Summary
有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。
Abstract
テーラードプロフェナスビルディングブロックは、最小細胞、薬物送達車、酵素足場などの上分子構造の組み立てのための汎用性の高い候補です。遺伝子レベルでの生体適合性とタンナビリティにより、エラスチン様タンパク質(ELP)は、バイオテクノロジーおよびバイオメディカルアプリケーションに理想的なビルディングブロックです。それにもかかわらず、異なる物理化学的特性と良好なカプセル化の可能性を有するタンパク質ベースの上分子構造の組み立ては依然として困難である。
ここでは、球状コアセルベート、繊維、安定した小胞などの上分子タンパク質アーキテクチャへの両親媒性ELPの誘導自己集合のための2つの効率的なプロトコルを提供します。提示されたアセンブリプロトコルは適応可能な物理化学的特性を有するELPに基づいてタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBCs)を生成する。PMBCは、相分離挙動を実証し、方法依存性膜融合を明らかにし、化学的に多様な蛍光カルゴ分子をカプセル化することができます。得られたPMBCは、薬剤製剤および送達プラットフォーム、人工細胞、および区画化反応空間として高い応用可能性を有する。
Introduction
バイオテクノロジーアプリケーションのための上分子構造の組み立ては、1、2、3、4、52,3,4,5ますます重要になってきています。コアセルベート、小胞、所望の物理化学的特性を有する繊維などの機能アーキテクチャの組み立てには、成分の物理化学的および立体構造特性を理解し、制御することが重要です。自然界に見られる分子の分子精度により、上分子構造のビルディングブロックは、脂質、核酸、タンパク質に基づいています。合成ポリマーと比較して、タンパク質性ビルディングブロックは、遺伝的レベルでの創発的な超分子構造6を正確に制御することを可能にする。個々のタンパク質構築ブロックの一次アミノ酸(aa)配列は、分子から巨視的レベルまでの組み立てポテンシャルの情報、ならびに最終的な上層分子構造7の3次元形状および物性に関する情報を本質的にコードする。
異なる上分子構造の組み立てのための報告された方法は、多くの場合、温度感受性エラスチン様タンパク質(ELP)などの両親媒性タンパク質を含む5,8,9、組換えオレオジン10人工タンパク質両親媒性体11.温度トリガ方法は、ミセルの組み立てにつながっています4,10,12繊維13シート14と小胞9,15,16.有機溶媒を含む方法は、動的タンパク質ベースの小胞の形成に適用されている8,11,14.これまでのところ、小胞形成のための適用されたプロトコルは、多くの場合、マイクロメーターサイズのアセンブリに対するアセンブリ制御を欠く16,17またはアセンブリの収量が限られている5.さらに、報告されたELPベースの小胞の中には、カプセル化の可能性が損なわれている12または時間の経過に応じ安定性が制限される9.これらの欠点に対処するために、提示されたプロトコルは、異なる物理化学的特性、良好なカプセル化電位および長期安定性を有するマイクロメータおよびサブマイクロメータサイズの超分子構造の自己集合を可能にする。合わせた両親媒性ELPは、球状のコアセルベートや高度に順序付けられたねじれた繊維束から、適用されたプロトコルおよび関連する環境条件に応じてユニラメラ小胞まで、幅広い範囲に及ぶ上層分子構造に組み立てられます。大型のベシキュラータンパク質膜ベースコンパートメント(PMBC)は、リポソームに類似した膜融合および相分離挙動などの主要な表現型をすべて明らかにします。PMBCは、化学的に多様な蛍光カルゴ分子を効率的にカプセル化し、単純な蛍光顕微鏡で監視することができます。この研究で使用される反復ELPドメインは、タンパク質ベースの上分子アーキテクチャの魅力的なビルディングブロックです18.ELPペンタペプチド反復ユニット(VPGVG)は、その構造的および機能的特性を維持しながら、4番目の位置(valine,V)でプロリン以外の異なるaaを許容することが知られている19.独特の親水性および疎水性ドメインを含む両親媒性ELPの設計は、明確な疎水性、極性、および電荷を伴うVPGXG反復にaaゲスト残基(X)を挿入することによって実現された20.疎水性フェニルアラニン(F)またはイソロイシン(I)を備えた両親媒性ELPドメインは、一方で、親水性ドメインにはゲスト残基としてグルタミン酸(E)またはアルギニン(R)を含んでいた。適格な両親媒性ELP構造および対応するaa配列のリストは、補足情報および参照に記載されています。8,21.蛍光顕微鏡による可視化用に、小さな蛍光色素または蛍光タンパク質のいずれかを装備したすべてのビルディングブロック。mEGFPと他の蛍光タンパク質を、ELP両親媒性の親水性ドメインにN末端に融合した。有機色素は、非天然アミノ酸(UAA)を同時導入したアルキン-アジドシクロ付加(SPAAC)を促進した銅フリー株を介して共役した。UAAの共同翻訳の組み込みpara-アジドフェニルアラニン (pAzF)22親水性ELPドメインのN末端修飾を可能にする。このように緑色蛍光色素BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP)または、シクロオクティンが緊張した任意の小さな蛍光分子を蛍光プローブとして使用することができます。UAA pAzFの組み込みとSPAAC経由の色素のサイクロ付加は、対応するトリプティックペプチドの効率的なイオン化により、LC-MS/MSを介して容易に確認することができます8.蛍光タンパク質はほとんどの有機溶媒と相容れないため、この小さな有機色素は、組立プロトコルの溶媒選択を広げるために適用されました。当社の研究室で開発された上分子構造の2つの最も効率的な組立プロトコルを以下に説明します。THFの膨潤法は有機染料修飾された両親媒性ELPとのみ適合する。これに対して、1-ブスタノール(BuOH)押出方法は、例えばmEGFPのような蛍光プローブとして多くのタンパク質と互換性があるが、記載された方法はこれらの融合タンパク質の蛍光を完全に保存するからである。さらに、BuOH押出法を採用することで、小分子および小分子のカプセル化と小胞融合挙動が最適です。
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Protocol
1. 両親媒性エラスチン様タンパク質(Elps)の設計とクローニング
- 他の場所で説明されているように、コンストラクトをクローン化して設計 8,20.プラスミドはリクエストに応じてご利用いただけます。
2. タンパク質発現、精製および調製
- F20E20-mEGFPおよびF20E20-mCherryの発現
- 一晩前培養から0.3のOD600に主発現培養を接種する。37°Cでインキュベート、200rpmの無菌400mL LB培地に2Lフラスコに適当な抗生物質を添加した。
- 超純水の発現培養を誘導するためにIPTGストック溶液(1M)を調製する。
- OD600 0.5~0.8に達したら、IPTGを発現培養物に加えて、最終濃度の1mMにし、インキュベーション温度を20°Cに下げます。200rpmで約20時間、20°Cで発現を可能にする。
- UAA pAzFを含有する両親媒性ELPの発現
- 2つのプラスミドpEVOL pAzFおよび例えばpET28-NMBL-(TAG)-R40F20-hisを0.3のOD600に含む一晩の大腸菌前培養からの接種主発現培養(アミノ酸配列の補足情報を参照)。37°Cでインキュベート、200rpmの無菌400mL LB培地でカナマイシンとクロラムフェニコールを2Lフラスコに添加した。
- 超純水で100 mM pAzFストック溶液を準備します。pAzFストック溶液の10 mLの場合、206.2 mgのpAzFの重量を量り、8 mLの超純水で再懸濁します。pAzFを溶解させて3M NaOHで溶液のpHを上げ、激しく混合する。pAzFが溶解したら、pHを10.5に慎重に下げ、超純水を10mLの最終体積に加えます。滅菌フィルター(0.22 μm)を使用し、2 mL反応チューブ内の溶液をアリコートします。
- 1 M IPTGストック溶液を超純水で、20%アラビノースストック溶液を超純水で調製します。
- OD600 0.5~0.8 に達したら、式の培養に pAzF を加え、最終的な濃度 2 mM にします。10分間の培養、37°C、200rpmの培養を行い、pAzFの取り込みが可能です。
- IPTG(1 mM)とアラビノース(2%)の同時添加により、標的タンパク質の発現と必要なtRNA/t-RNA合成酵素の発現を誘導するインキュベーション温度を20°Cに下げる。
- 200rpmで約20時間、20°Cで発現を可能にする。4°Cでの遠心分離による収穫発現培養、4000xg、40分。 g
- 細胞のリシスとタンパク質精製
- リソザイム(0.1 mg/mL)およびPMSF(0.1 mM)を含むライシスバッファー(1リットル当たり10mL;50mTris-HCl pH 8、500 mM NaCl、4 M尿素、0.25%トリトンX-100)中の大腸菌ペレットを再懸濁させる。氷上で30分間インキュベートし、液体窒素にサンプルを浸して凍結し、その後2回解凍します。
- 懸濁液を超音波処理(30%、15回、30 s:10 sブレーク)、遠心分離(4°C、40分間10,000 x g)を介してリセートをクリアします。
- アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製する(例えば、分画コレクタに接続されたFPLCシステムを使用して1mLニッケルカラム上で、材料表を参照)。溶出バッファー (50 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、4 M 尿素、250~500 mM イミダゾール) で溶出バッファーを溶出し、さらに処理するまで 4 °C で保存します。
- SDS-PAGEを介して精製効率を分析します。
3. SPAAC経由のELPsの色素改変
- ELP溶液の濃度を大まかに推定します。 pAzF-R40F20配列は、UV範囲で吸収するアミノ酸を欠いているので、濃度評価のための280吸収は有用ではない。従って、以前に凍結乾燥し、加重されたELP両親媒性は、SDS PAGEバンド比較のための基準として使用することができる。ELP溶液からのSDS PAGEバンドの合計グレー値のインテライトと既知の濃度とサンプルの推定値を比較することで、サンプルの大まかな濃度を推定することができます。
- 蛍光色素BDP-FL-PEG4-DBCO(10 mMストック溶液、最終濃度20μM)を1μL、ELP溶液500μL(〜20μM)に添加します。15°Cで約10時間、振りながら、光から保護しながら、反応をインキュベートします。
- さらなる使用のために、過剰なBDPを除去する反応を透析する。
- 透析膜(例えば12kDaカットオフ)を超純水で10分間平衡化し、透析膜を正しいサイズに切り取り、クリックしたELP溶液を含む反応管の開口部の上に置きます。開口部に透析膜を固定するには、開口部にコアをパンチアウトした反応管蓋を置き、チューブを閉じます。
- 選択したバッファーに反応管を逆さまに置きます。透析後にバッファ(2~5 L)を少なくとも3時間交換します。透析膜とバッファーの間に閉じ込められた気泡を取り除き、透析を成功させるために。
4. THF膨潤プロトコル
- 安定したpH 7.5を用いたリン酸塩またはトリスバッファー(10 mM)に対する透析均質ELP溶液は、タグ精製から塩および残りの化合物を除去する。
- 凍結乾燥機を準備し、凍結乾燥のために開始温度まで冷却します。
- アリコート 1.5 mL反応管(1管あたり50〜500 μL)の透析タンパク質溶液と液体窒素中のショックフリーズ。凍結乾燥中に異なるタンパク質溶液の望ましくない混合を避けるために、小さな穴を持つキャップを反応管の上に置いて部分的に密封することができます。
- 凍結したタンパク質サンプルを液体窒素から取り出し、すぐに凍結乾燥を開始するために凍結乾燥剤に入れます。凍結乾燥は、サンプルが完全に乾燥した状態(約24〜48時間)で終了します。続いて、乾燥N2で凍結乾燥した両親媒性ELPを換気し、空気水分との接触を避けるために反応管蓋を直ちに閉じる。
- 純粋なTHFを凍結乾燥したサンプル(ELP、5〜10 μM)に加え、THFのELPの腫脹を可能にするために、氷水を含む水浴超音波処理器に溶液を15分間入れます。
- 熱サイクルをベシクル形成のために30〜60°Cに予熱し、繊維形成のために90°Cまで予熱し、超純水または緩衝液(50 mM NaH2PO 4 /Na2HPO4、50mM NaCl、pH 5-13)を含む新しい反応管を準備する。4球状のコアセルベートは、pH 9-13内で主に20°Cで組み立てられます。ベシクル形成は、pH 7と9の間の50〜60°Cで好ましい。繊維形成は、pH5と12の間で60°C以上に誘導される。
- 超音波処理ステップの後、ELP /THF溶液と準備された超純水または緩衝液をサーモサイクラーに入れ、5分間所望の温度まで加熱します。温度に達すると、予熱されたELP /THF溶液は、予熱された超純水または緩衝液の上に慎重に階層化する必要があります。2 つのフェーズを明確に分離して、個別のインターフェイスを使用する必要があります。
- 再びサーモサイクラーに混合物を入れ、20分間インキュベートして、界面で小胞または繊維形成を可能にします。その後、蛍光顕微鏡または透析を介して分析する前に、サンプルを室温まで10分間冷却します。
- 超純水または緩衝液に対する超分子構造を含む透析液(50 mM NaH2PO4/Na2HPO4、50mM NaCl、pH 7-10)。
5. BuOH 押出プロトコル
- 1~50 μM ELP溶液を超純水またはバッファー(50 mM PB pH 7.5、100 mM NaCl、最大4M尿素を含む場合があります)を調製してください。両親媒性ELP F20R20-mEGFPおよびF20R20-mCherry溶液の濃度は、モル絶滅係数(F20R20-mEGFP A280=22015 M-1cm-1およびF20R20-mCherryA280 = 34380M-cm-1の情報を参照)を使用して決定することができる。 -1
- 10%~20%(v/v)1-ブタノールを加え、上下にピペットを作ったり、シリンジを複数回引き上げたりして、すぐに溶液を混ぜます。0.25 x 25 mmの針を装備した一般的な100 μLピペットまたはハミルトンの注射器を適用することができます。混合中の溶液の濁度が増加するはずであり、小胞形成を示す。1-オクタノール 5%~15%(v/v)は、1-ブサノールの代わりに小胞押出にも使用できます。
- 狭いサイズの分布を達成するために、室温で1μmの細孔サイズの膜を通してミニ押出機を使用してベシクルを押し出す。押出に使用される膜サイズは、小胞の上部のサイズカットオフを決定します。
- 上記のように小胞を透析(ステップ3.3)し、残留1-ブタノールを除去する。
6. BuOH 押出プロトコルによる色素のカプセル化
- 約 40 μL の ELP 溶液を 10 mM Tris-HCl に混合し、pH 8 に 1 μL デキストラン テキサス レッド (0.0025 mg/mL 最終濃度) を混ぜます。
- 溶液にBuOHの10 μLを加え、0.25 x 25 mmの針を装備した注射器を通して5~10回押し出します。
7. 蛍光顕微鏡による超分子構造解析
- ガラススライドに補強リングを置き、接着面をしっかりと押し付けます。
- 補強リングの内側にサンプル5μLを加え、カバースリップを上に置きます。
- 分析中にサンプルの蒸発を避けるために、カバースリップの端にマニキュアでサンプルを密封します。
- 前述の8のように蛍光顕微鏡を実施する。
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Representative Results
小胞生産のためのプロトコル開発
図 1は、2 つの異なる小胞調製方法の概要を示しています。左側のTHF膨潤法は3つの連続したステップで構成され、温度に応じてELPの異なる上分子集合体を生じる。図1Aの蛍光顕微鏡画像はBDP-R20F20から組み立てられた小胞およびBDP-R40F20から組み立てられた細胞構造を示す。右側に示されるBuOH法は、排他的にELP小胞の形成につながり、THF膨潤法と比較して約2桁多くの小胞を生じる。概略図は、BuOH 小胞の調製プロセスを示しています。図1Bのベシクル調製については、BDP-R40F20を10-15%(v/v)BuOHとベシクルと混合し、混合物の押出を介して調製した。
上分子自己集合を異なる構造に導く
図2は、THF膨潤プロトコルを介してBDP-R40F20から組み立てられた異なる上分子構造の模式的な図および蛍光画像を示す。この場合、凍結乾燥したBDP-R40F20は、異なる組立プロトコルに使用された。バッファーのpHおよび組立プロセスの温度は、コアセルベート、線維または小胞のいずれかを形成するように調整した。図2Aに示すコアセルベートは直径1~2μmで、BDP-R40F20から20°C、pH13で組み立てられています。アセンブリ温度を90°Cに調整すると、BDP-R40F20でテストしたpH 4–13でナノファイバーバンドル(図2B)が形成されました。安定した小胞は、50°CおよびpH7の温度でELPから組み立てることができる(図2C)。アセンブリプロトコルの重要なステップの1つで小さな間違いは、図2Dに示す凝集体の形成につながる可能性があります。
異なる貨物のカプセル化
図3は、BuOH押出方法を介してF20R20-mEGFPから組み立てられた小胞の小胞内腔への異なる貨物のカプセル化を示す。図3AAの正に帯電した色素Atto Rho13の封入のために、色素を(15%v/v)BuOHおよびシリンジ押出の混合物の添加前に水性ELP溶液と混合した。コンフォーカル顕微鏡画像は、緑色のチャネルでF20R20-mEGFPから形成された小胞、赤色チャネルの赤い色素AttoRho13、および結果として得られたマージされたチャネルが小胞内のカプセル化に成功したことを示しています。
多糖デキストランレッド3000は、上述したようにBuOH押出方法を用いて正常に封入した。緑色のチャンネルで記録された画像は、F20R20-mEGFPから形成された小胞を示し、赤色チャネルは多糖類の貨物を示しています。図3Bの緑色と赤の画像を合成すると、小胞腔へのデキストランレッド3000のカプセル化が成功したことを確認しました。
押出前/押出後の混合BuOH小胞の膜成分の適合性と相分離
図4は、組み立てられたPMBC集団との単一PMBCビルディングブロックの混合時のELP両親媒性体の相分離および融合挙動を示す。PMBC アセンブリーの前に両親媒性 ELP ビルディングブロック (F20R20-mEGFP および F20R20-mCherry) を混合すると、組み立てられた PMBC 膜内で均質に分散した分子が生じる。蛍光体と関連ELP両親媒群の均質な分布は、それぞれの蛍光画像の赤と緑のチャネルをマージすると明らかである。F20R20-mEGFPまたはF20R20-mCherryから組み立てられた小胞集団を混合することによって、赤または緑色の蛍光の明確に目に見える膜パッチが混合直後に明らかである。これは、異なる標識されたPMBCのPMBC融合事象が発生し、これらの融合膜とその構成成分が少なくとも20分間分離された位相にとどまることを示している。脂質ラフトからも同様の相挙動が知られているが、脂質膜23内に含まれる。
図1:両親媒性ELPの導出自己集合性を小胞や繊維などの上分子構造に誘導するためのTHF膨潤法及びBuOH押出方法の図。BDP-R20F20およびBDP-R40F20を用いたTHF膨潤法(A)の模式的ワークフローおよび代表的な蛍光画像は、温度およびpHに応じて異なる上分子構造をもたらし、(B)BDP-R40F20(スケールバー2μm)から排他的に小胞を得るBuOH押出方法。Bこの図はシュライバーらから変更されました 20198.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:THF膨潤法BDP-R40F20を自己集合化することにより、異なる上分子構造に。組立プロトコル(温度やpHなど)の間に適用される環境条件は、形成される優勢な上分子構造を決定します。組立中のそれぞれの条件における代表的な超分子構造を、(A)コアセルベートおよび(B)線維から(C)安定小胞まで、精巣鏡顕微鏡を介して監視した。(D) THF膨潤プロトコル中に定義された構造のアセンブリで障害が発生すると、非特異的な凝集体(スケールバー2 μm)の形成につながります。この図は8から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3 BuOH押出方法を使用して、異なる貨物をELP小胞内にカプセル化することができます。(A)は、A20R20-mEGFP小胞の代表的な共焦点像を、封入された正に帯電した色素AttoRho13と(B)多糖デキストランレッド(スケールバー5μm)のカプセル化を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4 BuOH押出法を介してF20R20から組み立てられた小胞膜の膜成分の適合性および融合挙動。(A)蛍光F20R20-mEGFPとF20R20-mCherryタンパク質溶液をシリンジ押出前に混合すると、緑色チャネルで見える均質に分散した両親媒性タンパク質(左画像)、赤チャネル(中間画像)、および結合チャネル(右画像)を有するPMBC膜を導く。(B)PMBCはF20R20-mEGFPまたはF20R20-mCherryから組み立てられ、その後シリンジ押出を介して混合され、PMBC膜内の分離されたELP両親媒性パッチにつながる。B膜内の分離されたELP両親媒性体は、グリーンチャンネル(左画像)、赤色チャネル(中央画像)、および結合されたチャネル(右画像)において少なくとも20分間のPMBC融合後に見える。スケールバーは5μmに相当します。この図はシュライバーらから変更されました 20198.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
定義された上層分子構造の組み立てに関する記載されたプロトコルに従う間の障害は、主に非特異的な凝集体(図2、IV)の形成または均質に分散したELP-両親球体のいずれかにつながる。プロトコルの重要な手順について、以下で説明します。
両親媒性ELPの発現量が高い場合は、20°Cの比較的低温が最適です。両親媒性ELPの親和性に基づく精製に成功するために、溶血性ELPを最も可溶化し、可溶性溶出画分でタンパク質収率を増加させることが証明された。もし、ライシスバッファー内の尿素濃度が低い場合、アフィニティー精製は個々の構成物についてテストされなければならない。2 M尿素は、特にHisタグが親水性ドメインに融合し、樹脂を結合することができるもののために、いくつかの構成体のために同様に働いた。 サイズ排除クロマトグラフィーによるHisタグ精製後の追加の精製ステップは、ベシクル収率を増加させることができます。
THF膨潤プロトコルを適用する場合、両親媒性ELPは、可視化のために蛍光有機色素で標識する必要があります。SPAACを介して両親媒性ELPのBDP標識(UAA pAzFを含むアミノ酸配列の補足情報を参照)は、TCEP、DTTまたはβ-メルカプトエタノールなどの任意の還元剤が全ての精製バッファーに存在しない点である。これは、SPAAC反応24の前にpAzFのアミン還元に良好に報告されたアジドを避けるために必要である。
両親媒性ELP(例えばpAzF-R40F20)に対する色素の正確な反応ストイキオメトリーは、上流蛍光顕微鏡を介して単純な小胞の視覚化のためにすべてのELP分子にラベルを付ける必要がないため、重要ではありません。したがって、参照SDSゲルバンドと対応する加重凍結乾燥サンプルの相関は、タンパク質構築物ごとに1回のみ必要である。しかしながら、100%標識収率に近い場合には、ELP分子に対する1:1当量の色素の比率が十分である。非常によく似た両親媒性EELPは、BDPの等値添加で完全にラベル付けされるように私たちの研究室で分析されました(まだ公開されていないデータ)。
THFの膨潤法を用いた小胞調製法の場合、最も重要なステップは、凍結乾燥された両親媒性ELPの腫脹およびその後の水性緩衝相の上にこの溶液の階層化である。したがって、新たに凍結した両親媒性ELPは、乾燥窒素ガス による凍結乾燥機の換気および反応管蓋の即時閉鎖によって達成することができる、可能な限り無水であるべきである。可能な場合、中隔密閉乾燥THFは小胞収量を増加させるために使用する必要がありますが、THF p.a.(>99.5%)中隔なしも同様に動作します。乾燥THFで両親媒性ELPを膨潤させる際の層化ステップは非常に慎重に実行されるべきである。2つの温度管理されたソリューションの成層化が成功すると、有機相と水相の間に明確に目に見える位相境界が導きます。最初の階層化ステップは、温度が上昇するとこれらの相の熱誘発混合につながるにもかかわらず、ゆっくりと行われるべきである。溶液の創発的な濁度は、形成された小胞、繊維またはコアセルベートの光散乱によるものである。タンパク質を欠いた対照サンプルでは、THF水界面25について小さな構造(最大200nm)が報告されているが濁りは現ない。THF階層化ステップは、膨潤プロトコルの最も重大で障害が起こりやすいステップです。インキュベーションステップの後、超分子構造は、緩衝液または超純水に対して透析することができる。より優先的には、浸透圧を維持し、組み立てられた小胞の腫れや縮小を防ぐために、初期のアセンブリに適用された同じ水溶液を使用する必要があります。透析後、小胞、繊維およびコアセルベートは通常少なくとも1週間安定である。組立時の環境パラメータに応じて、THF膨潤法が適用される場合には主構造以外の他の上分子構造のごく一部が存在することが多い。記載されたTHF法は、小胞アセンブリの収量を1桁増加させる一方、BuOH押出しは、以前に発表されたインビトロ法5と比較して3桁の歩留まりを改善する。
BuOH押出方法は、高い再現性、繊維および球状のコアセルベートを回避する排他的に安定した小胞構造を得るために適用される。この方法は、エラーが発生しやすく、蛍光タンパク質と互換性があります。従ってF20R20-mEGFPまたはF20R20-mCherryはBDP-R40F20またはBDP-E20F20と同様に適用することができる。唯一の重要なステップは、10%〜20%v/v BuOHを添加した後の水性タンパク質溶液の迅速な混合です。F20R20-mEGFPまたはF20R20-mCherry濃度は1~15μM程度である必要があります。BuOH押出方法を適用することにより、ベシクルは5 M NaClまたは4 M尿素およびpHを5〜8の範囲に含む超純水または緩衝液で組み立てることができます。20%v BuOHの押出されたPMBCは、そのベシクル構造を維持しながら、4°Cで少なくとも6ヶ月間保存することができます。小胞サイズの分布を狭くするために、0.2〜1 μmの細孔サイズの膜を通してミニ押出機を使用して押し出すことができます。この孔押出は、両親媒性ELPにBuOHを添加した直後またはベシクルアセンブリの後に行うことができます。PMBCがイメージングのために集中し過ぎる場合、BuOH中の組み立てベシクルは、10%〜20%v BuOHを含む水性バッファーを使用して急速混合して希釈することができます。
BuOH押出方法の主な制限は、水性緩衝液に対するPMBC透析がしばしば小胞収率の悪さをもたらすということです。また、単純な脂肪酸がPMBC膜21に組み込むことができたため、膜空間内に残留BuOHの存在を排除することはできない。したがって、PMBC膜はある程度タンパク質及びアルカノール部分から構成され得る。
化学的に多様な貨物分子のカプセル化は、BuOH押出法を使用して最も効果的です。また、捕捉される染料のストック溶液用溶剤としてのDMSOは、色素封入効率を高める。繊細な貨物をカプセル化するために、5%-10%v/v 1-オクタノールはPMBCアセンブリに使用することができ、DNAリガーゼまたはTEVプロテアーゼ21、26,26などの機能カプセル化酵素とBuOHと比較すると、より良好な互換性があることが証明されています。しかし、n-ブタノールの鎖長が短いため、適用された透析膜に浸透することができない1-オクタノールとは対照的に、水性緩衝液に対して透析することができる。別の方法の制限は、所望の組織形成を制御するために必要な適用温度およびpH値が酵素活性に影響を与える可能性があることである。今後の研究では、親和性精製またはサイズ排除精製を確立し、小胞膜の完全性を悪化させることなく非カプセル化分子とカプセル化分子を分離する必要があります。
フィルムリハイドレーション方法16とは対照的に、本明細書に記載されたプロトコルは、600nmを超える小胞サイズのアセンブリを可能にする。これにより、単純な蛍光顕微鏡観察と膜相分離8の観察を通じてリアルタイム融合事象をモニタリングすることができる。両親媒性ELP9の温度誘発性の小胞集合と比較して、ここで説明するプロトコルは、最大6ヶ月の長時間安定性を有するPMBCを得る。しかしながら、主な欠点は、構造形成のための有機溶媒の必要性である。BuOHは蛍光タンパク質27の完全性と機能を完全に維持する(データは示さない)が、カプセル化された酵素の活性は残留有機溶媒によって制限され、個別に試験されなければならない。しかし、DNA-リガーゼ、TEV-プロテアーゼおよびリパーゼを含む触媒反応は、小胞の発光空間内で正常に行われ、1-オクタノールまたはBuOH押出26,21,21によって組み立てられる。さらに、組立後のTHF透析は非常に問題なく、小胞の完全性が保たれていますが、BuOH除去は未知の理由により小胞の完全性を失う結果が頻繁に起こります。
記載されたプロトコルにより、研究者は、異なる物理化学的特性、良好なカプセル化特性、および長時間の安定性を持つマイクロメートルおよびサブマイクロメートルサイズの超分子構造を組み立てることができます。これらの上分子構造は、最小細胞26または人工細胞研究21の設計に適用することができ、酵素カプセル化、または薬物製剤。提示された機能的PMBCは、そのビルディングブロックが免疫原性28ではなく、動的融合挙動を示し、多様な貨物カプセル化を可能にするため、薬物送達の有望な候補である。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、BMBFの財政支援と、研究施設を提供してくれた生物システム分析センター(ZBSA)に感謝する。プラスミドpEVOL-pAzFを提供してくれたP.G.シュルツ、TSRI、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカに感謝しています。アルバート・ルートヴィヒス大学フライブルク生物システム分析センター(ZBSA)のライフイメージングセンター(LIC)のスタッフの共焦点顕微鏡資源、画像記録の優れたサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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