Summary
Ved grensesnittet av organiske og vandige løsemidler samles skreddersydde amfifile elastinlignende proteiner i komplekse supramolekylære strukturer som vesikler, fibre og koacervater utløst av miljøparametere. De beskrevne monteringsprotokollene gir proteinmembranbaserte rom (PMBC-er) med justerbare egenskaper, noe som muliggjør innkapsling av ulike laster.
Abstract
Skreddersydde proteiner byggeklosser er allsidige kandidater for montering av supramolekylære strukturer som minimale celler, narkotika levering kjøretøy og enzym stillas. På grunn av deres biokompatibilitet og tunabilitet på genetisk nivå, er Elastin-lignende proteiner (ELP) ideelle byggesteiner for bioteknologiske og biomedisinske applikasjoner. Likevel er monteringen av proteinbaserte supramolekylære strukturer med distinkte fysiokjemiske egenskaper og godt innkapslingspotensial fortsatt utfordrende.
Her tilbyr vi to effektive protokoller for guidet selvmontering av amfifile ELPer til supramolekylære proteinarkitekturer som sfæriske koacervater, fibre og stabile vesikler. De presenterte monteringsprotokollene genererer proteinmembranbaserte rom (PMBC-er) basert på ELPer med tilpasningsdyktige fysikalske egenskaper. PMBC-er demonstrerer faseseparasjonsatferd og avslører metodeavhengig membranfusjon og er i stand til å innkapsle kjemisk forskjellige fluorescerende lastmolekyler. De resulterende PMBC-ene har et høyt applikasjonspotensial som legemiddelformulering og leveringsplattform, kunstig celle og kupéalisert reaksjonsrom.
Introduction
Monteringav supramolekylære strukturer for bioteknologiske applikasjoner blir stadig viktigere1,2,3,4,5. For montering av funksjonelle arkitekturer som koacervater, vesikler og fibre med ønskede fysikalske egenskaper er det viktig å forstå og kontrollere komponentenes fysikokjemiske og konformasjonsegenskaper. På grunn av molekylenes molekylære presisjon, blir byggeklosser for supramolekylære strukturer i økende grad basert på lipider, nukleinsyrer eller proteiner. Sammenlignet med syntetiske polymerer gir proteinholdige byggeklosser presis kontroll over fremvoksende supramolekylære strukturer6 på genetisk nivå. Den primære aminosyren (aa) sekvensen av de enkelte proteinbyggesteinene koder isegselv informasjonen for monteringspotensialet fra molekylært opp til makroskopisk nivå, samt den tredimensjonale formen og de fysiske egenskapene til den endelige supramolekylære strukturen7.
Rapporterte metoder for montering av forskjellige supramolekylære strukturer involverer ofte amfifile proteiner som temperaturfølsomme elastinlignende proteiner (ELP)5,8,9, rekombinant oleosin10og kunstigprotein amfifiler11. Temperatur utløste metoder har ført til montering av micelles4,10,12Fibre13Ark14og vesikler9,15,16. Metoder som involverer organiske løsemidler har blitt brukt for dannelsen av dynamiske proteinbaserte vesikler8,11,14. Så langt mangler anvendte protokoller for vesikkeldannelse ofte monteringskontroll over mikrometerstørrelsesenheter16,17eller har begrenset monteringskapasitet5. I tillegg har noen rapporterte ELP-baserte vesikler nedsatt innkapslingspotensial12eller begrenset stabilitet over tid9. Adressering disse ulempene, de presenterte protokollene muliggjør selvmontering av mikrometer og sub mikrometer størrelse supramolekylære strukturer med distinkte fysiokjemiske egenskaper, god innkapsling potensial og lang tid stabilitet. Skreddersydde amfifile ELPs monteres i supramolekylære strukturer, som spenner over rekkevidden fra sfæriske koacervater og høyt bestilte vriddfiberbunter til unilamellære vesikler avhengig av den anvendte protokollen og tilhørende miljøforhold. Store vesikulære proteinmembranbaserte rom (PMBC) avslører alle hovedfenotyper som membranfusjon og faseseparasjonsatferd analog tion til liposomer. PMBC-er kapsteler effektivt kjemisk varierte fluorescerende lastmolekyler som kan overvåkes ved hjelp av enkel epifluorescensmikroskopi. De repeterende ELP-domenene som brukes i denne studien er attraktive byggeklosser for proteinbaserte supramolekylære arkitekturer18. ELP pentapeptid repeat unit (VPGVG) er kjent for å tolerere forskjellig aa foruten prolin på fjerde posisjon (valine, V), samtidig som den beholder sine strukturelle og funksjonelle egenskaper19. Utformingen av amfifile ELPs som inneholder karakteristiske hydrofile og hydrofobe domener ble realisert ved å sette inn aa gjesterester (X) i VPGXG-repetisjonen med distinkt hydrofobiitet, polaritet og lading20. Amfifile ELP-domener som er utstyrt med hydrofobe fenylalanin (F) eller isoleucin (I) mens det hydrofile domenet inneholdt ladet glutaminsyre (E) eller arginin (R) som gjesterester. En liste over kvalifiserte amfifile ELP-konstruksjoner og tilsvarende aasekvenser finnes i tilleggsinformasjonen og referanser8,21. Alle byggeklosser der de er utstyrt enten med små fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende proteiner for visualisering via fluorescensmikroskopi. mEGFP og andre fluorescerende proteiner ble N-terminalt smeltet sammen til de hydrofile domenene til ELP-amfifile . Organiske fargestoffer ble konjugert via kobberfri stamme fremmet alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) til en co-oversettelsesintrodusert unaturlig aminosyre (UAA). Samoversettelse av UAApara-azidofenylalanin (pAzF)22tillater N-terminal modifikasjon av hydrofile ELP-domenet. På denne måten den grønne fluorescerende dye BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) eller et lite fluorescerende molekyl med anstrengt cyklosotyne kan brukes som fluorescerende sonde. Vellykket inkorporering av UAA pAzF og cycloaddition av dye via SPAAC kan enkelt bekreftes via LC-MS / MS på grunn av effektiv ionisering av tilsvarende tryptiske peptider8. Denne lille organiske egenskapen ble brukt for å utvide løsningsmiddelvalget for monteringsprotokoller, siden fluorescerende proteiner er uforenlige med de fleste organiske løsemidler. De to mest effektive monteringsprotokollene for overmolekylære strukturer utviklet i laboratoriet vårt er beskrevet nedenfor. THF hevelse metoden er bare kompatibel med organisk dye modifisert amfifile ELP. I motsetning er 1-butanol (BuOH) ekstruderingsmetoden kompatibel med mange proteiner som fluorescerende sonde, for eksempel mEGFP, siden den beskrevne metoden fullt ut bevarer fluorescensen til disse fusjonsproteinene. I tillegg fungerer innkapslingen av små molekyler og vesikulær fusjonsatferd best ved å bruke BuOH-ekstruderingsmetoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og kloning av amfifile elastinlignende proteiner (ELPer)
- Klone og designkonstruksjoner som beskrevet andre steder8,20. Plasmids er tilgjengelig etter avtale.
2. Proteinuttrykk, rensing og tilberedning
- Uttrykk for F20E20-mEGFP og F20E20-mCherry
- Inokulere hoveduttrykkskulturen fra prekultur over natten til en OD600 på 0,3. Inkuber ved 37 °C, 200 o/min i sterilt 400 ml LB medium supplert med bevilget antibiotika i en 2 L kolbe.
- Forbered IPTG lagerløsning (1 M) for induksjon av uttrykkskulturen i ultrarent vann.
- Når OD600 0,5–0,8 er nådd, legg IPTG til uttrykkskultur til en endelig konsentrasjon på 1 mM og reduser inkubasjonstemperaturen til 20 °C. Tillat uttrykk ved 20 °C i ca. 20 timer ved 200 o/min.
- Uttrykk for amfifile ELP som inneholder UAA pAzF
- Inokulere hoveduttrykkskulturen fra overnatting E. coli pre-kultur som inneholder de to plasmids pEVOL pAzF og f.eks pET28-NMBL-(TAG)R40F20-hans til en OD600 på 0,3 (se supplerende informasjon for aminosyresekvenser). Inkuber ved 37 °C, 200 o/min i sterilt 400 ml LB medium supplert med kanamycin og kloramfenin i en 2 L kolbe.
- Forbered 100 mM pAzF-lageroppløsningen i ultrarent vann. For 10 ml pAzF lageroppløsning, veie 206,2 mg pAzF og resuspendere den i 8 ml ultrarent vann. For å oppløse pAzF heve pH av løsningen med 3 M NaOH og bland kraftig. Når pAzF er oppløst, senk pH forsiktig til 10,5 og tilsett ultrarent vann til et endelig volum på 10 ml. Bruk et sterilt filter (0,22 μm) og siter oppløsningen i 2 ml reaksjonsrør.
- Forbered 1 M IPTG lagerløsning i ultrarent vann og 20% arabinose lagerløsning i ultrarent vann.
- Når OD600 0,5–0,8 er nådd, legger du pAzF til uttrykkskulturen til en endelig konsentrasjon på 2 mM. Inkuber kultur for 10 min, 37 ° C, 200 rpm for å tillate pAzF opptak.
- Indusere uttrykk for målprotein og uttrykk for nødvendig tRNA/t-RNA synthetase via samtidig tilsetning av IPTG (1 mM) og arabinose (2%) og redusere inkubasjonstemperaturen til 20 °C.
- Tillat uttrykk ved 20 °C i ca. 20 timer ved 200 o/min. Høst uttrykkkultur ved sentrifugering ved 4 °C, 4000 x g, 40 min.
- Cellelyse og proteinrensing
- Resuspender E. coli pellet i lysis buffer (10 ml per liter kultur; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) som inneholder lysozyme (0,1 mg/ml) og PMSF (0,1 mM). Inkuber i 30 minutter på is og frys og tin to ganger etterpå ved å senke prøven i flytende nitrogen.
- Sonicate suspensjonen (30%, 15 ganger, 30 s: 10 s pause) og fjerne lysatvia sentrifugering (4 °C, 10 000 x g i 40 min).
- Rense protein ved hjelp av affinitetskromatografi (f.eks. på en 1 ml nikkelkolonne ved hjelp av et FPLC-system som er koblet til en brøkdelssamler; se Materialtabellen). Elute proteinet med elutionbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250–500 mM imidazol) og oppbevares ved 4 °C til videre behandling.
- Analyser renseeffektiviteten via SDS-PAGE.
3. Dye-modifisering av ELPs via SPAAC
- Beregn omtrent konsentrasjonen av ELP-løsningen. En280 absorpsjon for konsentrasjonevaluering er ikke verdifull siden pAzF-R40F20-sekvensmangler aminosyrer som absorberer i UV-området. Derfor kan en tidligere lyofilisert og vektet ELP amfifil brukes som referanse for SDS PAGE band sammenligning. Til sammenligning av den summerte grå verdiintesiteten til SDS PAGE-bånd fra ELP-løsninger med kjente konsentrasjoner og prøven kan den grove konsentrasjonen av prøven estimeres.
- Tilsett 1 μL fluorescerende dye BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM lagerløsning; 20 μM endelig konsentrasjon) til 500 μL ELP-oppløsning (~ 20 μM). Inkuber reaksjonen i ca. 10 timer ved 15 °C, mens den rister og beskyttes mot lys.
- For videre bruk, dialyze reaksjonen for å fjerne overdreven BDP.
- Likevekten en dialysemembran (f.eks. 12 kDa cutoff) i ultrarent vann i 10 min. Skjær dialysemembranen i riktig størrelse som skal plasseres på toppen av åpningen av et reaksjonsrør som inneholder den klikkede ELP-løsningen. For å fikse dialysemembranen i åpningen, plasser et reaksjonsrørlokk med utslått kjerne på åpningen, og lukk deretter røret.
- Plasser reaksjonsrøret opp ned i den valgte bufferen. Bytt bufferen (2–5 l) to ganger etter dialyse i minst 3 timer hver gang. Fjern eventuelle luftbobler fanget mellom dialysemembranen og bufferen for å sikre vellykket dialyse.
4. THF hevelse protokoll
- Dialyze homogen ELP-løsning mot fosfat eller trisbuffer (10 mM) med stabil pH 7.5 for å fjerne salter og gjenværende forbindelser fra hans-tag rensing.
- Forbered lyofilisatoren og avkjøl til starttemperatur for frysetørking.
- Aliquot dialyzed protein oppløsning i 1,5 ml reaksjonsrør (50–500 μL per rør) og sjokk fryse i flytende nitrogen. For å unngå uønsket blanding av forskjellige proteinløsninger under frysetørking, kan caps med et lite hull settes på toppen av reaksjonsrøret for å forsegle det delvis.
- Ta de frosne proteinprøvene ut av det flytende nitrogenet og plasser dem umiddelbart i lyofilisatoren for å begynne å fryse tørking. Frysetørkingen er ferdig når prøven er helt tørr (ca. 24–48 timer). Deretter ventilerer lyofiliserte amfifile ELPer med tørr N2, og lukk deretter umiddelbart reaksjonsrørlokkene for å unngå kontakt med luftfuktighet.
- Tilsett ren THF til lyofiliserte prøver (ELP, 5–10 μM) og plasser løsningen i et vannbadsonicator som inneholder isvann i 15 min for å tillate hevelse av ELP i THF.
- Forvarm en termocycler til 30–60 °C for vesikkeldannelse eller opptil 90 °C for fiberdannelse og klargjør nye reaksjonsrør som inneholder enten ultrarent vann eller buffer (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Sfæriske koacervater monteres hovedsakelig ved 20 °C innenfor pH 9–13. Vesikkelformasjonen favoriseres ved 50–60 °C mellom pH 7 og 9. Fiberdannelse er predominent indusert over 60 °C mellom pH 5 og 12.
- Etter sonikeringstrinnet plasserer du ELP/THF-løsningen samt den tilberedte ultrarene vann- eller bufferløsningen i termocycleren og varmes opp til ønsket temperatur i 5 min. Når temperaturen er nådd, bør den forvarmede ELP/THF-oppløsningen nøye stratifiseres på toppen av den forvarmede ultrarent vann- eller bufferløsningen. En klar separasjon av de to fasene med et distinkt grensesnitt skal være synlig.
- Plasser blandingen i termocycleren igjen og inkuber i 20 minutter for å tillate vesikkel eller fiberdannelse ved grensesnittet. Etterpå, la prøvene avkjøles til romtemperatur i 10 minutter før analyse via fluorescensmikroskopi eller dialyse.
- Dialyze oppløsning som inneholder supramolekylære strukturer mot ultrarent vann eller buffer (50 mM NaH2PO4/ Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).
5. BuOH ekstrudering protokoll
- Forbered en 1–50 μM ELP-løsning i ultrarent vann eller buffer (50 mPB pH 7,5, 100 mM NaCl, kan inneholde opptil 4 M urea). Konsentrasjonen av den amfifile ELP F20R20-mEGFP- og F20R20-mCherry-løsningen kan bestemmes ved hjelp av molarutryddelseskoeffisienter (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 og F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (se tilleggsinformasjon for aasekvenser).
- Tilsett 10%–20% (v/v) 1-butanol og bland umiddelbart oppløsningen ved å pipe opp og ned eller trekke den opp gjennom en sprøyte flere ganger. En vanlig 100 μL pipette eller Hamilton sprøyte utstyrt med en 0,25 x 25 mm kanyle påføres. Turbiditeten til løsningen under blanding bør øke, noe som indikerer vesikkeldannelse. 1 oktanol 5%–15% (v/v) kan også brukes til vesikkelekstrudering i stedet for 1-butanol.
- For å oppnå en smal størrelse fordeling, ekstrude vesikler ved hjelp av en mini ekstrudere gjennom en membran med en porestørrelse på 1 μm ved romtemperatur. Membranstørrelsen som brukes til ekstrudering bestemmer den øvre størrelsen cutoff av vesikler.
- Dialyze vesikler som beskrevet ovenfor (trinn 3.3) for å fjerne gjenværende 1-butanol.
6. Dye innkapsling med BuOH ekstrudering protokollen
- Bland ca. 40 μL ELP-oppløsning i 10 mM Tris-HCl, pH 8 med 1 μL Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml endelig konsentrasjon).
- Tilsett 10 μL BuOH til oppløsningen og ekstruder 5–10 ganger gjennom en sprøyte utstyrt med en 0,25 x 25 mm kanyle.
7. Analyse av supramolekylære strukturer ved hjelp av fluorescensmikroskopi
- Plasser en forsterkningsring på et glasslysbilde og trykk fast på klebesiden til glasset.
- Tilsett 5 μL av prøven på innsiden av forsterkningsringen og plasser en dekselslip på toppen.
- Forsegle prøven med neglelakk på kantene av dekselet slip for å unngå fordampning av prøven under analyse.
- Utfør fluorescensmikroskopi som tidligere beskrevet8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollutvikling for vesikkelproduksjon
Figur 1 skisserer de to forskjellige vesikkelforberedelsesmetodene. THF hevelse metoden på venstre side består av tre påfølgende trinn og resulterer i forskjellige supramolekylære forsamlinger av ELP avhengig av temperaturen. I figur 1A epifluorescens mikroskopi bilder viser vesikler montert fra BDP-R20F20 og flimmer strukturer montert fra BDP-R40F20. BuOH-metoden, illustrert på høyre side fører utelukkende til dannelsen av ELP vesikler, noe som gir omtrent to størrelsesordener flere vesikler sammenlignet med THF hevelse metoden. Den skjematiske illustrasjonen viser forberedelsesprosessen av BuOH vesikler. For vesikkel preparat i figur 1B BDP-R40F20 ble blandet med 10-15% (v / v) BuOH og vesikler ble utarbeidet via ekstrudering av blandingen.
Guiding supramolekylær selvmontering i ulike strukturer
Figur 2 viser en skjematisk illustrasjon og epifluorescensbilder av forskjellige supramolekylære strukturer montert fra BDP-R40F20 via THF-hevelseprotokollen. I dette tilfellet ble lyofilisert BDP-R40F20 brukt til de ulike monteringsprotokollene. PH av bufferen og temperaturen i monteringsprosessen ble justert for å danne enten koacervates, fibriller eller vesikler. Koacervatene avbildet i figur 2A er 1–2 μm i diameter og ble satt sammen fra BDP-R40F20 ved 20 °C og pH 13. Justering av monteringstemperaturen til 90 °C resulterer i dannelse av nanofiberbunter (figur 2B) ved pH 4–13 testet med BDP-R40F20. Stabile vesikler kan monteres fra ELP ved en temperatur på 50 °C og pH 7 (figur 2C). Små feil ved et av de avgjørende trinnene i monteringsprotokollen kan føre til dannelse av aggregater avbildet i figur 2D.
Innkapsling av forskjellig last
Figur 3 viser innkapsling av forskjellig last i vesikkellumen av vesikler montert fra F20R20-mEGFP via BuOH ekstruderingsmetoden. For innkapsling av den positivt ladede farge Atto Rho13 i figur 3A,ble fargeblandet med den vandige ELP-oppløsningen før tilsetning av (15% v/ v) BuOH og sprøyteekstrudering av blandingen. De konfokale mikroskopibildene viser vesikler dannet fra F20R20-mEGFP i den grønne kanalen, den røde farge AttoRho13 i den røde kanalen og den resulterende sammenslåtte kanalen viser vellykket innkapsling inne i vesikkellumen.
Polysakkariden Dextran Red 3000 ble vellykket innkapslet ved hjelp av BuOH ekstruderingsmetoden som beskrevet ovenfor. Bilder tatt opp i grønn kanal viser vesiklene dannet fra F20R20-mEGFP mens rød kanal viser polysakkaridlasten. Sammenslått grønt og rødt bilde i figur 3B bekrefter den vellykkede Dextran Red 3000-innkapslingen i vesikkellumen.
Kompatibilitet med membrankomponenter og faseseparasjon av blandede BuOH vesikler før/etter ekstrudering
Figur 4 viser faseseparasjonen og fusjonsatferden til ELP amfifiler ved blanding av enkelt PMBC byggeklosser versus sammensatte PMBC populasjoner. Blanding av amfifile ELP-byggeklosser (F20R20-mEGFP og F20R20-mCherry) før PMBC-montering fører til homogent distribuerte molekyler i den monterte PMBC-membranen. Den homogene fordelingen av fluoroforene og tilhørende ELP-amfifiler er tydelig ved sammenslåing av den røde og grønne kanalen til de respektive fluorescensbildene. Ved å blande vesikkelpopulasjoner montert fra enten F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry er tydelig synlige membranflekker av rød eller grønn fluorescens umiddelbart etter blanding. Dette indikerer at PMBC fusjonshendelser av forskjellig merkede PMBC-er forekommer, og at disse fikseringsmembranene og deres bestanddeler forblir fase atskilt i minst 20 min. En lignende fase atferd er kjent fra lipid flåter, innenfor lipid membraner23.
Figur 1: Illustrasjon av THF hevelse metoden og BuOH ekstrudering metoden for guidet selvmontering av amfifile ELPs i supramolekylære strukturer som vesikler eller fibre. Skjematisk arbeidsflyt og representative epifluorescensbilder av (A) THF-hevelsemetoden med BDP-R20F20 og BDP-R40F20 som resulterer i forskjellige supramolekylære strukturer avhengig av temperatur og pH og (B) BuOH ekstruderingsmetoden utelukkende gir vesikler fra BDP-R40F20 (skala bar 2 μm). Dette tallet er endret fra Schreiber et al. 20198. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ved å bruke THF-hevelsemetoden BDP-R40F20 monteres selv i forskjellige supramolekylære strukturer. Miljøforholdene som brukes under monteringsprotokollen (f.eks. temperatur eller pH) bestemmer den dominerende supramolekylære strukturen som dannes. Representative supramolekylære strukturer under de respektive forholdene under monteringen ble overvåket via epifluorescensmikroskopi og spenner fra (A) koacervater og (B) fibriller til (C) stabile vesikler. (D) Svikt i montering av definerte strukturer under THF hevelse protokollen fører til dannelse av uspesifikke aggregater (skala bar 2 μm). Dette tallet er endret fra8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ulike laster kan innkapsles i ELP-vesikler ved hjelp av BuOH-ekstruderingsmetoden. (A) viser representative konfokale bilder av F20R20-mEGFP vesikler med innkapslet positivt ladet dye AttoRho13 og (B) innkapsling av polysakkarid dextran rød (skala bar 5 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Membrankomponentkompatibilitet og fusjonsatferd av vesikkelmembraner montert fra F20R20 via BuOH ekstruderingsmetode. (A) Blanding av fluorescerende F20R20-mEGFP og F20R20-mCherry proteinløsning før sprøyteekstrudering fører til PMBC membraner med homogent distribuerte amfifile proteiner synlig i grønn kanal (venstre bilde), rød kanal (mellombilde), og sammenslått kanal (høyre bilde). (B) PMBCer montert fra enten F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry og blandet deretter via sprøyteekstrudering føre til separerte ELP amfifile patcher i PMBC membraner. De separerte ELP-amfifile i membranen er synlige etter PMBC-fusjon i minst 20 minutter i grønn kanal (venstre bilde), rød kanal (mellombilde) og den sammenslåtte kanalen (høyre bilde). Skalastenger tilsvarer 5 μm. Dette tallet er endret fra Schreiber et al. 20198. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En feil under å følge de beskrevne protokollene for montering av definerte supramolekylære strukturer fører hovedsakelig enten til dannelse av uspesifikke aggregater (Figur 2, IV) eller homogent distribuerte ELP-amfifiler. Kritiske trinn i protokollen er omtalt nedenfor:
For høy uttrykksutbytte av amfifile ELP er en relativt lav temperatur på 20 °C optimal. For vellykket affinitetbasert rensing av amfifile ELP ble det vist seg å være en ureakonsentrasjon på 4 M i lysisbufferen for best å løse den amfifile ELP og øke proteinutbyttet i den oppløselige elutionfraksjonen. Hvis det er ønskelig med lavere ureakonsentrasjoner i lysisbufferen, må affinitetsrensing testes for de enkelte konstruksjonene. 2 M urea fungerte også for noen konstruksjoner, spesielt for de der Hans-tag ble smeltet til det hydrofile domenet og derfor fortsatt i stand til å binde harpiksen. Et ekstra rensetrinn etter hans-tag rensing via størrelse utelukkelse kromatografi kan øke vesikkel utbyttet også.
Ved bruk av THF-hevelseprotokollen må amfifile ELP merkes med et fluorescerende organisk far for visualisering. Viktigere for BDP-merking en amfifil ELP (se supplerende informasjon for aminosyresekvenser som inneholder UAA pAzF) via SPAAC, er fraværet av en redukt som TCEP, DTT eller β-merkaptoetanol i alle rensebuffere. Dette er nødvendig for å unngå den godt rapporterte aziden til aminreduksjon av pAzF før SPAAC-reaksjonen24.
Den eksakte reaksjonen stoichiometry av farge til amfifile ELP (f.eks. pAzF-R40F20) er ikke avgjørende siden det ikke er nødvendig å merke hvert eneste ELP molekyl for enkel vesikkel visualisering via epifluorescence mikroskopi. Derfor er korrelasjonen til et referanseSDS gelbånd og den tilsvarende vektede lyofiliserte prøven bare nødvendig én gang for hver proteinkonstruksjon. Men hvis nær 100% merking avkastning er ønsket et forhold på 1:1 ekvivalenter farget og ELP molekyler er tilstrekkelig. Svært lignende amfifile ELPs ble analysert i laboratoriet vårt for å være fullt merket ved et likelig tillegg av BDP (data som ennå ikke er publisert).
For vesikkelforberedelse ved bruk av THF-hevelsesmetoden er de mest kritiske trinnene hevelse av lyofilisert amfifil ELP og påfølgende stratifisering av denne løsningen på toppen av den vandige bufferfasen. Derfor bør den nyfilede amfifile ELP være så vannfri som mulig, noe som kan oppnås ved ventilasjon av lyofilisatoren med tørr nitrogengass og umiddelbar lukking av reaksjonsrørlokkene. Hvis tilgjengelig, bør septum forseglet tørr THF brukes til å øke vesikkelutbyttet, men THF p.a. (> 99,5%) uten septum fungerer også. Stratifiseringstrinnet ved hevelse amfifile ELP i tørr THF skal utføres svært nøye. Vellykket stratifisering av de to temperaturkontrollerte løsningene fører til en tydelig synlig fasegrense mellom organisk og vandig fase. Det første stratifiseringstrinnet bør utføres sakte selv om forhøyede temperaturer fører til termisk indusert blanding av disse fasene. Fremvoksende turbiditet av løsningen skyldes lys spredning av dannede vesikler, fibre eller coacervates. I kontrollprøver som mangler proteinet, vises ingen turbiditet selv om små størrelsesstrukturer (opptil 200 nm) rapporteres for THF vanngrensesnitt25. THF-stratifiseringstrinnet er det mest kritiske og feilutsatte trinnet i hevelseprotokollen. Etter inkubasjonstrinnet kan de supramolekylære strukturene diagnostiseres mot buffer eller ultrarent vann. Fortrinnsrett bør den samme vandig brukes som ble brukt til første montering for å opprettholde osmolariteten og forhindre hevelse eller krymping av de monterte vesikler. Etter dialyse er vesiklene, fibrene og koacervatene vanligvis stabile i minst en uke. Avhengig av miljøparametrene under montering ofte en liten andel av andre supramolekylære strukturer i tillegg til hovedstrukturen er til stede hvis THF hevelse metoden brukes8. Den beskrevne THF-metoden øker vesikkelmonteringsavkastningen med én størrelsesorden, mens BuOH-ekstruderingen forbedrer avkastningen med tre størrelsesordener sammenlignet med vår tidligere publiserte in vitro-metode5.
BuOH ekstruderingsmetoden brukes for å oppnå utelukkende stabile vesikulære strukturer med høy reproduserbarhet, omgåing av fibre og sfæriske koacervater. Denne metoden er mindre feilutsatt og kompatibel med fluorescerende proteiner. F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry kan derfor brukes samt BDP-R40F20 eller BDP-E20F20. Det eneste kritiske trinnet er den raske blandingen av den vandige proteinløsningen etter tilsetning på 10%–20% v/v BuOH. F20R20-mEGFP eller F20R20-mCherry konsentrasjon bør være rundt 1–15 μM. Ved å bruke BuOH ekstruderingsmetode vesikles kan monteres i ultrarent vann eller buffer som inneholder opptil 5 M NaCl eller 4 M urea og pH varierer fra 5 til 8. Ekstruderte PMBCer i 20 % v/v BuOH kan oppbevares i minst 6 måneder ved 4 °C samtidig som vesikulær struktur bevares. For å begrense vesikkelstørrelsesfordelingen, kan de ekstruders ved hjelp av en miniekstruder gjennom en membran på 0,2-1 μm porestørrelse. Denne poreekstruderingen kan gjøres rett etter BuOH tillegg til amfifile ELP eller etter vesikkelmontering. Hvis PMBC-er er for konsentrert for bildebehandling, kan monterte vesikler i BuOH fortynnes gjennom rask blanding ved hjelp av vandig buffer som inneholder 10% –20% v/v BuOH.
Den store begrensningen av BuOH ekstruderingsmetoden er at PMBC dialyse mot vandige buffere ofte resulterer i dårlig vesikkel utbytte. Videre kan tilstedeværelsen av gjenværende BuOH i membranrommet ikke utelukkes siden enkle fettsyrer var i stand til å innlemme i PMBCmembran21. Derfor kan PMBC membraner til en viss grad bestå av protein og alkanol moieties.
Innkapsling av kjemisk forskjellige lastmolekyler fungerer best ved hjelp av BuOH-ekstruderingsmetoden. Videre øker DMSO som løsningsmiddel for lageroppløsningen av dyen som skal fanges, dye innkapslingseffektiviteten. For delikat last som skal innkapsles, kan 5% –10% v/v 1-oktanol brukes til PMBC-montering og har vist seg å være bedre kompatibel, sammenlignet med BuOH, med funksjonelle innkapslede enzymer som DNA-ligase eller TEV protease21,26. Men på grunn av den kortere kjedelengden til n-butanol kan det bli dialyzed mot vandig buffer i motsetning til 1-oktanol, som ikke er i stand til å gjennomsyre den påførte dialysemembranen. En annen metodebegrensning er at de anvendte temperaturene og pH-verdiene som trengs for å kontrollere ønsket overbygningsdannelse, kan påvirke enzymaktiviteten. I fremtidig arbeid bør affinitetsrensing eller størrelsesutelukkelsesrensing etableres for å skille ikke-innkapslede versus innkapslede molekyler uten forverret vesikkelmembranintegritet.
I motsetning til filmrehydreringsmetoder16,17 heri beskrevne protokoller gjør det mulig å montering av vesikler størrelser større enn 600 nm. Dette gjør det mulig å overvåke sanntids fusjonshendelser gjennom enkel epifluorescensmikroskopi og observasjon av membranfaseseparasjon8. Sammenlignet med temperatur utløst vesikulær montering av amfifile ELP9 protokollene beskrevet her gir PMBC med en lang tid stabilitet på opptil 6 måneder. Den største ulempen er imidlertid behovet for organisk løsningsmiddel for strukturdannelse. Selv om BuOH fullt ut bevarer integriteten og funksjonen til fluorescerende proteiner27 (data som ikke er vist), kan aktiviteten til innkapslede enzymer begrenses av gjenværende organisk løsningsmiddel og må testes individuelt. Imidlertid har katalytiske reaksjoner som involverer DNA- ligase, TEV-protease og lipase blitt gjennomført i luminalrommet i vesilene, montert av 1-oktanol eller BuOH ekstrudering26,21. I tillegg, selv om THF dialyse etter montering er svært uproblematisk og vesikkel integritet er bevart, BuOH fjerning resulterer ofte i tap av vesikkel integritet på grunn av ukjente årsaker.
De beskrevne protokollene gjør det mulig for forskere å montere mikrometer og submikrometer størrelse supramolekylære strukturer med distinkte fysikokjemiske egenskaper, gode innkapslingegenskaper og lang tidsstabilitet. Disse supramolekylære strukturer kan brukes for utformingen av minimale celler26 eller kunstig celle forskning21, enzym innkapsling, eller narkotika formulering. De presenterte funksjonelle PMBCs er ytterligere lovende kandidater for narkotikalevering, siden deres byggesteiner ikke er immungene28,viser dynamisk fusjonsatferd, og tillater variert lastinnkapsling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker BMBF for økonomisk støtte og Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) for å ha gitt forskningsanlegget. Vi er takknemlige til P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, USA for å gi plasmid pEVOL-pAzF. Vi takker de ansatte i Life Imaging Center (LIC) i Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) fra Albert-Ludwigs-Universitetet Freiburg for hjelp med deres konfokale mikroskopiressurser, og utmerket støtte i bildeopptak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
