ELP F20R20-mEGFP- und F20R20-mCherry-Lösung kann anhand der Molaussterbekoeffizienten (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 und F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) bestimmt werden (siehe Zusatzinformationen für eine Sequenza).
- Fügen Sie 10%–20% (v/v) 1-Butanol hinzu und mischen Sie die Lösung sofort, indem Sie sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder durch eine Spritze ziehen. Es kann eine gemeinsame 100-L-Pipette oder eine Hamilton-Spritze mit einer 0,25 x 25 mm Nadel aufgebracht werden. Die Trübung der Lösung während des Mischens sollte zunehmen, was auf die Vesikelbildung hindeutet. 1-Oktanol 5%–15% (v/v) kann auch für die Vesikelextrusion anstelle von 1-Butanol verwendet werden.
- Um eine schmale Größenverteilung zu erreichen, extrudieren Sie Vesikel mit einem Miniextruder durch eine Membran mit einer Porengröße von 1 m bei Raumtemperatur. Die für die Extrusion verwendete Membrangröße bestimmt den Cutoff der Vesikel in der oberen Größe.
- Dialyse die Vesikel wie oben beschrieben (Schritt 3.3), um Rest 1-Butanol zu entfernen.
6. Farbverkapselung mit dem BuOH Extrusionsprotokoll
- Mischen Sie ca. 40 l ELP-Lösung in 10 mM Tris-HCl, pH 8 mit 1 l Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml Endkonzentration).
- Fügen Sie der Lösung 10 l BuOH hinzu und extrudieren Sie 5 bis 10 Mal durch eine Spritze, die mit einer 0,25 x 25 mm Nadel ausgestattet ist.
7. Analyse supramolekularer Strukturen mittels Fluoreszenzmikroskopie
- Legen Sie einen Verstärkungsring auf eine Glasrutsche und drücken Sie die Klebeseite fest auf das Glas.
- Fügen Sie 5 l der Probe auf die Innenseite des Bewehrungsrings und legen Sie einen Deckelschlupf oben.
- Versiegeln Sie die Probe mit Nagellack an den Rändern des Deckelschlupfs, um eine Verdunstung der Probe während der Analyse zu vermeiden.
- Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie wie zuvor beschrieben8.
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Representative Results
Protokollentwicklung für die Vesikelproduktion
Abbildung 1 zeigt die beiden verschiedenen Vesikelvorbereitungsmethoden. Die THF-Schwellungsmethode auf der linken Seite besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten und führt je nach Temperatur zu unterschiedlichen supramolekularen Baugruppen des ELP. In Abbildung 1A zeigen Epifluoreszenzmikroskopiebilder Vesikel, die aus BDP-R20F20 zusammengesetzt sind, und fibrilläre Strukturen, die aus BDP-R40F20 zusammengesetzt sind. Die auf der rechten Seite dargestellte BuOH-Methode führt ausschließlich zur Bildung von ELP-Vesikeln, was etwa zwei Größenordnungen mehr Vesikel im Vergleich zur THF-Schwellungsmethode ergibt. Die schematische Abbildung zeigt den Vorbereitungsprozess von BuOH-Vesikeln. Zur Vesikelzubereitung in Abbildung 1B bDP-R40F20 wurde mit 10-15% (v/v) BuOH gemischt und Vesikel wurden über Extrusion des Gemischs hergestellt.
Supramolekulare Selbstmontage in verschiedene Strukturen
Abbildung 2 zeigt eine schematische Illustration und Epifluoreszenzbilder verschiedener supramolekularer Strukturen, die aus BDP-R40F20 über das THF-Schwellungsprotokoll zusammengesetzt wurden. In diesem Fall wurde lyophilisiertes BDP-R40F20 für die verschiedenen Baugruppenprotokolle verwendet. Der pH-Wert des Puffers und die Temperatur des Montageprozesses wurden so eingestellt, dass sie entweder Koacervate, Fibrillen oder Vesikel bilden. Die in Abbildung 2 Figure 2A abgebildeten Coacervate haben einen Durchmesser von 1 –2 m und wurden aus BDP-R40F20 bei 20 °C und pH 13 zusammengesetzt. Die Einstellung der Montagetemperatur auf 90 °C führt zur Bildung von Nanofaserbündeln (Abbildung 2B) bei pH 4–13, getestet mit BDP-R40F20. Stabile Vesikel konnten aus dem ELP bei einer Temperatur von 50 °C und pH 7(Abbildung 2C) zusammengesetzt werden. Kleine Fehler bei einem der entscheidenden Schritte im Montageprotokoll können zur Bildung von Aggregaten führen, die in Abbildung 2Ddargestellt sind.
Verkapselung verschiedener Ladungen
Abbildung 3 zeigt die Verkapselung verschiedener Ladungen in das Vesikellumen von Vesikeln, die aus F20R20-mEGFP über das BuOH-Extrusionsverfahren zusammengesetzt werden. Für die Verkapselung des positiv geladenen Farbstoffs Atto Rho13 in Abbildung 3Awurde der Farbstoff mit der wässrigen ELP-Lösung vor Zugabe von (15% v/v) BuOH und Spritzenextrusion des Gemisches vermischt. Die konfokalen Mikroskopiebilder zeigen die aus F20R20-mEG-mEG im grünen Kanal gebildeten Vesikel, den roten Farbstoff AttoRho13 im roten Kanal und den daraus resultierenden zusammengeführten Kanal die erfolgreiche Verkapselung im Vesikellumen.
Das Polysaccharid Dextran Red 3000 wurde mit dem oben beschriebenen BuOH-Extrusionsverfahren erfolgreich gekapselt. Im grünen Kanal aufgenommene Bilder zeigen die aus F20R20-mEGFP gebildeten Vesikel, während roter Kanal die Polysaccharidladung zeigt. Das zusammengeführte grüne und rote Bild in Abbildung 3B bestätigt die erfolgreiche Dextran Red 3000 Verkapselung in das Vesikellumen.
Membrankomponentenkompatibilität und Phasentrennung von gemischten BuOH-Vesikeln vor/nach der Extrusion
Abbildung 4 zeigt das Phasentrennungs- und Fusionsverhalten von ELP-Amphiphilen beim Mischen einzelner PMBC-Bausteine im Vergleich zu zusammengesetzten PMBC-Populationen. Das Mischen von amphiphilen ELP-Bausteinen (F20R20-mEGFP und F20R20-mCherry) vor der PMBC-Montage führt zu homogen verteilten Molekülen innerhalb der montierten PMBC-Membran. Die homogene Verteilung der Fluorophore und der zugehörigen ELP-Amphiphilen zeigt sich bei der Verschmelzung des roten und grünen Kanals der jeweiligen Fluoreszenzbilder. Durch das Mischen von Vesikelpopulationen, die aus F20R20-mEGFP oder F20R20-mCherry zusammengesetzt werden, sind deutlich sichtbare Membranflecken roter oder grüner Fluoreszenz unmittelbar nach dem Mischen sichtbar. Dies deutet darauf hin, dass PMBC-Fusionsereignisse unterschiedlich gekennzeichneter PMBCs auftreten und dass diese verschmelzenden Membranen und ihre Bestandteile mindestens 20 min lang phasengetrennt bleiben. Ein ähnliches Phasenverhalten ist von Lipidflößen innerhalb der Lipidmembranen23bekannt.
Abbildung 1: Abbildung der THF-Schwellungsmethode und der BuOH-Extrusionsmethode zur geführten Selbstmontage von amphiphilen ELPs in supramolekulare Strukturen wie Vesikel oder Fasern. Schematische Arbeitsabläufe und repräsentative Epifluoreszenzbilder von (A) der THF-Schwellungsmethode mit BDP-R20F20 und BDP-R40F20, die je nach Temperatur und pH zu unterschiedlichen supramolekularen Strukturen führen und (B) die BuOH-Extrusionsmethode ausschließlich Vesikel aus BDP-R40F20 (Skala bar 2 m) ergeben. Diese Zahl wurde von Schreiber et al. 20198geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Durch Anwendung der THF-Schwellungsmethode BDP-R40F20 wird selbst in verschiedene supramolekulare Strukturen umgewandelt. Die während des Montageprotokolls angewandten Umgebungsbedingungen (z.B. Temperatur oder pH) bestimmen die vorherrschende supramolekulare Struktur, die gebildet wird. Repräsentative supramolekulare Strukturen unter den jeweiligen Bedingungen während der Montage wurden mittels Epifluoreszenzmikroskopie überwacht und reichen von (A) Koacervaten und (B) Fibrillen bis (C) stabilen Vesikeln. (D) Ein Versagen bei der Montage definierter Strukturen während des THF-Schwellungsprotokolls führt zur Bildung unspezifischer Aggregate (Skala bar 2 m). Diese Zahl wurde von8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mit der BuOH-Extrusionsmethode können verschiedene Ladungen in ELP-Vesikeln gekapselt werden. (A) zeigt repräsentative konfokale Bilder von F20R20-mEGFP-Vesikeln mit gekapseltem positiv geladenem Farbstoff AttoRho13 und (B) der Verkapselung des Polysaccharid-Dextranrot (Skalenbalken 5 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Membrankomponentenkompatibilität und Fusionsverhalten von Vesikelmembranen, die aus F20R20 über das BuOH-Extrusionsverfahren zusammengesetzt werden. (A) Das Mischen von fluoreszierenden F20R20-mEGFP- und F20R20-mCherry-Proteinlösungen vor der Spritzenextrusion führt zu PMBC-Membranen mit homogen verteilten amphiphilen Proteinen, die im grünen Kanal (linkes Bild), im roten Kanal (mittleres Bild) und im zusammengeführten Kanal (rechtes Bild) sichtbar sind. (B) PMBCs, die entweder aus F20R20-mEGFP oder F20R20-mCherry zusammengesetzt und anschließend über Spritzenextrusion gemischt werden, führen zu getrennten ELP-Amphiphilen-Pflastern innerhalb der PMBC-Membranen. Die getrennten ELP-Amphiphilen innerhalb der Membran sind nach der PMBC-Fusion für mindestens 20 minuten im grünen Kanal (linkes Bild), roter Kanal (mittleres Bild) und dem zusammengeführten Kanal (rechtes Bild) sichtbar. Die Skalenstäbe entsprechen 5 m. Diese Zahl wurde von Schreiber et al. 20198geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein Fehler bei der Befolgung der beschriebenen Protokolle für die Montage definierter supramolekularer Strukturen führt hauptsächlich zur Bildung unspezifischer Aggregate(Abbildung 2, IV) oder zu homogen verteilten ELP-Amphiphilen. Kritische Schritte des Protokolls werden im Folgenden erläutert:
Für eine hohe Expressionsausbeute des amphiphilen ELP ist eine relativ niedrige Temperatur von 20°C optimal. Für eine erfolgreiche Affinitäts-basierte Reinigung des amphiphilen ELP wurde eine Harnstoffkonzentration von 4 M im Lysepuffer nachgewiesen, um das amphiphile ELP am besten zu löslich zu machen und den Proteinertrag in der löslichen Elutionsfraktion zu erhöhen. Wenn niedrigere Harnstoffkonzentrationen im Lysepuffer gewünscht werden, muss die Affinitätsreinigung auf die einzelnen Konstrukte getestet werden. 2 M Harnstoff funktionierte auch für einige Konstrukte, vor allem für diejenigen, wo das His-Tag mit der hydrophilen Domäne verschmolzen wurde und daher immer noch in der Lage war, das Harz zu binden. Ein zusätzlicher Reinigungsschritt nach der Reinigung seines Tags über die Größenausschlusschromatographie kann auch die Vesikelausbeute erhöhen.
Im Falle der Anwendung des THF-Schwellungsprotokolls muss das amphiphile ELP zur Visualisierung mit einem fluoreszierenden organischen Farbstoff gekennzeichnet werden. Wichtig für die BDP-Kennzeichnung des amphiphilen ELP (siehe Zusatzinformationen zu Aminosäuresequenzen, die UAA pAzF enthalten) über SPAAC ist das Fehlen von Reduktionsmitteln wie TCEP, DTT oder Mercaptoethanol in allen Reinigungspuffern. Dies ist notwendig, um die gut gemeldete Azid zu AminReduktion von pAzF vor der SPAAC-Reaktion zu vermeiden24.
Die genaue Reaktionsstoichiometrie von Farbstoff auf amphiphiles ELP (z.B. pAzF-R40F20) ist nicht entscheidend, da es nicht notwendig ist, jedes einzelne ELP-Molekül für eine einfache Vesikelvisualisierung mittels Epifluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen. Daher ist die Korrelation eines Referenz-SDS-Gelbandes und der entsprechenden gewichteten lyophilisierten Probe nur einmal für jedes Proteinkonstrukt erforderlich. Wenn jedoch eine Etikettierausbeute von fast 100 % gewünscht wird, reicht ein Verhältnis von 1:1 Äquivalenten zu ELP-Molekülen aus. Sehr ähnliche amphiphile ELPs wurden in unserem Labor analysiert, um vollständig mit einer äquimolaren Zugabe von BDP gekennzeichnet zu werden (Daten noch nicht veröffentlicht).
Bei der Vesikelpräparation mit der THF-Schwellungsmethode sind die kritischsten Schritte die Schwellung des lyophilisierten amphiphilen ELP und die anschließende Schichtung dieser Lösung zusätzlich zur wässrigen Pufferphase. Daher sollte das frisch lyophilisierte amphiphile ELP so wasserfrei wie möglich sein, was durch Belüftung des Lyophilisators mit trockenem Stickstoffgas und sofortiges Schließen der Reaktionsrohrdeckel erreicht werden kann. Falls verfügbar, sollte Septum versiegeltes trockenes THF verwendet werden, um den Vesikelertrag zu erhöhen, aber THF p.a. (>99,5%) ohne Septum funktioniert auch. Der Schichtungsschritt nach Schwellung des amphiphilen ELP in trockenem THF sollte sehr sorgfältig ausgeführt werden. Eine erfolgreiche Schichtung der beiden temperaturgeregelten Lösungen führt zu einer deutlich sichtbaren Phasengrenze zwischen organischer und wässriger Phase. Der erste Schichtungsschritt sollte langsam durchgeführt werden, auch wenn erhöhte Temperaturen zu einer thermisch induzierten Vermischung dieser Phasen führen. Die entstehende Trübung der Lösung ist auf die leichte Streuung von geformten Vesikeln, Fasern oder Koacervaten zurückzuführen. In Kontrollproben ohne Protein tritt keine Trübung auf, obwohl für die THF-Wasserschnittstelle25kleinformatige Strukturen (bis zu 200 nm) gemeldet werden. Der THF-Schichtungsschritt ist der kritischste und fehleranfälligste Schritt des Quellprotokolls. Nach dem Inkubationsschritt können die supramolekularen Strukturen gegen Puffer- oder Reinstwasser dialysiert werden. Bevorzugt sollte die gleiche wässrige Lösung verwendet werden, die für die Erstmontage angewendet wurde, um die Osmolarität zu erhalten und Schwellungen oder Schrumpfungen der montierten Vesikel zu verhindern. Nach der Dialyse sind die Vesikel, Fasern und Koacervate in der Regel mindestens eine Woche stabil. Je nach den Umgebungsparametern während der Montage ist oft ein kleiner Teil anderer supramolekularer Strukturen neben der Hauptstruktur vorhanden, wenn die THF-Schwellungsmethode angewendet wird8. Die beschriebene THF-Methode erhöht die Ausbeute der Vesikelbaugruppen um eine Größenordnung, während die BuOH-Extrusion die Ausbeute um drei Größenordnungen im Vergleich zu unserer zuvor veröffentlichten In-vitro-Methode5verbessert.
Das BuOH-Extrusionsverfahren wird angewendet, um ausschließlich stabile vesikuläre Strukturen mit hoher Reproduzierbarkeit zu erhalten, die Fasern und sphärische Coacervate umgehen. Diese Methode ist weniger fehleranfällig und kompatibel mit fluoreszierenden Proteinen. Daher können F20R20-mEGFP oder F20R20-mCherry sowie BDP-R40F20 oder BDP-E20F20 eingesetzt werden. Der einzige kritische Schritt ist die schnelle Durchmischung der wässrigen Proteinlösung nach Zugabe von 10%–20% v/v BuOH. Die F20R20-mEGFP- oder F20R20-mCherry-Konzentration sollte etwa 1–15 m betragen. Durch Anwendung der BuOH-Extrusionsmethode können Vesikel in Reinstwasser oder Puffer mit bis zu 5 M NaCl oder 4 M Harnstoff und pH-Wert von 5 bis 8 montiert werden. Extrudierte PMBCs in 20% v/v BuOH können mindestens 6 Monate bei 4°C gelagert werden, wobei ihre vesikuläre Struktur erhalten bleibt. Um die Vesikelgrößenverteilung zu verengen, können sie mit einem Miniextruder durch eine Membran von 0,2-1 m Porengröße extrudiert werden. Diese Porenextrusion kann direkt nach BuOH-Zugabe zum amphiphilen ELP oder nach der Vesikelmontage erfolgen. Wenn PMBCs für die Bildgebung zu konzentriert sind, können montierte Vesikel in BuOH durch schnelles Mischen mit wässrigem Puffer verdünnt werden, der 10%–20% v/v BuOH enthält.
Die Hauptbeschränkung der BuOH-Extrusionsmethode besteht darin, dass die PMBC-Dialyse gegen wässrige Puffer oft zu einer schlechten Vesikelausbeute führt. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von RestbuOH im Membranraum nicht ausgeschlossen werden, da einfache Fettsäuren in die PMBC-Membran21einfließen konnten. Daher können PMBC-Membranen bis zu einem gewissen Grad aus Protein- und Alkanol-Moieties bestehen.
Die Verkapselung chemisch vielfältiger Frachtmoleküle funktioniert am besten mit der BuOH-Extrusionsmethode. Darüber hinaus erhöht DMSO als Lösungsmittel für die Zuerfassen des Farbstoffs die Färbeeffizienz. Für empfindliche Ladung, die gekapselt werden soll, können 5%–10% v/v 1-Octanol für die PMBC-Montage verwendet werden und haben sich im Vergleich zu BuOH als besser kompatibel mit funktionellen gekapselten Enzymen wie DNA-Ligase oder TEV-Protease21,26erwiesen. Aufgrund der kürzeren Kettenlänge von n-Butanol kann es jedoch gegen wässrigen Puffer im Gegensatz zu 1-Oktanol dialyziert werden, das die aufgebrachte Dialysemembran nicht durchdringen kann. Eine weitere Methodenbeschränkung besteht darin, dass die angewendeten Temperaturen und pH-Werte, die zur Kontrolle der gewünschten Suprastrukturbildung erforderlich sind, die Enzymaktivität beeinflussen können. In zukünftigen Arbeiten sollte die Affinitätsreinigung oder Größenausschlussreinigung eingerichtet werden, um nicht verkapselte versus verkapselte Moleküle zu trennen, ohne die Integrität der Vesikelmembran zu verschlechtern.
Im Gegensatz zu den Filmrehydratationsmethoden16,17 ermöglichen die hier beschriebenen Protokolle die Montage von Vesikelgrößen größer als 600 nm. Dies ermöglicht die Überwachung von Echtzeit-Fusionsereignissen durch einfache Epifluoreszenzmikroskopie und die Beobachtung der Membranphasentrennung8. Im Vergleich zur temperaturgesteuerten vesikulären Montage von amphiphilem ELP9 ergeben die hier beschriebenen Protokolle PMBC mit einer Langenzeitstabilität von bis zu 6 Monaten. Der Hauptnachteil ist jedoch die Notwendigkeit von organischem Lösungsmittel für die Strukturbildung. Obwohl BuOH die Integrität und Funktion von fluoreszierenden Proteinen27 vollständig bewahrt (Daten nicht dargestellt), kann die Aktivität von verkapselten Enzymen durch organisches Restlösungsmittel eingeschränkt werden und muss einzeln getestet werden. Katalytische Reaktionen mit DNA-Ligse, TEV-Protease und Lipase wurden jedoch erfolgreich im Luminalraum der Vesikel durchgeführt, montiert durch 1-Oktanol oder BuOH Extrusion26,21. Darüber hinaus, obwohl THF-Dialyse nach der Montage ist sehr unproblematisch und Vesikel Integrität bleibt erhalten, die BuOH Entfernung führt häufig zum Verlust der Vesikelintegrität aus unbekannten Gründen.
Die beschriebenen Protokolle ermöglichen es Forschern, supramolekulare Strukturen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, guten Verkapselungseigenschaften und langer Stabilität zu montieren. Diese supramolekularen Strukturen können für die Gestaltung von Minimalzellen26 oder künstliche Zellforschung21, Enzymverkapselung oder Arzneimittelformulierung angewendet werden. Die vorgestellten funktionellen PMBCs sind weitere vielversprechende Kandidaten für die Medikamentenabgabe, da ihre Bausteine nicht immunogensind 28, dynamisches Fusionsverhalten aufweisen und eine vielfältige Ladungsverkapselung ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem BMBF für die finanzielle Unterstützung und dem Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) für die Bereitstellung der Forschungseinrichtung. Wir danken P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornien, USA für die Bereitstellung des Plasmids pEVOL-pAzF. Wir danken den Mitarbeitern des Life Imaging Center (LIC) im Zentrum für Biologische Systemanalyse (ZBSA) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und die hervorragende Unterstützung bei der Bildaufnahme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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